يمكن استخدام هذا البروتوكول وتطويره لتحليل كيفية تأثير الإشعاع المؤين على تجنيد خلايا الورم ، مما يؤدي إلى فهم أكبر لتكرار الإصابة بالسرطان. الأعضاء الثديية هي نماذج قوية. أنها تحاكي الأساسية في خصائص الجسم الحي، لكنها تسمح لعزل سهل من المتغيرات البيولوجية.
إن استخدام لوحات الالتصاق المنخفض ينفي تحديات تدفق العمل المرتبطة بمصفوفات البروتين. يتعرض مرضى سرطان الثدي الثلاثي السلبية لتكرار إقليمي محلي بمعدلات أعلى بعد العلاج. دراسة كيفية تأثير الإشعاع على سلوك الورم والخلايا المناعية سيؤدي إلى رؤى مهمة في آليات التكرار.
مما يدل على المجهر confocal من organoids هو خافيير غوميز ، وهو طالب دراسات عليا في مختبر سيلفرا باتيستا. ابدأ هذا الإجراء بإزالة الغدد الثديية البطنية والأربية من الفئران التي تم التضحية بها كما هو مفصل في بروتوكول النص. بعد 45 دقيقة من تشعيع العينات كما هو موضح في بروتوكول النص ، ضع الغدد الثديية في لوحة خلية معقم ة 35 ملليمترًا ودقائق مع مشرط.
المفروم مع ما يقرب من 40 السكتات الدماغية حتى يرتاح الأنسجة ويتم الحصول على القطع التي لا تزيد عن ما يقرب من ملليمتر مربع واحد في المنطقة. الآن نقل الأنسجة إلى حل الكولاجيناز في أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر. استخدام 10 ملليلتر من حل الكولاجيناز لكل ماوس.
ضع أنابيب العينة في حمام مائي لمدة 30 إلى 60 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، ودوامة لمدة خمس ثوان كل 10 دقائق. عملية الهضم كاملة عندما يكون محلول الكولاجين غائماً. تدور أسفل المحلل المهضم في 450 مرات-G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
الآن ثلاث طبقات لوحظت. ويتألف من الدهون الفائقة ، وطبقة الأوسط هو محلول مائي ، والجزء السفلي هو بيليه. بيليه يظهر الأحمر, كما هو خليط من الخلايا الظهارية, الخلايا السحيق الفردية, وخلايا الدم الحمراء.
قبل معطف جميع الماصات، نصائح الماصات، وأنابيب الطرد المركزي مع حل BSA قبل الاتصال عن طريق إضافة وإزالة حل BSA. يمكن إعادة استخدام حل BSA، على الرغم من أنه يجب أن تكون معقم-تصفية قبل كل تجربة. للحصول على استرداد إضافي، نقل المابير إلى أنبوب جديد مغلفة BSA 15 ملليلتر.
الماصات صعودا وهبوطا بقوة لتفريق طبقة الدهون. الطرد المركزي العينة في 450 مرات-G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. التعرق على المابير، وترك كمية صغيرة من وسائل الإعلام في أنبوب لتجنب التعرق بيليه الخلية.
الآن pirate طبقة مائي من الأنبوب مع بيليه الأصلي. إضافة 10 ملليلتر من DMEM/F12 إلى أنبوب مع بيليه الأصلي، ونقلها إلى أنبوب الثاني. Pipette بقوة للجمع بين وإعادة تعليق الكريات اثنين.
بعد الطرد المركزي في 450 مرات-G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، pirate عظمى وإضافة أربعة ملليلتر من DMEM/F12 إلى الأنبوب. إضافة 40 ميكرولترات من deoxyribonuclease إلى التعليق ويصافح بلطف باليد لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة ستة ملليلتر من DMEM/F12 والماصات بدقة.
بعد الطرد المركزي للأنبوب في 450 مرات-G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، يُشعّر المُنطَع إلى علامة 0.5 ملليلتر. Resuspend بيليه في 10 ملليلتر من DMEM/F12 وماصة تماما. الآن الطرد المركزي الأنبوب عن طريق النبض إلى 450 مرات-G ووقف أربع ثوان بعد الوصول إلى تلك السرعة.
كرر خطوات الغسيل ثلاث مرات أخرى لتنقية الأعضاء عن طريق التمايز الطرد المركزي. يجب أن يكون بيليه الآن لون أبيض يتكون من الأعضاء الظهارية فقط. resuspend بيليه في 10 ملليلتر من DMEM/F12.
الماصات تماما لخلق حل متجانس. نقل 50 ميكروليتر إلى طبق بيتري 30 ملليمتر وعرض تحت مجهر على النقيض من المرحلة في 20X. عد عدد الأعضاء مع عداد حصيلة.
ماصة 50 ميكرولترات من الأعضاء في كل بئر من لوحة التصاق منخفضة. إضافة 150 ميكرولترات من المتوسطة العضوية لتحقيق حجم العمل الكلي إلى 200 ميكرولترات. استبدال بعناية المتوسطة كل يومين.
الحفاظ على GFP أو D-الطماطم المسمى الخام 264.7 الضامة في وسائل الإعلام DMEM تكملها 10٪ FPS و 1٪ البنسلين-الستريبتومايسين. بذور الخلايا في وسط organoid في الكثافة المطلوبة. استخدم تباين طور الخلية الحية والتصوير الفلوري لمراقبة تسرب الضامة بمرور الوقت.
إزالة المتوسطة العضوية من الآبار عن طريق التعرق بعناية. إصلاح العينات مع 10٪ محايد-bufferin لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. غسل الأعضاء الثابتة ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في 1X PBS.
إذا رغبت في ذلك، يمكن تخزين عينات ثابتة في أربع درجات مئوية لمدة أسبوع واحد لمزيد من تلطيخ. بعد الغسيل، قم بإضفاء الطابع العضي الثابت لمدة خمس دقائق. كتلة الأعضاء الثابتة مع مصل الماعز العادي 5٪ في 0.1٪ PBST لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة قبل الغسيل ثلاث مرات لمدة خمس دقائق مع برنامج تلفزيوني.
احتضان الأعضاء الثابتة مع مضادة للcytokeratin-14، E-cadherin، أو ضيق وصلة البروتين واحد، في 1٪ NGS في PBST لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في PBST. الآن احتضان organoids مع الماعز المضادة للأرانب الثانوية مع 1٪ NGS PBST لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
تغطية مع احباط لتجنب التعرض للضوء. بعد الغسيل كما كان من قبل، استخدم الصبغة النووية صبغة نوى لمدة نصف ساعة تقريبا. اغسل العضية الملطخة لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
إذا كنت تستخدم شريحة غرفة، قم بتحميلها بقسيمة أغطية. تخزين organoids ملفوفة في احباط في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. يمكن استزراع العضيات المشعة في لوحات منخفضة التصاق، أو داخل غشاء الطابق السفلي، ولكن النمو الأكثر سرعة حدث في لوحات التصاق منخفض.
العضوية خلاصة خصائص الغدة الثديية. وقد لوحظت التشييدات التي تشبه شكلياً القنوات والفصوص. وأشارت اتجاهات النمو إلى أنه عندما تم زرع الأعضاء على الفور بعد الهضم والفرز ، نمت الأعضاء غير المشععة أسرع من organoids المشعة ، على الأرجح بسبب توقف نمو الخلايا الناتجة عن آليات إصلاح تلف الحمض النووي.
وأعرب الجهاز العضوي عن الخصائص الظهارية، التي تم تقييمها من خلال تلطيخ الفلورسنت المناعية. عبّر أعضاء مشعّ علامات ظهاريّة. Cytokeratin-14، علامة من ميوبيبيليس، وأعرب بقوة على سطح organoids المشعة.
بالإضافة إلى ذلك، E-cadherin و ضيقة تقاطع البروتين واحد تم التعبير عنها داخل تقاطعات الخلوية من organoids. هذه البروتينات ضرورية للتصاق الخلايا المناسبة. بعد التشعيع، واصلت organoids للحفاظ على خصائصها الظهارية.
يمكن تصور تلطيخ الفلورسنت من organoids داخل لوحات التصاق منخفضة باستخدام المجهر الفلوريس. ومع ذلك، تم الحصول على أوضح تصور عن طريق المجهر confocal. تم حساب كثافة الفلورساح الإجمالية المصححة عن طريق طرح الخلفية، والتطبيع حسب منطقة الجهاز.
كما أن زراعة الأعضاء في لوحات الالتصاق المنخفض 96 بئرًا قد ابسطت أيضًا تجارب الثقافة المشتركة. عندما بذرت في تركيزات نموذجية في الغدة الثديية، الضامة التكلس زيادة مع organoids المشعع. عند تنفيذ هذا الإجراء ، فإن أهم الأشياء التي يجب تذكرها هي عدم الإفراط في هضم الأعضاء ، وتنقية التمايز الطرد المركزي بشكل مناسب.
بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء تجارب إضافية المشتركة الثقافة. يمكن أن تكون organoids شارك في زراعة مع الخلايا السرطانية, الخلايا المناعية الأخرى, والخلايا القوية لإعادة البيئة microendated المشعة المرتبطة تكرار. هذه الطريقة ستكون مهمة لتقييم كيفية تلف الأنسجة الطبيعية يؤثر على وجه التحديد ديناميات الخلايا المناعية, وسوف تستخدم في نهاية المطاف لفهم آليات تجنيد الخلايا السرطانية.
وقد أوضح organoids mammary آليات تنمية الغدة الثديية، ولها خلاصة قوية سرطان الثدي في المختبر. نأمل أن نموذجنا يوفر رؤى حول تجنيد الخلايا السرطانية الناجمة عن الإشعاع.
