MG è sostenuta da sovvenzioni, K08DK101608 e R03DK111473 il National Institutes of Health, marzo Dimes Foundation Grant No. 5-FY17-79, i bambini Discovery Institute di Washington University e St. Louis Children Hospital e il dipartimento di Pediatria presso la Washington University School di medicina, St. Louis. CJL è supportato da R01DK104946 (PI: Silverman), ospedale Discovery Institute di Washington University dei bambini e St. Louis Children.

Tutte le procedure di animale in questo studio sono state approvate dall'Università di Washington a St. Louis istituzionale Animal Care e uso Comitato (protocollo 20160187) o uso Comitato (protocollo 14103918) e Università di Pittsburgh istituzionali cura degli animali. Intestino tenue umano fetale a meno di 24 settimane di gestazione è stata ottenuta in conformità degli orientamenti di appalti tessuto anatomico Università di Pittsburgh dopo approvazione Institutional Review Board (protocollo PRO14100537) presso l'Università di Banca di tessuti di Pittsburgh salute Scienze attraverso un sistema onesto mediatore. De-identificati latte umano o latte materno pastorizzato donatore è stato ottenuto con una rinuncia di consenso da parte dell'Università di Pittsburgh Institutional Review Board.
1. cripta isolamento e istituzione di Enteroids da topi neonatali o intestino tenue umano precoce
<ol><li>Preparazione dei terreni Nota: Media dovrebbe essere preparato nella cappa il giorno prima isolamento cripta.<ol>
<li>Preparare terreni di coltura L 1,11. Iniziare con 1 L esente per volta Eagle di Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/L glucosio e L-Glutammina e aggiungere 110 mL siero bovino fetale (FBS) (concentrazione finale 10%), 11 mL penicillina-streptomicina (1% di concentrazione finale) e 1,1 mL sterile insulina (finale concentrazione 0,1%).</li>
		<li>Preparare 500 mL di miscela di PBS-antibiotico. Iniziare con 500 mL 1 x soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) con 10% FBS e aggiungere 5 mL di gentamicina (concentrazione finale 1%), amfotericina B (concentrazione finale 0,2%), da 1 mL e 5 mL penicillina-streptomicina (1% di concentrazione finale).</li>
		<li>Preparare 30 mL cella perturbazione Media #1. In primo luogo preparare 30 mL di coltura. Aggiungere acido di 600 µ l 0,5 M acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (concentrazione finale di 10 mM), 300 µ l gentamicina (concentrazione finale 1%) e 60 µ l anfotericina B (concentrazione finale 0,2%).</li>
		<li>Preparare 30 mL cella perturbazione Media #2. In primo luogo preparare 30 mL di coltura. Aggiungere 300 µ l 0,5 M EDTA (concentrazione finale di 5 mM), 300 µ l gentamicina (concentrazione finale 1%) e 60 µ l anfotericina B (concentrazione finale 0,2%).</li>
		<li>Preparare terreni di coltura 50ml cripta senza fattori di crescita. Misurare 33,4 mL 1 x Advanced DMEM/F-12 e aggiungere 10 mL FBS (concentrazione finale 20%).<ol>
<li>Aggiungere 500 µ l penicillina-streptomicina (concentrazione finale 1%), 500 µ l L-Glutammina (concentrazione finale 1%), 500 µ l gentamicina (concentrazione finale 1%), 100 µ l anfotericina B (concentrazione finale 0,2%), 2,5 µ l 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane acido solfonico (HEPES) (concentrazione finale 0,05 mM), 500 µ l 100 mM N-acetilcisteina (concentrazione finale di 1 mM), 500 µ l 100 x N-2 supplemento, 1 mL 50 x privo di siero supplemento (ad esempio, B-27) meno vitamina A e 500 µ l 1 mM 100 x Y-27632.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparare 1 mL di coltura di cripta con fattori di crescita. In primo luogo preparare 1 mL della cripta di coltura senza fattori di crescita. Aggiungere 2,5 µ l 40 µ g/mL Wnt3a (concentrazione finale 100 ng/mL), 1 µ l 100 µ g/mL Noggin (concentrazione finale 100 ng/mL), 2 µ l 250 µ g/mL R-Spondin (concentrazione finale 500 ng/mL) ed EGF di 0,5 µ l 100 µ g/mL (concentrazione finale di 50 ng/mL).</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento della cripta
	<ol>
<li>Posto solubilizzato Estratto di membrana dello scantinato (Vedi Tabella materiali) sul ghiaccio per scongelare prima di iniziare. Nota: Polimerizzerà della membrana dello scantinato di tenere il ghiaccio o si.</li>
		<li>In conformità con il protocollo istituzionale Animal Care e uso Comitato per topi superiori a 14 giorni di età, eutanasia topi con due metodi di eutanasia con la seconda essendo una procedura per garantire la morte fisica. Nota: Per i topi sotto i 14 giorni di età, decapitazione è la procedura standard, usando le forbici.</li>
		<li>Con delle forbici, pinze, praticare un'incisione verticale lungo la linea mediana dell'addome, attraverso la pelle e il peritoneo, per tutta la lunghezza dell'addome. Asportare il piccolo intestino dallo stomaco all'intestino cieco con le forbici e rimuovere il mesentere con le pinzette. Nota: Due-settimana-vecchio maschio e femmina C57BL/6J mouse pups, ogni peso di 5,5-7 g, sono stati utilizzati per l'isolamento di cripta. Qualsiasi età o dimensione del mouse può essere utilizzato per l'isolamento di cripta.</li>
		<li>Preparare appena raccolte nell'intestino tenue per l'isolamento di cripta, intestino posizione diritta, e tagliare l'intestino longitudinalmente lungo tutta la sua lunghezza usando le forbici. Nota: Mouse e intestino umano possono essere preparati allo stesso modo.</li>
		<li>Sgabello pulito fuori intestino agitando delicatamente l'intestino in avanti e indietro in una capsula Petri miscela di PBS-antibiotico-riempito usando il forcipe.</li>
		<li>Aggiungere 30 mL di cella perturbazione Media n. 1 a una provetta conica da 50 mL. Tagliare l'intestino in pezzi di lunghezza di 0,5 cm direttamente nella provetta. Impostare il tubo in un secchio di ghiaccio e agitare delicatamente su agitatore a velocità più basse per 15 min.</li>
		<li>Mentre i tessuti sono sull'agitatore, ottenere 24 o 48 pozzetti piastre per crescere cripte se il enteroids devono essere utilizzati per l'isolamento di proteine, DNA o RNA. Uso camera 8 pozzetti diapositive a crescere cripte se il enteroids devono essere utilizzati per intero montare imaging confocale.</li>
		<li>Nella cappa, aggiungere 15 µ l della membrana dello scantinato nella parte inferiore di ciascun pozzetto della piastra 24 o 48 pozzetti. Se utilizzando camera diapositive, aggiungere 9 µ l della membrana dello scantinato alla parte inferiore di ogni camera. Nota: Regolare il volume della membrana dello scantinato in base alle dimensioni della piastra se necessario.</li>
		<li>Si diffuse rapidamente la membrana dello scantinato con la punta della pipetta in modo che la membrana dello scantinato forma uno strato sottile sul fondo del pozzo. Posizionare la piastra a 37 ° C in incubatrice per 30 minuti consentire la membrana dello scantinato polimerizzare. Nota: Le cripte non verranno collegato se non uno strato sottile della membrana dello scantinato è o se membrana basale contiene bolle d'aria.</li>
		<li>Dopo 15 minuti su un agitatore, filtrare il tessuto attraverso un colino di 100 µm. Scartare il flusso attraverso.</li>
		<li>Aggiungere 30 mL cella perturbazione Media n. 2 una nuova provetta conica 50 mL. Rimuovere il tessuto dal setaccio e aggiungere alla provetta.</li>
		<li>Impostare il tubo in un secchio di ghiaccio e agitare delicatamente su agitatore a velocità più basse per 15 min.</li>
		<li>Dopo 15 minuti sull'agitatore, filtro tessuto attraverso un colino di 100 µm. Mantenere il flusso attraverso a questo punto, nel caso in cui il rendimento è basso nei passaggi successivi. Nota: Tutto il flusso attraverso i tubi dovrà essere tenuto al ghiaccio.</li>
		<li>Aggiungere 15 mL DMEM con 4,5 g/L glucosio e L-glutammina ad un nuovo tubo conico di 50 mL. Rimuovere il tessuto dal setaccio e aggiungere alla provetta. Vigorosamente agitare il tubo a mano per 10 s. filtro attraverso un colino di 100 µm e raccogliere il flusso attraverso. Ripetere fino a quando il flusso attraverso non contiene particolato.</li>
		<li>Nella cappa, filtrare il flusso attraverso il passaggio precedente in una nuova provetta conica 50 mL utilizzando 70 µm colini per mouse tessuto o 100 µm colini per tessuto umano. Nota: Avere filtri supplementari in standby e versare lentamente come filtri si intasano con detriti.</li>
		<li>Centrifugare la provetta a 200 x g per 8 min a 4 ° C e posto direttamente in un secchio di ghiaccio nella cappa. Eliminare il surnatante mediante pipetta senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet con totale quantità desiderata di cripta cultura Media senza fattori di crescita. Nota: Le cripte arricchite sono lo strato 'sabbioso' del pellet. Ognuno richiede ben 250 µ l di cripta cultura Media senza fattori di crescita.</li>
	</ol></li>
	<li>Stabilimento di enteroids
	<ol>
<li>La miscela di media cripta direttamente sulla membrana basale della piastra.</li>
		<li>Verifica cripte con un microscopio per garantire isolamento processo è stato completato. Nota: Sfere delle cellule e le cellule sono desiderate. Circa 100 singoli cripte sono placcati per pozzetto.</li>
		<li>Incubare la piastra a 37 ° C per 3 h per consentire cripte di aderire alla membrana basale. Nota: al termine dell'incubazione è con cripta cultura Media senza fattori di crescita.</li>
		<li>Rimuovere lentamente il media e cripte in eccesso che non è riuscito a collegare utilizzando una pipetta P-200. Nota: Non disturbare la membrana basale come le cripte associate possono diventare sloggiate.</li>
		<li>Lentamente aggiungere 250 µ l di cripta cultura Media con fattori di crescita ad ogni pozzetto. Nota: Per 24-48 pozzetti, o camera scivoli, 250 µ l di cripta cultura Media con fattori di crescita è sufficiente.</li>
		<li>Sostituire i media ogni 2 giorni con fresco cripta cultura Media con fattori di crescita per 5 giorni prima trattamenti per consentire per la crescita e fissaggio ottima.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Mouse raccolta per latte materno
<ol><li>Separare una diga che allattano C57BL/6J al post-partum 7-12 giorni da suoi cuccioli per 6 h prima della mungitura.</li>
	<li>Anestetizzare la diga in allattamento con isoflurano tramite un cono di naso e somministrare un'iniezione sottocutanea di ossitocina a 0,15 UI/kg di peso corporeo. Aspettare 3 minuti prima di tentare la procedura di mungitura.</li>
	<li>Pulire le tettarelle con etanolo al 70% prima della procedura di mungitura e lasciare asciugare.</li>
	<li>Estrarre il latte dal tettarelle uno alla volta utilizzando una pompa di seno umano con tubazione del silicone ridimensionata di tettarelle del mouse in una provetta di raccolta di 5 mL. Nota: Ottimale del seno pompe hanno due impostazioni, uno per la velocità e uno per l'aspirazione. Si consiglia di iniziare con le impostazioni più basse di ciascuno e aumentare entrambi lentamente fino a quando il latte viene estratto. Idealmente, la resa totale sarà ~ 500 µ l - 1 mL di latte materno del mouse per diga durante l'allattamento.</li>
	<li>Latte materno immediatamente aliquotare e conservare a-80 ° C. Nota: Evitare di gelo/disgelo cicli.</li>
	<li>Trattare enteroids il giorno 5 con 50 µ l/mL di latte materno del mouse / mL di terreni di coltura di cripta con fattori di crescita per 24 h a 37 ° C.</li>
</ol>3. tutto montare macchiatura di Enteroids
<ol><li>
Preparazione dei reagenti
	<ol>
<li>Preparare 16 mL di PBS 1X a 8 pozzetti.</li>
		<li>Preparare 2 mL 4% paraformaldeide (PFA) in 1X PBS a 8 pozzetti.</li>
		<li>Preparare 2 mL 0,1% Triton X-100 in 1X PBS a 8 pozzetti.</li>
		<li>Preparare 24 mL PBS Tween (PBST è 0.1% Tween 20 in 1X PBS) a 8 pozzetti.</li>
		<li>Preparare 2 mL 10% donkey normale siero (NDS) in 0,1% PBST (10% NDS/PBST) a 8 pozzetti.</li>
		<li>Preparare 4 mL 1% NDS nello 0,1% PBST (1% NDS/PBST) a 8 pozzetti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 ° giorno di colorazione
	<ol>
<li>Aspirare i trattamenti e lavare enteroids con PBS. Aggiungere 250 µ l 4% PFA per pozzetto. Posizionare il rotatore per 1-2 ore a 4 ° C. Rimuovere i 4% PFA con pipetta.</li>
		<li>Lavare 4 volte con 250 µ l/pozzetto 1 x PBS. Posizionare il rotatore per 10 min a temperatura ambiente (TA). Nota: È possibile memorizzare piastra per 1-2 giorni a 4 ° C se necessario.</li>
		<li>Aggiungere 250 µ l/pozzetto 0.1% Triton X-100. Incubare per 1 h a RT. Remove 0.1% Triton X-100 con pipetta.</li>
		<li>Lavare 4 volte con 250 µ l/pozzetto 1 x PBS. Posizionare il rotatore per 15 minuti a TA.</li>
		<li>Aggiungere 250 µ l/pozzetto 10% NDS/PBST. Incubare per 45 min a RT. Remove 10% NDS/PBST con pipetta.</li>
		<li>Aggiungere 250 µ l/pozzetto primaria dell'anticorpo, diluito 1/250 a 1% NDS/PBST e incubare per una notte a 4 ° C. Nota: La diluizione di anticorpo ottimale varia a seconda del produttore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Giorno 2 di colorazione
	<ol>
<li>Lavare almeno 5 volte per 4-5 h con 250 µ l/pozzetto PBST. Mettere sull'agitatore a 4 ° C tra ogni lavaggio.</li>
		<li>Aggiungere 250 µ l/pozzetto secondaria dell'anticorpo, diluito 1/1.000 a 1% NDS/PBST. Avvolgere la piastra in un foglio e incubare per una notte a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
3 ° giorno di colorazione
	<ol>
<li>Aggiungere 250 µ l/pozzetto nucleare macchia 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per 15 min. Nota: Tenere la piastra al buio.</li>
		<li>Lavare 6 volte con 250 µ l/pozzetto PBST. Posizionare il rotatore per 10 min a 4 ° C tra ogni lavaggio.</li>
		<li>Vetrino coprioggetti Mount sulla camera slide con supporti di montaggio.</li>
		<li>Prendere le immagini con un 40x microscopio confocale oggettivo e ugualmente il rendering in un editor di grafica raster (Vedi Tabella materiali).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Patel, R. M., Denning, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+use+of+prebiotics,+probiotics,+and+postbiotics+to+prevent+necrotizing+enterocolitis:+what+is+the+current+evidence?.">Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence?.</a> Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).</li><li>Caplan, M. S., Jilling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+concepts+in+necrotizing+enterocolitis.">New concepts in necrotizing enterocolitis.</a> Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).</li><li>Henry, M. C., Moss, R. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteroviruses+infect+human+enteroids+and+induce+antiviral+signaling+in+a+cell+lineage-specific+manner.">Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li></ol>

Gli autori hanno nulla da divulgare e senza conflitti di interesse.

L'epitelio intestinale è composto di molti sottotipi cellulari che sono responsabili per fornire la difesa ospite contro gli agenti patogeni, mantenendo l'integrità della barriera dell'intestino e possono essere violati nella patogenesi di diverse malattie. Mentre modelli animali possono ricapitolare alcuni aspetti della malattia, il modello ex vivo di enteroids derivato dall'intestino tenue dei topi e gli esseri umani fornisce una piattaforma per testare gli effetti dei vari trattamenti. Il significato del mo...

Enterocolite necrotizzante (NEC) è la principale causa di morte per malattie gastrointestinali in bambini prematuri, che interessano quasi 1 in 10 neonati nati prima delle 29 settimane gestazione1,2,3. Metà degli infanti con progresso NEC per la forma più grave, dove la sopravvivenza è solo 10-30%4,5. Negli Stati Uniti, circa 2 miliardi di USD/anno sono spesi nel trattamento di neonati con NEC6,7, eppure terapia né il tasso di sopravvivenza è cambiato nel corso degli ultimi 30 anni. La patogenesi di NEC è caratterizzata dalla lesione intestinale e alterata mucosa guarigione8,9,10,11, tuttavia, le vie di segnalazione che portano a un esacerbato meccanismi per invertire l'infiammazione e la risposta infiammatoria rimangono in modo incompleto capiti.
La somministrazione di latte materno umano è stata trovata per essere la strategia solo protettiva contro NEC per bambini prematuri. Precedentemente abbiamo indicato che il latte materno protegge dallo sviluppo di NEC attraverso l'inibizione del recettore toll-like receptor immune innata 4 (TLR4) nell'epitelio intestinale attraverso il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) signaling pathway11. Il completamento del latte materno per una formula sperimentale di NEC ha attenuato la risposta infiammatoria vista in NEC come dimostrato dall'inibizione dell'apoptosi degli enterociti e restauro di proliferazione degli enterociti in un modo che era dipendente da sviluppo epidermico Factor (EGF) ed EGFR11. In un altro studio, è stato dimostrato che nitrato, un altro componente del latte materno, contribuisce alla sua natura protettiva modulando l'aspersione intestinale, rispetto al latte artificiale, che è carente di nitrato e può contribuire alla frequenza aumentata di NEC in Formula infanti alimentati12,13. Altri composti presenti nel latte materno che sono stati indicati per essere coinvolti nella protezione contro NEC includono gli oligosaccaridi del latte umano, L-arginina, glutamina e lattoferrina14,15,16, 17,18,19. Questi elementi benefici del latte materno rivelano la necessità del suo utilizzo nella prevenzione del NEC, ma anche sottolineano l'importanza di studiare i meccanismi, i percorsi e gli effetti cellulari coinvolte nel come il latte materno è mediare la protezione contro il NEC di segnalazione .
In ordine per studiare ulteriormente le proprietà protettive del latte materno in un modello murino di NEC, abbiamo sviluppato una tecnica di romanzo, facile da usare di mouse che il latte materno può essere estratta da una diga anestetizzata usando un seno umano elettrica pompa11,12 . Questa strategia di acquisizione di latte materno del mouse è vantaggiosa, non solo perché pompe del seno umano sono prontamente disponibili ed efficienti nell'approvvigionamento di latte materno, ma anche perché permette questo metodo di analisi del latte al seno specie-specifici. Di conseguenza, abbiamo possibile confrontare gli effetti del latte materno del mouse con quelle del latte materno umano espresso così come donatore umano latte pastorizzato di una banca del latte nei modelli specifici della specie. Questa tecnica consente lo studio dei componenti di latte del seno in relazione al loro contributo alla prevenzione di NEC. Altri ricercatori hanno sviluppato metodi di estrazione del latte materno, tuttavia, queste tecniche sono manuali e in genere richiedono più di un laboratorio membri20,21,22. Qui è presentata una tecnica semplice che può essere utilizzata modificando un tiralatte elettrico umano per raccogliere il latte da un mouse. Questa tecnica può essere applicata anche ad altre specie.
Per interrogare adeguatamente le vie di segnalazione coinvolte con NEC, sono necessari sistemi di modello per valutare tutti i tipi differenti delle cellule, noti per essere interessati nel processo di malattia. Qui, discutiamo uno tale sistema modello - enteroids - e della loro istituzione da mouse e intestino tenue umano. Enteroids intestinale umano (HIEs) forniscono in particolare promessa significativa, perché offrono un innovativo, geneticamente vario ex vivo modello umano per aiutare nello studio dei processi patofisiologici che avvengono nel tratto gastrointestinale 23. Enteroids sono stati trovati per essere coltivato a lungo termine e può essere congelato per più tardi uso23, e a differenza di Organoids intestinale umano (HIOs), cui culture sono sviluppate da cellule staminali pluripotenti inducibile, enteroids vengono generati da cellule staminali all'interno di cripte intestinali isolato24. Enteroids richiede meno manutenzione, può essere infettato rapidamente25e possono essere create facilmente poiché cripte intestinali sono più differenziati oltre HIOs23. Di conseguenza, HIEs offrono molti vantaggi rispetto alle tecniche esistenti perché possono essere sviluppati per esporre le proprietà specifiche dell'area compositiva e funzionale dell' epitelio gastrointestinale umano23. L'uso di enteroids è una scelta altamente efficace quando hanno bisogno di un modello umano dell'intestino, con l'osservanza delle limitazioni di regione-specific e facilità d'uso. Qui dimostriamo la tecnica di isolare e mantenere primari derivati da cellule staminali piccolo intestinale enteroids da topi e bambini prematuri umani.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin N (Insulin)</td>
			<td>Eli Lilly And Company</td>
			<td>0002-8315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Advanced DMEM/F-12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x N-2 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x B-27 Supplement Minus Vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>08-0085SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Wnt3a Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1324-WN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3474-RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>315-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030700112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030722116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030723112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>154534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;M Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;M Sterile Cell Strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope Leica TCS SP8 X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS6</td>
			<td>Adobe Systems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G 1.5 Inch Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxytocin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O3251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Double Electric Breast Pump</td>
			<td>Lansinoh</td>
			<td>044677530163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Round Bottom Test Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Stoppers</td>
			<td>Frey Scientific</td>
			<td>560761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB15580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mki67 primer F: 5&#39;-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3&#39; R: 5&#39;-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3&#39;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation

Enteroids intestinale piccolo umano sono derivate dalle cripte e quando coltivate in una nicchia staminale contengono tutti i tipi delle cellule epiteliali. La capacità di stabilire sistemi di coltura ex vivo enteroid umano sono importanti di patofisiologia intestinale di modello e di studiare il particolare risposte cellulari coinvolti. Negli ultimi anni, enteroids da topi e gli esseri umani sono in coltura, secondarie e sopraelevate distanza per un utilizzo futuro in diversi laboratori in tutto il mondo. Questa piattaforma di enteroid può essere utilizzata per testare gli effetti di vari trattamenti e farmaci e quali effetti sono esercitati sui tipi differenti delle cellule nell'intestino. Qui, un protocollo per stabilire primari derivati da cellule staminali piccolo enteroids intestinale derivato dai topi neonatali e prematuro intestino umano è fornito. Inoltre, questo sistema di coltura di enteroid è stato utilizzato per testare gli effetti del latte materno specie-specifici. Latte materno del mouse può essere ottenuto in modo efficiente utilizzando una pompa di seno umano modificate e latte espresso del mouse può essere utilizzato quindi per ulteriori esperimenti di ricerca. Ora dimostriamo gli effetti del mouse espresso, umano, e latte materno donato sulla crescita e sulla proliferazione di enteroids derivati da topi neonatali o intestino tenue umano precoce.

Abbiamo innanzitutto cercato di indagare se espresso latte materno o latte materno pastorizzato donatore ha avuto un effetto sul piccolo enteroids intestinale. Infatti, latte materno e latte materno donato ha aumentato la crescita del mouse neonatale (Figura 1A) e prematuro umana derivata enteroids (Figura 1B).
Dal momento che il latte materno ha aumentato la crescita d...

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Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Latte materno aumenta la crescita di Enteroids: un modello Ex Vivo di proliferazione delle cellule

Questo protocollo viene descritto come stabilire un sistema di cultura enteroid da mouse neonatale o prematura intestino umano così come un metodo efficace per raccogliere il latte dai topi.

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

19.4K Views.  Washington University School of Medicine. Questo protocollo viene descritto come stabilire un sistema di cultura enteroid da mouse neonatale o prematura intestino umano così come un metodo efficace per raccogliere il latte dai topi.

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In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

In Imaging bioluminescenza in vivo di Dinamica Tumore ipossia di metastasi cerebrali cancro al seno in un modello murino

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

Ricerca

Medicina

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Utilizzando quantitativa real-time PCR per la determinazione cellulare attecchimento dei donatori in un modello murino competitivo trapianto di midollo osseo

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantificazione del cancro al seno Cellula Invasività Utilizzando una tridimensionale (3D) Modello

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modello per studiare Hormone azione in seno umano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo ed ex vivo approcci per studiare il cancro ovarico metastatico colonizzazione delle strutture Lattea Spot in peritoneale adiposo

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Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

Ex vivo dal vivo Imaging di polmone metastasi e il loro micro

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer metastasis, is largely unknown and is a focus in cancer research. Various breast cancer spontaneous metastasis mouse models have been established. Here, we report a simplified procedure to establish orthotopic transplanted breast cancer primary tumor and resultant spontaneous metastasis that mimic human breast cancer metastasis. Combined with the bioluminescence live tumor imaging, this mouse model allows tumor growth and progression kinetics to be monitored and quantified. In this model, a low dose (1 x 104 cells) of 4T1-Luc breast cancer cells was injected into BALB/c mouse mammary fat pad using a tuberculin syringe. Mice were injected with luciferin and imaged at various time points using a bioluminescent imaging system. When the primary tumors grew to the size limit as in the IACUC-approved protocol (approximately 30 days), mice were anesthetized under constant flow of 2% isoflurane and oxygen. The tumor area was sterilized with 70% ethanol. The mouse skin around the tumor was excised to expose the tumor which was removed with a pair of sterile scissors. Removal of the primary tumor extends the survival of the 4T-1 tumor-bearing mice for one month. The mice were then repeatedly imaged for metastatic tumor spreading to distant organs. Therapeutic agents can be administered to suppress tumor metastasis at this point. This model is simple and yet sensitive in quantifying breast cancer cell growth in the primary site and progression kinetics to distant organs, and thus is an excellent model for studying breast cancer growth and progression, and for testing anti-metastasis therapeutic and immunotherapeutic agents in vivo.

An orthotopic breast cancer primary tumor model and surgical removal of primary tumor to extend mouse life to generate spontaneous metastasis are described. The tumor growth and progression are monitored and quantified by luciferase fluorescence imaging.

Un modello murino ortotopico di spontanea Breast Cancer metastasi

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

Un piccolo modello animale di aspersione epatica normotermica Ex Vivo

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two dimensional (2D) and three dimensional (3D) culture has generated a wealth of information not only about corneal biology but also about wound healing, myofibroblast biology, and scarring in general. The goal of the protocol is an assay system for quantifying myofibroblast development, which characterizes scarring. We demonstrate a corneal organ culture ex vivo model using pig eyes. In this anterior keratectomy wound, corneas still in the globe are wounded with a circular blade called a trephine. A plug of approximately 1/3 of the anterior cornea is removed including the epithelium, the basement membrane, and the anterior part of the stroma. After wounding, corneas are cut from the globe, mounted on a collagen/agar base, and cultured for two weeks in supplemented-serum free medium with stabilized vitamin C to augment cell proliferation and extracellular matrix secretion by resident fibroblasts. Activation of myofibroblasts in the anterior stroma is evident in the healed cornea. This model can be used to assay wound closure, the development of myofibroblasts and fibrotic markers, and for toxicology studies. In addition, the effects of small molecule inhibitors as well as lipid-mediated siRNA transfection for gene knockdown can be tested in this system.

A protocol for an ex vivo corneal organ culture model useful for wound healing studies is described. This model system can be used to assess the effects of agents to promote regenerative healing or drug toxicity in an organized 3D multicellular environment.