Name: breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation
Uploaded: 2018-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation at JoVE.com

MG は K08DK101608 と R03DK111473 の健康の国民の協会、3 月のダイム財団助成金第 5-FY17-79、子供の発見研究所のワシントン大学、セントルイス子供病院部からの補助金によってサポートされて医学、セントルイスのワシントン大学で小児科。当行は R01DK104946 でサポートされている (PI: シルバーマン)、子供の発見研究所、ワシントン大学、セントルイス子供の病院。

本研究のすべての動物のプロシージャは、ワシントン大学セントルイス機関動物ケアし使用委員会 (20160187 プロトコル) またはピッツバーグ大学機関動物のケアおよび使用委員会 (プロトコル 14103918) どちらかによって承認されました。24 週間以内の妊娠で胎児小腸ピッツバーグ大学解剖学的組織の調達ガイドラインに従って治験審査委員会承認 (プロトコル PRO14100537) の大学から得られました。ピッツバーグ健康科学組織バンクを正直なブローカー システム。デ識別母乳または低温殺菌ドナー母乳ピッツバーグ制度検討委員会の大学からの同意の放棄が得られました。
1. 地下室の分離と新生児マウスまたは未熟児人間の小腸から Enteroids の確立
<ol><li>メディアの準備 メモ: メディアに準備するフード地下室分離前に、の日。<ol>
<li>1.11 L 文化メディアを準備します。4.5 G/L グルコースと L-グルタミン ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 1 L で始まるし、110 mL ウシ胎児血清 (FBS) (最終濃度 10%) 11 mL ペニシリン-ストレプトマイシン (最終濃度 1%) と 1.1 mL 滅菌インスリン (ファイナルを追加濃度 0.1%)。</li>
		<li>500 mL の PBS 抗生物質の混合物を準備します。10 %500 mL 1 ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) x で始まる FBS ゲンタマイシン (最終濃度 1%) 1 mL アムホテリシン B (最終濃度 0.2%) 5 mL を追加し、5 mL ペニシリン-ストレプトマイシン (最終濃度 1%)。</li>
		<li>30 mL のセル中断メディア #1 を準備します。まず 30 mL の培地を準備します。600 μ L 0.5 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を追加 (最終濃度 10 mM)、300 μ L ゲンタマイシン (最終濃度 1%) と 60 μ L アムホテリシン B (最終濃度 0.2%)。</li>
		<li>30 mL のセル中断メディア #2 を準備します。まず 30 mL の培地を準備します。300 μ L 0.5 M の EDTA を追加 (最終濃度 5 mM)、300 μ L ゲンタマイシン (最終濃度 1%) と 60 μ L アムホテリシン B (最終濃度 0.2%)。</li>
		<li>成長因子なし 50 mL 地下文化メディアを準備します。測定 33.4 mL 1 x 高度な DMEM/F-12 10 mL FBS (最終濃度 20%) を追加。<ol>
<li>500 μ l 添加ペニシリン-ストレプトマイシン (最終濃度 1%) 500 μ L-グルタミン (最終濃度 1%) 500 μ L ゲンタマイシン (最終濃度 1%)、100 μ L アムホテリシン B (最終濃度 0.2%)、2.5 μ L 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethaneスルホン酸 (HEPES) (最終濃度 0.05 mM)、500 μ L 100 mM N-アセチルシステイン (最終濃度 1 mM) 500、N-2 のサプリメント、ビタミン A は、マイナス無血清サプリメント (例えばB-27) x 1 mL 50 と 500 μ L 1 mM 100 × 100 μ L Y-27632 x。</li>
		</ol>
</li>
		<li>成長因子と 1 mL 地下文化メディアを準備します。まず 1 mL 成長因子なし地下文化メディアを準備します。2.5 μ L 40 μ g/mL Wnt3a を追加 (最終濃度 100 ng/mL)、1 μ L 100 μ g/mL 頭 (最終濃度 100 ng/mL)、2 μ L 250 μ g/ミリリットル R Spondin (最終濃度 500 ng/mL) と 0.5 μ L 100 μ g/mL EGF (最終濃度 50 ng/mL)。</li>
	</ol></li>
	<li>地下室の分離
	<ol>
<li>場所は基底膜抽出物を可溶化 (材料の表を参照してください) に開始する前に解凍の氷の上。 注: 氷に保つ基底膜を重合します。</li>
		<li>2 番目の「安楽死」の 2 つの方法で安楽死させるマウスをマウスの年齢の 14 日を超える機関動物ケアおよび使用委員会プロトコルに準拠して死を確保するため物理的なプロシージャをされています。 注: マウスの年齢の下で 14 日斬首ははさみを使用して標準的な手順です。</li>
		<li>はさみやピンセットを使用して、皮膚や腹膜、腹部の全体の長さを介して、腹部の正中線を縦切開を作る。ハサミで盲腸を胃から小腸を切除し、鉗子で腸間膜を削除します。 注: 2 週古い男性と女性 c57bl/6 j マウスの子犬、各計量 5.5 7 g、クリプト分離に使用されました。地下室の分離のため、任意の年齢やサイズのマウスを使用できます。</li>
		<li>地下室の分離の新鮮な収穫の小腸を準備をするには、ストレート、腸の位置し、はさみを使用して全体の長さに沿って縦腸をカットします。 注: マウスおよびヒトの腸、同様に準備することができます。</li>
		<li>優しく鉗子を使用して PBS 抗生物質の混合物で満たされたシャーレで来たり、腸を揺することによって腸からきれいなスツール。</li>
		<li>セル中断メディア #1 の 30 mL を 50 mL の円錐管に追加します。管に直接 0.5 cm 長さの部分に腸をカットします。氷バケットにチューブをセットし、15 分間最低速でシェーカーで振ちましょう。</li>
		<li>組織は、シェーカーにされますが、RNA、DNA または蛋白質の隔離に使用する場合は、enteroids、陰窩を成長する 24 または 48 ウェル プレートを取得します。全体に使用する場合は、enteroids、陰窩を成長する 8 よくチャンバー スライドを使用は、共焦点レーザー顕微鏡をマウントします。</li>
		<li>フードは、24 または 48 ウェル プレートの各ウェルの底に基底膜の 15 μ L を追加します。商工会議所のスライドを使用すると、各商工会議所の下に基底膜の 9 μ L を追加します。 注: 必要な場合はプレートの大きさによると基底膜のボリュームを調整します。</li>
		<li>すぐにピペットの先端と基底膜を広げ基底膜は井戸の底に薄い層を形成します。重合する基底膜を許可する 30 分のためのインキュベーターで 37 ° C でプレートを配置します。 注意: 基底膜が薄い層ではない場合、または基底膜に空気の泡が含まれている場合、陰窩は添付しません。</li>
		<li>シェーカーで 15 分後にティッシュを 100 μ m ストレーナー フィルターします。流れを破棄します。</li>
		<li>新しい 50 mL の円錐管に 30 mL のセル中断メディア #2 を追加します。ストレーナーから組織を除去し、チューブを追加します。</li>
		<li>氷バケットにチューブをセットし、15 分間最低速でシェーカーで振ちましょう。</li>
		<li>シェーカーで 15 分は、100 μ m ストレーナー フィルター組織。収量は後の手順で低い場合に、このステップで流れを保ちます。 注: チューブを介してすべてのフローは、氷の上に保たれなければなりません。</li>
		<li>4.5 G/L グルコースと L-グルタミン 15 mL DMEM を新しい 50 mL の円錐管に追加します。ストレーナーから組織を除去し、チューブを追加します。積極的に 100 μ m ストレーナー 10 s. フィルターのチューブを手で振るし、流れを収集します。この操作を繰り返して、流れに微粒子が含まれていません。</li>
		<li>フードは、マウス組織や人間の組織のための 100 μ m ストレーナー 70 μ m ストレーナーを使用して新しい 50 mL の円錐管に前の手順から流れをフィルターします。 注: スタンバイでは、余分なストレーナーを持って、ストレーナーが破片で詰まらせるとゆっくりと注ぐ。</li>
		<li>ボンネットの氷バケットに直接設置し 4 ° C で 8 分の 200 x g でチューブを遠心します。ペレットを乱すことがなく、ピペットで上澄みを削除します。希望総額成長因子地下文化メディアなしでペレットを再懸濁します。 注: 豊かな陰窩は、ペレットの '砂' 層です。250 μ L 成長因子なし地下文化メディアも必要です。</li>
	</ol></li>
	<li>Enteroids の確立
	<ol>
<li>基底膜の上に直接クリプト メディア混合物をプレートします。</li>
		<li>陰窩を分離処理が成功したことを確認するには顕微鏡で確認します。 注: セルとセルのボールが望まれます。ウェルあたり約 100 の個々 の陰窩をめっき。</li>
		<li>基底膜に付着する陰窩を許可する 3 h の 37 ° C でプレートを孵化させなさい。 注: この培養、培地下成長因子なしと。</li>
		<li>メディアと P-200 ピペットを使用してアタッチに失敗した余分な陰窩をゆっくり取り外します。 注: は、添付の陰窩が外れとなって、基底膜に不可します。</li>
		<li>ゆっくりと各ウェルにクリプト文化メディアと成長因子の 250 μ L を追加します。 注: 24-48 ウェル プレート、またはチャンバー スライド、地下文化メディアと成長因子の 250 μ L で十分です。</li>
		<li>メディアを交換、2 日ごとと新鮮な地下墓地文化メディアと成長因子治療を可能にする最適な添付ファイルと成長前 5 日間。</li>
	</ol></li>
</ol>2. マウス胸ミルク コレクション
<ol><li>その子犬搾乳前に 6 時間から産後 7 〜 12 日で c57bl/6 j 授乳中ダムを区切ります。</li>
	<li>鼻の円錐形を介してイソフルランと授乳中のダムを麻酔し、0.15 IU を/kg 体重でオキシトシンの皮下注射を管理します。搾乳のための手順を実行する前に、3 分を待ちます。</li>
	<li>プロシージャを搾乳前に 70% のエタノールで乳頭をきれいにし乾燥させ。</li>
	<li>シリコン チューブ 5 mL 採取管にマウスの乳首に合うようにサイズ電気人間の胸ポンプを使用して、一度に 1 つの乳首からミルクを抽出します。 メモ: 最適な乳房ポンプ速度と吸引用の 2 つの設定があります。それぞれの最小設定で起動し、ミルクが抽出されるまで、ゆっくりと両方を増加させることをお勧めします。理想的には、総収量になります 〜 500 μ L - マウス母乳授乳中ダムあたりの 1 mL。</li>
	<li>すぐに割り切れる母乳と-80 ° C でストア 注: フリーズ/フリーズ解除を避けるためサイクル。</li>
	<li>ML 成長因子と地下墓地文化メディアあたりマウス母乳の 50 μ L/mL の 37 ° C で 24 時間、5 日目に enteroids を扱う</li>
</ol>3. 全体 Enteroids の染色をマウントします。
<ol><li>
試薬の調製
	<ol>
<li>8 井戸あたり 16 mL の 1x PBS を準備します。</li>
		<li>8 井戸あたり 1x PBS で 2 mL 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を準備します。</li>
		<li>準備 2 mL 0.1 %8 井戸あたり 1x PBS でトリトン X-100。</li>
		<li>24 ml PBS トゥイーン (PBST は 0.1% Tween 20 1 x PBS) 8 井戸あたり。</li>
		<li>準備 2 mL 10% 通常ロバ血清 (NDS) 0.1% の pbst; (10 %nds/pbst;) 8 井戸あたり。</li>
		<li>準備 4 mL 1% 0.1% の NDS pbst; (1 %nds/pbst;) 8 井戸あたり。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 日目の染色
	<ol>
<li>治療を離れて吸い出しなさい、PBS の enteroids を洗ってください。追加の 250 μ L 4 %pfa ウェルあたり。4 ° C で 1-2 h を回転子に配置します。4% 除去ピペットと PFA。</li>
		<li>250 μ L/ウェル 1 で 4 回洗って PBS x。部屋の温度 (RT) で 10 分間の回転子に配置します。 注: 必要な場合は 4 ° C で 1-2 日のプレートを保管することが可能です。</li>
		<li>250 μ L/ウェル 0.1% トリトン X-100。ルート削除で 1 時間インキュベート 0.1% トリトン X-100 ピペットと。</li>
		<li>250 μ L/ウェル 1 で 4 回洗って PBS x。室温 15 分の回転子に配置します。</li>
		<li>250 μ L/ウェルの 10% を追加 NDS/pbst;。ルート削除で 45 分間インキュベート 10 %nds/PBST ピペットと。</li>
		<li>希薄化後 1 で 1/250 %nds/PBST 250 μ L/ウェル一次抗体を追加し、4 ° C で一晩インキュベート 注: 最適な抗体の希釈は、製造元によって異なります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2 日目の染色
	<ol>
<li>少なくとも 5 倍の 250 μ L/ウェル pbst; 4-5 h を洗います。各洗浄の 4 ° C で回転子に配置します。</li>
		<li>250 μ L/ウェル二次抗体、希薄化後の 1/1,000 の 1 %nds/pbst; を追加します。箔でプレートをラップし、4 ° C で一晩インキュベート</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3 日目の染色
	<ol>
<li>250 μ L/ウェル核染色 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) のための 15 分を追加します。 注: は、暗闇の中のプレートを保持します。</li>
		<li>6 回を 250 μ L/ウェル PBST に洗います。各洗浄の 4 ° C で 10 分間の回転子に配置します。</li>
		<li>メディアのマウントとマウント coverslip チャンバーをスライドさせます。</li>
		<li>客観的共焦点顕微鏡 X 40 で画像を撮影し、ラスター グラフィックス エディターで同じようにレンダリング (材料の表を参照してください)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Patel, R. M., Denning, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+use+of+prebiotics,+probiotics,+and+postbiotics+to+prevent+necrotizing+enterocolitis:+what+is+the+current+evidence?.">Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence?.</a> Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).</li><li>Caplan, M. S., Jilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+concepts+in+necrotizing+enterocolitis.">New concepts in necrotizing enterocolitis.</a> Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).</li><li>Henry, M. C., Moss, R. 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著者が何を開示して利害をあります。

腸上皮、腸の障壁を維持、病原体に対する防御を提供するために責任がある、いくつかの疾患の病因に破られることができる多くの細胞亜型で構成されます。動物モデルは、病気のいくつかのファセットを要約することができます中、マウスとヒトの小腸から派生した enteroids の前のヴィヴォモデルは様々 な治療法の効果をテストするためのプラットフォームを提供します。Enteroid モ?...

壊死性腸炎 (NEC) は 29 週間妊娠1,2,3の前に生まれたほぼ 10 の 1 乳児に影響を与える、未熟児における消化管疾患による死亡の主要な原因です。NEC の進行状況、生存率はわずか 10 〜 304、5、最も深刻なフォームに児の半分。アメリカ合衆国で推定 20 億米ドル/年 NEC6、7児を扱う費やされているまだ生存率も療法は過去の 30 年にわたって変わった。NEC の病因と腸管によって特徴付けられる、悪化に導くシグナリングパス粘膜治癒8,9,10,11, しかし、障害のあります。炎症反応と逆に炎症メカニズムの不完全な理解ままです。
人間の母乳の管理は、未熟児の NEC に対してのみ保護の戦略であると発見されています。我々 は以前、母乳は、上皮成長因子受容体 (EGFR) 経路11をシグナル伝達を介して腸上皮における自然免疫受容体 toll 様受容体 4 (TLR4) の阻害により NEC 開発から保護することを示しています。実験の NEC 式に母乳の補充弱毒 NEC 上皮細胞のアポトーシスの抑制・表皮の成長に依存した方法で上皮細胞増殖修復するように見られる炎症性応答因子 (EGF) と EGFR11。別の研究で硝酸、母乳の別のコンポーネント、粉ミルク、硝酸態窒素が不足するいるとで NEC の頻度の増加に貢献するかもしれないと比較して腸の血流を調節することによりその保護、自然に貢献することが示されました。式供給幼児12,13。母乳オリゴ糖、L-アルギニン、グルタミン、ラクトフェリン14,15,16,などの NEC に対する保護に関与することが示されている母乳に存在その他化合物17,18,19。母乳のこれらの有利な要素、NEC の予防での使用の必要性を明らかにするが、また経路と細胞効果母乳は NEC に対して保護を仲介する方法に関与するシグナル伝達メカニズムを調査する重要性を強調.
マウスによって電気人間の胸ポンプ11,12 を使用して麻酔下ダムから母乳を抽出できます小説、使いやすい手法を開発 NEC のマウスモデルで母乳の保護特性の研究をする順番.マウス母乳を取得この戦略は有利、ない人間の胸ポンプは、容易に利用され、母乳の調達における効率的なだけでなくこの方法で種特異的な胸ミルク解析できるため。その結果、我々 と表現された人間の母乳のマウス母乳の効果を比較することができますと同様、種特異的なモデルにおけるミルク銀行から人間のドナー ミルクを低温殺菌します。この手法は、NEC 防止に向けての貢献に関連して乳房乳成分の研究のためことができます。他の研究者は胸ミルクの抽出方法を開発している、しかし、これらのテクニックはマニュアルとは通常 1 つ以上研究室メンバー20,21,22が必要があります。ここでマウスから牛乳を収集する人間の電気胸ポンプを変更することで利用できる簡単なテクニックが表示されます。この手法は、他の種にも適用できます。
NEC に関わるシグナル伝達経路を十分に調査、モデル システムは病気プロセスに影響を受ける知られている異なった細胞のタイプをすべて評価する必要があります。ここでは、我々 は 1 つを話し合うようなモデル システム - enteroids - とマウスおよび人間の小腸からの設立。ひと腸内 enteroids (HIEs) は、消化管で行われる病態生理学的プロセスの研究を支援するための革新的な遺伝的に多様な前のヴィヴォ人体モデルを提供するので特に重要な約束を提供します。23. 幹細胞から生成される enteroids 誘導性多能性幹細胞からの文化を開発すると、人間の腸 Organoids (HIOs) とは異なり、Enteroids 長期培養されることが判明し、以降使用23、凍ることができます。分離腸陰窩の24。Enteroids 以下のメンテナンスを必要とする、することができます感染しているすぐに25日、腸陰窩より HIOs23より区別されるので簡単に設立することができます。したがって、HIEs ひと消化管上皮23の地域固有の組成と機能特性に開発できるので既存の手法に比べて多くの利点を提供しています。Enteroids の使用は地域固有の制限事項と使いやすさの遵守、腸の人体モデルが必要なとき非常に効果的な選択です。ここで主な幹細胞由来小さい腸 enteroids マウスおよび人間の未熟児からの分離との手法を示す.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humulin N (Insulin)</td><td>Eli Lilly And Company</td><td>0002-8315</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1x Advanced DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>100x N-2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>50x B-27 Supplement Minus Vitamin A</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse Wnt3a Protein</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1324-WN</td><td></td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3474-RS</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish</td><td>Eppendorf</td><td>0030700112</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Cell Culture Plate</td><td>Eppendorf</td><td>0030722116</td><td></td></tr><tr><td>48-Well Cell Culture Plate</td><td>Eppendorf</td><td>0030723112</td><td></td></tr><tr><td>8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td><td>Thermo Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Tube</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;M Sterile Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;M Sterile Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope Leica TCS SP8 X</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td><td>Adobe Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18 G 1.5 Inch Needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Oxytocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3251</td><td></td></tr><tr><td>Human Double Electric Breast Pump</td><td>Lansinoh</td><td>044677530163</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Round Bottom Test Tube</td><td>Corning</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Rubber Stoppers</td><td>Frey Scientific</td><td>560761</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 Antibody</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Human Mki67 primer F: 5&#039;-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3&#039; R: 5&#039;-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3&#039;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation

人間の小さい腸 enteroids 陰窩から派生するため幹細胞ニッチで栽培されたすべての上皮細胞の種類が含まれています。人間 enteroid体外培養系を確立する能力がモデル腸病態に関与する特定の細胞反応を研究することが重要。近年、マウスとヒトから enteroids が培養され、継代とバンク離れていくつかの所で将来使用するため世界中。この enteroid プラットフォームは、様々 な治療法や薬の効果と異なる種類の細胞、腸内にどのような効果を発揮テストに使用することができます。ここでは、主な幹細胞由来の小さい腸 enteroids を確立するためのプロトコルが新生児マウスから派生し、未熟児人間の腸を提供します。また、この enteroid の培養システムは、種特異的な母乳の効果をテストする利用されました。変更された人間の胸ポンプを使用して効率的に取得できますマウス母乳と発現マウスの牛乳は、さらに研究実験のため使用できます。我々 は今発現マウス、人間での効果を発揮し、新生児マウスまたは未熟児人間の小腸から派生したドナーの成長および enteroids の増殖に母乳。

我々 は人間の母乳を表現するかどうかを調べるしようと最初または低温殺菌ドナー母乳は小さい腸 enteroids に影響を与えた。確かに、人間の母乳ともらい母乳は新生児マウス (図 1 a) と未熟児人間派生 enteroids (図 1 b) の成長を増加しました。
以来、ヒトの母乳は、小さい腸 enter...

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Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

母乳 Enteroids の増殖を促進する: 細胞増殖のEx Vivoモデル

このプロトコルでは、新生児マウスまたはマウスから牛乳を収集する効率的な方法と同様、未熟児人間の腸から enteroid 培養系を確立する方法について説明します。

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

breast-milk-enhances-growth-enteroids-an-ex-vivo-model-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

19.4K ビュー.  Washington University School of Medicine. このプロトコルでは、新生児マウスまたはマウスから牛乳を収集する効率的な方法と同様、未熟児人間の腸から enteroid 培養系を確立する方法について説明します。

ビデオ: Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

スフェロイドにおける哺乳動物細胞の大規模拡張のための連続供給することによって栄養規制

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

生物工学

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

乳がん研究のための潜在的機能 インビトロ モデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

がん研究

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

胎児腸オルガノイドを用いたインビトロで吸引から破乳移行を再現する

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

発生生物学

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

微小トリプシン法によるモザイク乳腺オルガノイドの生成

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

全組織生検からヒト上皮EnteroidsとColonoidsの確立

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

医学

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

マウスモデルにおける乳腺の発達と機能の評価

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

生物学

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

乳腺からの照射オルガノイドの成長とキャラクタリゼーション

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue architecture. In current layer-by-layer extrusion bioprinting, individual cells are extruded in a bioink together with complex spatial and temporal cues to promote hierarchical tissue self-assembly. However, this biofabrication technique relies on complex interactions among cells, bioinks and biochemical and biophysical cues. Thus, self-assembly may take days or even weeks, may require specific bioinks, and may not always occur when there is more than one cell type involved. We therefore developed a technique to directly bioprint pre-formed 3D breast epithelial spheroids in a variety of bioinks. Bioprinted pre-formed 3D breast epithelial spheroids sustained their viability and polarized architecture after printing. We additionally printed the 3D spheroids onto vascular endothelial cell networks to create a co-culture model. Thus, the novel bioprinting technique rapidly creates a more physiologically relevant 3D human breast model at lower cost and with higher flexibility than traditional bioprinting techniques. This versatile bioprinting technique can be extrapolated to create 3D models of other tissues in additional bioinks.

The goal of this protocol is to directly bioprint breast epithelial cells as multicellular spheroids onto pre-formed endothelial networks to rapidly create 3D breast-endothelial co-culture models which can be used for drug screening studies.

内皮ネットワーク上の3D多細胞乳房スフェロイドの直接バイオプリンティング

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have recently emerged as a promising system to model gastrointestinal pathologies. However, currently utilized methods for enteroid manipulation either lack access to the apical surface of the epithelium (three-dimensional [3D]) or are time-consuming and resource-intensive (two-dimensional [2D] monolayers). These methods often require additional steps, such as microinjection, for the model to become physiologically translatable. Here, we describe a physiologically relevant and inexpensive protocol for studying NEC in vitro by reversing enteroid polarity, resulting in the apical surface facing outward (apical-out). An immunofluorescent staining protocol to examine enteroid barrier integrity and junctional protein expression following exposure to tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) or lipopolysaccharide (LPS) under normoxic or hypoxic conditions is also provided. The viability of 3D apical-out enteroids exposed to normoxic or hypoxic LPS or TNF-&#945; for 24 h is also evaluated. Enteroids exposed to either LPS or TNF-&#945;, in combination with hypoxia, exhibited disruption of epithelial architecture, a loss of adherens junction protein expression, and a reduction in cell viability. This protocol describes a new apical-out NEC-in-a-dish model which presents a physiologically relevant and cost-effective platform to identify potential epithelial targets for NEC therapies and study the preterm intestinal response to therapeutics.

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

This protocol describes an apical-out necrotizing enterocolitis (NEC)-in-a-dish model utilizing small intestinal enteroids with reversed polarity, allowing access to the apical surface. We provide an immunofluorescent staining protocol to detect NEC-related epithelial disruption and a method to determine the viability of apical-out enteroids subjected to the NEC-in-a-dish protocol.

インビトロ 壊死性腸炎の頂端外腸炎モデル

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. Epithelial barrier function requires the integrity of intestinal epithelial cells. While epithelial cell proliferation maintains a continuous layer of cells that forms a barrier, epithelial damage leads to barrier dysfunction. As a result, luminal contents can across the intestinal barrier via an unrestricted pathway. Dysfunction of intestinal barrier has been associated with many intestinal diseases, such as inflammatory bowel disease. Isolated mouse intestinal crypts can be cultured and maintained as crypt-villus-like structures, which are termed intestinal organoids or &ldquo;enteroids&rdquo;. Enteroids are ideal to study the proliferation and cell death of intestinal epithelial cells in vitro. In this protocol, we describe a simple method to quantify the number of proliferative and dead cells in cultured enteroids. 5-ethynyl-2&rsquo;-deoxyuridine (EdU) and propidium iodide are used to label proliferating and dead cells in enteroids, and the proportion of proliferating and dead cells are then analyzed by flow cytometry. This is a useful tool to test the effects of drug treatment on intestinal epithelial cell proliferation and cell survival.

The presented protocol uses flow cytometry to quantify the number of proliferating and dead cells in cultured mouse enteroids. This method is helpful to evaluate the effects of drug treatment on organoid proliferation and survival.

腸内細胞増殖細胞および死細胞の定量化

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

母乳 Enteroids の増殖を促進する: 細胞増殖のEx Vivoモデル

要約

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スフェロイドにおける哺乳動物細胞の大規模拡張のための連続供給することによって栄養規制

乳がん研究のための潜在的機能インビトロモデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

胎児腸オルガノイドを用いたインビトロで吸引から破乳移行を再現する

微小トリプシン法によるモザイク乳腺オルガノイドの生成

全組織生検からヒト上皮EnteroidsとColonoidsの確立

マウスモデルにおける乳腺の発達と機能の評価

乳腺からの照射オルガノイドの成長とキャラクタリゼーション

内皮ネットワーク上の3D多細胞乳房スフェロイドの直接バイオプリンティング

インビトロ壊死性腸炎の頂端外腸炎モデル

腸内細胞増殖細胞および死細胞の定量化

母乳 Enteroids の増殖を促進する: 細胞増殖のEx Vivoモデル

要約

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スフェロイドにおける哺乳動物細胞の大規模拡張のための連続供給することによって栄養規制

乳がん研究のための潜在的機能 インビトロ モデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

胎児腸オルガノイドを用いたインビトロで吸引から破乳移行を再現する

微小トリプシン法によるモザイク乳腺オルガノイドの生成

全組織生検からヒト上皮EnteroidsとColonoidsの確立

マウスモデルにおける乳腺の発達と機能の評価

乳腺からの照射オルガノイドの成長とキャラクタリゼーション

内皮ネットワーク上の3D多細胞乳房スフェロイドの直接バイオプリンティング

インビトロ 壊死性腸炎の頂端外腸炎モデル

腸内細胞増殖細胞および死細胞の定量化

乳がん研究のための潜在的機能インビトロモデルとしての乳腺上皮および内皮細胞スフェロイド

インビトロ壊死性腸炎の頂端外腸炎モデル