MG は K08DK101608 と R03DK111473 の健康の国民の協会、3 月のダイム財団助成金第 5-FY17-79、子供の発見研究所のワシントン大学、セントルイス子供病院部からの補助金によってサポートされて医学、セントルイスのワシントン大学で小児科。当行は R01DK104946 でサポートされている (PI: シルバーマン)、子供の発見研究所、ワシントン大学、セントルイス子供の病院。

本研究のすべての動物のプロシージャは、ワシントン大学セントルイス機関動物ケアし使用委員会 (20160187 プロトコル) またはピッツバーグ大学機関動物のケアおよび使用委員会 (プロトコル 14103918) どちらかによって承認されました。24 週間以内の妊娠で胎児小腸ピッツバーグ大学解剖学的組織の調達ガイドラインに従って治験審査委員会承認 (プロトコル PRO14100537) の大学から得られました。ピッツバーグ健康科学組織バンクを正直なブローカー システム。デ識別母乳または低温殺菌ドナー母乳ピッツバーグ制度検討委員会の大学からの同意の放棄が得られました。
1. 地下室の分離と新生児マウスまたは未熟児人間の小腸から Enteroids の確立
<ol><li>メディアの準備 メモ: メディアに準備するフード地下室分離前に、の日。<ol>
<li>1.11 L 文化メディアを準備します。4.5 G/L グルコースと L-グルタミン ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 1 L で始まるし、110 mL ウシ胎児血清 (FBS) (最終濃度 10%) 11 mL ペニシリン-ストレプトマイシン (最終濃度 1%) と 1.1 mL 滅菌インスリン (ファイナルを追加濃度 0.1%)。</li>
		<li>500 mL の PBS 抗生物質の混合物を準備します。10 %500 mL 1 ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) x で始まる FBS ゲンタマイシン (最終濃度 1%) 1 mL アムホテリシン B (最終濃度 0.2%) 5 mL を追加し、5 mL ペニシリン-ストレプトマイシン (最終濃度 1%)。</li>
		<li>30 mL のセル中断メディア #1 を準備します。まず 30 mL の培地を準備します。600 μ L 0.5 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を追加 (最終濃度 10 mM)、300 μ L ゲンタマイシン (最終濃度 1%) と 60 μ L アムホテリシン B (最終濃度 0.2%)。</li>
		<li>30 mL のセル中断メディア #2 を準備します。まず 30 mL の培地を準備します。300 μ L 0.5 M の EDTA を追加 (最終濃度 5 mM)、300 μ L ゲンタマイシン (最終濃度 1%) と 60 μ L アムホテリシン B (最終濃度 0.2%)。</li>
		<li>成長因子なし 50 mL 地下文化メディアを準備します。測定 33.4 mL 1 x 高度な DMEM/F-12 10 mL FBS (最終濃度 20%) を追加。<ol>
<li>500 μ l 添加ペニシリン-ストレプトマイシン (最終濃度 1%) 500 μ L-グルタミン (最終濃度 1%) 500 μ L ゲンタマイシン (最終濃度 1%)、100 μ L アムホテリシン B (最終濃度 0.2%)、2.5 μ L 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethaneスルホン酸 (HEPES) (最終濃度 0.05 mM)、500 μ L 100 mM N-アセチルシステイン (最終濃度 1 mM) 500、N-2 のサプリメント、ビタミン A は、マイナス無血清サプリメント (例えばB-27) x 1 mL 50 と 500 μ L 1 mM 100 × 100 μ L Y-27632 x。</li>
		</ol>
</li>
		<li>成長因子と 1 mL 地下文化メディアを準備します。まず 1 mL 成長因子なし地下文化メディアを準備します。2.5 μ L 40 μ g/mL Wnt3a を追加 (最終濃度 100 ng/mL)、1 μ L 100 μ g/mL 頭 (最終濃度 100 ng/mL)、2 μ L 250 μ g/ミリリットル R Spondin (最終濃度 500 ng/mL) と 0.5 μ L 100 μ g/mL EGF (最終濃度 50 ng/mL)。</li>
	</ol></li>
	<li>地下室の分離
	<ol>
<li>場所は基底膜抽出物を可溶化 (材料の表を参照してください) に開始する前に解凍の氷の上。 注: 氷に保つ基底膜を重合します。</li>
		<li>2 番目の「安楽死」の 2 つの方法で安楽死させるマウスをマウスの年齢の 14 日を超える機関動物ケアおよび使用委員会プロトコルに準拠して死を確保するため物理的なプロシージャをされています。 注: マウスの年齢の下で 14 日斬首ははさみを使用して標準的な手順です。</li>
		<li>はさみやピンセットを使用して、皮膚や腹膜、腹部の全体の長さを介して、腹部の正中線を縦切開を作る。ハサミで盲腸を胃から小腸を切除し、鉗子で腸間膜を削除します。 注: 2 週古い男性と女性 c57bl/6 j マウスの子犬、各計量 5.5 7 g、クリプト分離に使用されました。地下室の分離のため、任意の年齢やサイズのマウスを使用できます。</li>
		<li>地下室の分離の新鮮な収穫の小腸を準備をするには、ストレート、腸の位置し、はさみを使用して全体の長さに沿って縦腸をカットします。 注: マウスおよびヒトの腸、同様に準備することができます。</li>
		<li>優しく鉗子を使用して PBS 抗生物質の混合物で満たされたシャーレで来たり、腸を揺することによって腸からきれいなスツール。</li>
		<li>セル中断メディア #1 の 30 mL を 50 mL の円錐管に追加します。管に直接 0.5 cm 長さの部分に腸をカットします。氷バケットにチューブをセットし、15 分間最低速でシェーカーで振ちましょう。</li>
		<li>組織は、シェーカーにされますが、RNA、DNA または蛋白質の隔離に使用する場合は、enteroids、陰窩を成長する 24 または 48 ウェル プレートを取得します。全体に使用する場合は、enteroids、陰窩を成長する 8 よくチャンバー スライドを使用は、共焦点レーザー顕微鏡をマウントします。</li>
		<li>フードは、24 または 48 ウェル プレートの各ウェルの底に基底膜の 15 μ L を追加します。商工会議所のスライドを使用すると、各商工会議所の下に基底膜の 9 μ L を追加します。 注: 必要な場合はプレートの大きさによると基底膜のボリュームを調整します。</li>
		<li>すぐにピペットの先端と基底膜を広げ基底膜は井戸の底に薄い層を形成します。重合する基底膜を許可する 30 分のためのインキュベーターで 37 ° C でプレートを配置します。 注意: 基底膜が薄い層ではない場合、または基底膜に空気の泡が含まれている場合、陰窩は添付しません。</li>
		<li>シェーカーで 15 分後にティッシュを 100 μ m ストレーナー フィルターします。流れを破棄します。</li>
		<li>新しい 50 mL の円錐管に 30 mL のセル中断メディア #2 を追加します。ストレーナーから組織を除去し、チューブを追加します。</li>
		<li>氷バケットにチューブをセットし、15 分間最低速でシェーカーで振ちましょう。</li>
		<li>シェーカーで 15 分は、100 μ m ストレーナー フィルター組織。収量は後の手順で低い場合に、このステップで流れを保ちます。 注: チューブを介してすべてのフローは、氷の上に保たれなければなりません。</li>
		<li>4.5 G/L グルコースと L-グルタミン 15 mL DMEM を新しい 50 mL の円錐管に追加します。ストレーナーから組織を除去し、チューブを追加します。積極的に 100 μ m ストレーナー 10 s. フィルターのチューブを手で振るし、流れを収集します。この操作を繰り返して、流れに微粒子が含まれていません。</li>
		<li>フードは、マウス組織や人間の組織のための 100 μ m ストレーナー 70 μ m ストレーナーを使用して新しい 50 mL の円錐管に前の手順から流れをフィルターします。 注: スタンバイでは、余分なストレーナーを持って、ストレーナーが破片で詰まらせるとゆっくりと注ぐ。</li>
		<li>ボンネットの氷バケットに直接設置し 4 ° C で 8 分の 200 x g でチューブを遠心します。ペレットを乱すことがなく、ピペットで上澄みを削除します。希望総額成長因子地下文化メディアなしでペレットを再懸濁します。 注: 豊かな陰窩は、ペレットの '砂' 層です。250 μ L 成長因子なし地下文化メディアも必要です。</li>
	</ol></li>
	<li>Enteroids の確立
	<ol>
<li>基底膜の上に直接クリプト メディア混合物をプレートします。</li>
		<li>陰窩を分離処理が成功したことを確認するには顕微鏡で確認します。 注: セルとセルのボールが望まれます。ウェルあたり約 100 の個々 の陰窩をめっき。</li>
		<li>基底膜に付着する陰窩を許可する 3 h の 37 ° C でプレートを孵化させなさい。 注: この培養、培地下成長因子なしと。</li>
		<li>メディアと P-200 ピペットを使用してアタッチに失敗した余分な陰窩をゆっくり取り外します。 注: は、添付の陰窩が外れとなって、基底膜に不可します。</li>
		<li>ゆっくりと各ウェルにクリプト文化メディアと成長因子の 250 μ L を追加します。 注: 24-48 ウェル プレート、またはチャンバー スライド、地下文化メディアと成長因子の 250 μ L で十分です。</li>
		<li>メディアを交換、2 日ごとと新鮮な地下墓地文化メディアと成長因子治療を可能にする最適な添付ファイルと成長前 5 日間。</li>
	</ol></li>
</ol>2. マウス胸ミルク コレクション
<ol><li>その子犬搾乳前に 6 時間から産後 7 〜 12 日で c57bl/6 j 授乳中ダムを区切ります。</li>
	<li>鼻の円錐形を介してイソフルランと授乳中のダムを麻酔し、0.15 IU を/kg 体重でオキシトシンの皮下注射を管理します。搾乳のための手順を実行する前に、3 分を待ちます。</li>
	<li>プロシージャを搾乳前に 70% のエタノールで乳頭をきれいにし乾燥させ。</li>
	<li>シリコン チューブ 5 mL 採取管にマウスの乳首に合うようにサイズ電気人間の胸ポンプを使用して、一度に 1 つの乳首からミルクを抽出します。 メモ: 最適な乳房ポンプ速度と吸引用の 2 つの設定があります。それぞれの最小設定で起動し、ミルクが抽出されるまで、ゆっくりと両方を増加させることをお勧めします。理想的には、総収量になります 〜 500 μ L - マウス母乳授乳中ダムあたりの 1 mL。</li>
	<li>すぐに割り切れる母乳と-80 ° C でストア 注: フリーズ/フリーズ解除を避けるためサイクル。</li>
	<li>ML 成長因子と地下墓地文化メディアあたりマウス母乳の 50 μ L/mL の 37 ° C で 24 時間、5 日目に enteroids を扱う</li>
</ol>3. 全体 Enteroids の染色をマウントします。
<ol><li>
試薬の調製
	<ol>
<li>8 井戸あたり 16 mL の 1x PBS を準備します。</li>
		<li>8 井戸あたり 1x PBS で 2 mL 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を準備します。</li>
		<li>準備 2 mL 0.1 %8 井戸あたり 1x PBS でトリトン X-100。</li>
		<li>24 ml PBS トゥイーン (PBST は 0.1% Tween 20 1 x PBS) 8 井戸あたり。</li>
		<li>準備 2 mL 10% 通常ロバ血清 (NDS) 0.1% の pbst; (10 %nds/pbst;) 8 井戸あたり。</li>
		<li>準備 4 mL 1% 0.1% の NDS pbst; (1 %nds/pbst;) 8 井戸あたり。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 日目の染色
	<ol>
<li>治療を離れて吸い出しなさい、PBS の enteroids を洗ってください。追加の 250 μ L 4 %pfa ウェルあたり。4 ° C で 1-2 h を回転子に配置します。4% 除去ピペットと PFA。</li>
		<li>250 μ L/ウェル 1 で 4 回洗って PBS x。部屋の温度 (RT) で 10 分間の回転子に配置します。 注: 必要な場合は 4 ° C で 1-2 日のプレートを保管することが可能です。</li>
		<li>250 μ L/ウェル 0.1% トリトン X-100。ルート削除で 1 時間インキュベート 0.1% トリトン X-100 ピペットと。</li>
		<li>250 μ L/ウェル 1 で 4 回洗って PBS x。室温 15 分の回転子に配置します。</li>
		<li>250 μ L/ウェルの 10% を追加 NDS/pbst;。ルート削除で 45 分間インキュベート 10 %nds/PBST ピペットと。</li>
		<li>希薄化後 1 で 1/250 %nds/PBST 250 μ L/ウェル一次抗体を追加し、4 ° C で一晩インキュベート 注: 最適な抗体の希釈は、製造元によって異なります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2 日目の染色
	<ol>
<li>少なくとも 5 倍の 250 μ L/ウェル pbst; 4-5 h を洗います。各洗浄の 4 ° C で回転子に配置します。</li>
		<li>250 μ L/ウェル二次抗体、希薄化後の 1/1,000 の 1 %nds/pbst; を追加します。箔でプレートをラップし、4 ° C で一晩インキュベート</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3 日目の染色
	<ol>
<li>250 μ L/ウェル核染色 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) のための 15 分を追加します。 注: は、暗闇の中のプレートを保持します。</li>
		<li>6 回を 250 μ L/ウェル PBST に洗います。各洗浄の 4 ° C で 10 分間の回転子に配置します。</li>
		<li>メディアのマウントとマウント coverslip チャンバーをスライドさせます。</li>
		<li>客観的共焦点顕微鏡 X 40 で画像を撮影し、ラスター グラフィックス エディターで同じようにレンダリング (材料の表を参照してください)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Patel, R. M., Denning, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+use+of+prebiotics,+probiotics,+and+postbiotics+to+prevent+necrotizing+enterocolitis:+what+is+the+current+evidence?.">Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence?.</a> Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).</li><li>Caplan, M. S., Jilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+concepts+in+necrotizing+enterocolitis.">New concepts in necrotizing enterocolitis.</a> Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).</li><li>Henry, M. C., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+enterocolitis.">Necrotizing enterocolitis.</a> Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).</li><li>Lin, P. W., Stoll, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotising+enterocolitis.">Necrotising enterocolitis.</a> Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).</li><li>Neu, J., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Necrotizing+enterocolitis.">Necrotizing enterocolitis.</a> N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).</li><li>Bartick, M., Reinhold, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burden+of+suboptimal+breastfeeding+in+the+United+States:+a+pediatric+cost+analysis.">The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis.</a> Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).</li><li>Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+necrotizing+enterocolitis+on+length+of+stay+and+hospital+charges+in+very+low+birth+weight+infants.">Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants.</a> Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).</li><li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair.">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li><li>Gribar, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+expression+and+signaling+of+TLR4+and+TLR9+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+necrotizing+enterocolitis.">Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis.</a> J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).</li><li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amniotic+fluid+inhibits+Toll-like+receptor+4+signaling+in+the+fetal+and+neonatal+intestinal+epithelium.">Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).</li><li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+milk+protects+against+the+development+of+necrotizing+enterocolitis+through+inhibition+of+Toll-like+receptor+4+in+the+intestinal+epithelium+via+activation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).</li><li>Yazji, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+TLR4+activation+impairs+intestinal+microcirculatory+perfusion+in+necrotizing+enterocolitis+via+eNOS-NO-nitrite+signaling.">Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).</li><li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics.">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).</li><li>Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+glutamine+supplemented+parenteral+nutrition+on+the+incidence+of+necrotizing+enterocolitis,+nosocomial+sepsis+and+length+of+hospital+stay+in+very+low+birth+weight+infants.">Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants.</a> Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamine+decreases+lipopolysaccharide-induced+intestinal+inflammation+in+infant+rats.">Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).</li><li>Good, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+milk+oligosaccharide+2'-fucosyllactose+attenuates+the+severity+of+experimental+necrotising+enterocolitis+by+enhancing+mesenteric+perfusion+in+the+neonatal+intestine.">The human milk oligosaccharide 2'-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine.</a> Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).</li><li>Jantscher-Krenn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+milk+oligosaccharide+disialyllacto-N-tetraose+prevents+necrotising+enterocolitis+in+neonatal+rats.">The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats.</a> Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).</li><li>Akin, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+lactoferrin+to+prevent+nosocomial+sepsis+and+necrotizing+enterocolitis+of+premature+neonates+and+effect+on+T-regulatory+cells.">Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells.</a> Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).</li><li>Amin, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+supplementation+prevents+necrotizing+enterocolitis+in+the+premature+infant.">Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant.</a> J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).</li><li>Rodgers, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+aspects+of+milk+collection+in+the+rat.">Practical aspects of milk collection in the rat.</a> Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).</li><li>DePeters, E. J., Hovey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+collecting+milk+from+mice.">Methods for collecting milk from mice.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).</li><li>Willingham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milk+collection+methods+for+mice+and+Reeves'+muntjac+deer.">Milk collection methods for mice and Reeves' muntjac deer.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Saxena, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Intestinal+Enteroids:+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection,+Host+Restriction,+and+Pathophysiology.">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).</li><li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Enteroids/Colonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology.">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li><li>Drummond, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteroviruses+infect+human+enteroids+and+induce+antiviral+signaling+in+a+cell+lineage-specific+manner.">Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li></ol>

著者が何を開示して利害をあります。

腸上皮、腸の障壁を維持、病原体に対する防御を提供するために責任がある、いくつかの疾患の病因に破られることができる多くの細胞亜型で構成されます。動物モデルは、病気のいくつかのファセットを要約することができます中、マウスとヒトの小腸から派生した enteroids の前のヴィヴォモデルは様々 な治療法の効果をテストするためのプラットフォームを提供します。Enteroid モ?...

壊死性腸炎 (NEC) は 29 週間妊娠1,2,3の前に生まれたほぼ 10 の 1 乳児に影響を与える、未熟児における消化管疾患による死亡の主要な原因です。NEC の進行状況、生存率はわずか 10 〜 304、5、最も深刻なフォームに児の半分。アメリカ合衆国で推定 20 億米ドル/年 NEC6、7児を扱う費やされているまだ生存率も療法は過去の 30 年にわたって変わった。NEC の病因と腸管によって特徴付けられる、悪化に導くシグナリングパス粘膜治癒8,9,10,11, しかし、障害のあります。炎症反応と逆に炎症メカニズムの不完全な理解ままです。
人間の母乳の管理は、未熟児の NEC に対してのみ保護の戦略であると発見されています。我々 は以前、母乳は、上皮成長因子受容体 (EGFR) 経路11をシグナル伝達を介して腸上皮における自然免疫受容体 toll 様受容体 4 (TLR4) の阻害により NEC 開発から保護することを示しています。実験の NEC 式に母乳の補充弱毒 NEC 上皮細胞のアポトーシスの抑制・表皮の成長に依存した方法で上皮細胞増殖修復するように見られる炎症性応答因子 (EGF) と EGFR11。別の研究で硝酸、母乳の別のコンポーネント、粉ミルク、硝酸態窒素が不足するいるとで NEC の頻度の増加に貢献するかもしれないと比較して腸の血流を調節することによりその保護、自然に貢献することが示されました。式供給幼児12,13。母乳オリゴ糖、L-アルギニン、グルタミン、ラクトフェリン14,15,16,などの NEC に対する保護に関与することが示されている母乳に存在その他化合物17,18,19。母乳のこれらの有利な要素、NEC の予防での使用の必要性を明らかにするが、また経路と細胞効果母乳は NEC に対して保護を仲介する方法に関与するシグナル伝達メカニズムを調査する重要性を強調.
マウスによって電気人間の胸ポンプ11,12 を使用して麻酔下ダムから母乳を抽出できます小説、使いやすい手法を開発 NEC のマウスモデルで母乳の保護特性の研究をする順番.マウス母乳を取得この戦略は有利、ない人間の胸ポンプは、容易に利用され、母乳の調達における効率的なだけでなくこの方法で種特異的な胸ミルク解析できるため。その結果、我々 と表現された人間の母乳のマウス母乳の効果を比較することができますと同様、種特異的なモデルにおけるミルク銀行から人間のドナー ミルクを低温殺菌します。この手法は、NEC 防止に向けての貢献に関連して乳房乳成分の研究のためことができます。他の研究者は胸ミルクの抽出方法を開発している、しかし、これらのテクニックはマニュアルとは通常 1 つ以上研究室メンバー20,21,22が必要があります。ここでマウスから牛乳を収集する人間の電気胸ポンプを変更することで利用できる簡単なテクニックが表示されます。この手法は、他の種にも適用できます。
NEC に関わるシグナル伝達経路を十分に調査、モデル システムは病気プロセスに影響を受ける知られている異なった細胞のタイプをすべて評価する必要があります。ここでは、我々 は 1 つを話し合うようなモデル システム - enteroids - とマウスおよび人間の小腸からの設立。ひと腸内 enteroids (HIEs) は、消化管で行われる病態生理学的プロセスの研究を支援するための革新的な遺伝的に多様な前のヴィヴォ人体モデルを提供するので特に重要な約束を提供します。23. 幹細胞から生成される enteroids 誘導性多能性幹細胞からの文化を開発すると、人間の腸 Organoids (HIOs) とは異なり、Enteroids 長期培養されることが判明し、以降使用23、凍ることができます。分離腸陰窩の24。Enteroids 以下のメンテナンスを必要とする、することができます感染しているすぐに25日、腸陰窩より HIOs23より区別されるので簡単に設立することができます。したがって、HIEs ひと消化管上皮23の地域固有の組成と機能特性に開発できるので既存の手法に比べて多くの利点を提供しています。Enteroids の使用は地域固有の制限事項と使いやすさの遵守、腸の人体モデルが必要なとき非常に効果的な選択です。ここで主な幹細胞由来小さい腸 enteroids マウスおよび人間の未熟児からの分離との手法を示す.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin N (Insulin)</td>
			<td>Eli Lilly And Company</td>
			<td>0002-8315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x N-2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x B-27 Supplement Minus Vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>08-0085SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Wnt3a Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3474-RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030700112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030722116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030723112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>154534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;M Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;M Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope Leica TCS SP8 X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G 1.5 Inch Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxytocin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O3251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Double Electric Breast Pump</td>
			<td>Lansinoh</td>
			<td>044677530163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Stoppers</td>
			<td>Frey Scientific</td>
			<td>560761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB15580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mki67 primer F: 5&#39;-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3&#39; R: 5&#39;-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation

人間の小さい腸 enteroids 陰窩から派生するため幹細胞ニッチで栽培されたすべての上皮細胞の種類が含まれています。人間 enteroid体外培養系を確立する能力がモデル腸病態に関与する特定の細胞反応を研究することが重要。近年、マウスとヒトから enteroids が培養され、継代とバンク離れていくつかの所で将来使用するため世界中。この enteroid プラットフォームは、様々 な治療法や薬の効果と異なる種類の細胞、腸内にどのような効果を発揮テストに使用することができます。ここでは、主な幹細胞由来の小さい腸 enteroids を確立するためのプロトコルが新生児マウスから派生し、未熟児人間の腸を提供します。また、この enteroid の培養システムは、種特異的な母乳の効果をテストする利用されました。変更された人間の胸ポンプを使用して効率的に取得できますマウス母乳と発現マウスの牛乳は、さらに研究実験のため使用できます。我々 は今発現マウス、人間での効果を発揮し、新生児マウスまたは未熟児人間の小腸から派生したドナーの成長および enteroids の増殖に母乳。

我々 は人間の母乳を表現するかどうかを調べるしようと最初または低温殺菌ドナー母乳は小さい腸 enteroids に影響を与えた。確かに、人間の母乳ともらい母乳は新生児マウス (図 1 a) と未熟児人間派生 enteroids (図 1 b) の成長を増加しました。
以来、ヒトの母乳は、小さい腸 enter...

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Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

母乳 Enteroids の増殖を促進する: 細胞増殖のEx Vivoモデル

このプロトコルでは、新生児マウスまたはマウスから牛乳を収集する効率的な方法と同様、未熟児人間の腸から enteroid 培養系を確立する方法について説明します。

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

breast-milk-enhances-growth-enteroids-an-ex-vivo-model-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

19.4K ビュー.  Washington University School of Medicine. このプロトコルでは、新生児マウスまたはマウスから牛乳を収集する効率的な方法と同様、未熟児人間の腸から enteroid 培養系を確立する方法について説明します。

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In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

マウスモデルにおける乳がんの脳転移の腫瘍の低酸素動態の in vivo生物発光イメージングに

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

医学

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

競争力のあるマウス骨髄移植モデルにおけるドナー細胞の生着を​​決定するために、定量的リアルタイムPCRを用いて

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

3次元（3D）モデルを用いた乳癌細胞浸潤の定量化

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

アン<em&gt;エクスビボ</emヒト乳癌でホルモンの作用を研究するために&gt;モデル

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

生体内および生体外では腹膜脂肪にミルキースポット構造の卵巣がん転移性コロニー形成を研究するためのアプローチで

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

ex vivoでのライブ肺転移のイメージングとその微小環境

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer metastasis, is largely unknown and is a focus in cancer research. Various breast cancer spontaneous metastasis mouse models have been established. Here, we report a simplified procedure to establish orthotopic transplanted breast cancer primary tumor and resultant spontaneous metastasis that mimic human breast cancer metastasis. Combined with the bioluminescence live tumor imaging, this mouse model allows tumor growth and progression kinetics to be monitored and quantified. In this model, a low dose (1 x 104 cells) of 4T1-Luc breast cancer cells was injected into BALB/c mouse mammary fat pad using a tuberculin syringe. Mice were injected with luciferin and imaged at various time points using a bioluminescent imaging system. When the primary tumors grew to the size limit as in the IACUC-approved protocol (approximately 30 days), mice were anesthetized under constant flow of 2% isoflurane and oxygen. The tumor area was sterilized with 70% ethanol. The mouse skin around the tumor was excised to expose the tumor which was removed with a pair of sterile scissors. Removal of the primary tumor extends the survival of the 4T-1 tumor-bearing mice for one month. The mice were then repeatedly imaged for metastatic tumor spreading to distant organs. Therapeutic agents can be administered to suppress tumor metastasis at this point. This model is simple and yet sensitive in quantifying breast cancer cell growth in the primary site and progression kinetics to distant organs, and thus is an excellent model for studying breast cancer growth and progression, and for testing anti-metastasis therapeutic and immunotherapeutic agents in vivo.

An orthotopic breast cancer primary tumor model and surgical removal of primary tumor to extend mouse life to generate spontaneous metastasis are described. The tumor growth and progression are monitored and quantified by luciferase fluorescence imaging.

自発的乳がん転移の同所性マウスモデル

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

Ex Vivo常温肝灌流の小さな動物モデル

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.