نود أن نشكر جوشوا سنجر، جوناثان شينك، فضلا عن المراجعين مدروس للتعليقات على المخطوطة. كما نود أن نشكر بن الأبيض وهارولد الجريدة للمناقشات بشأن الأسلوب. شينك جوناثان توفر البيانات الشكل 3A. أيد هذا العمل على منحة من مؤسسة وايت هول و R21 المعاهد الوطنية للصحة إلى قج.

1. إعداد الذباب والمروج GAL4 تحديد خطوط
<ol><li>حدد خط مروج GAL4 وعبوره مع الذباب يحمل التحوير UAS-ناتشباك والتحوير أوبتوجينيتيك للتنشيط. ملاحظة: يتم تحديد UAS-كشريمسون11 بسبب الموصلية عالية، والسهولة التي ينشط ناتشباك بوساطة إمكانات العمل. تتوفر UAS-ناتشباك وكشريمسون UAS من "مستودع مخزون بلومينغتون".</li>
	<li>إعداد الشبكية عبر كل كحل أسهم في الإيثانول (35 ملم)، وتخزين الحل في الثلاجة عند-20 درجة مئوية.</li>
	<li>ميليلتر 28 مزيج من هذا المخزون إلى حوالي 5 مل من امهاء البطاطا تقشر الغذاء وأضف هذا الخليط إلى الجزء العلوي من قنينة متوسطة المورفولوجية التقليدية.</li>
	<li>رفع الذباب الكبار إذ تعرب عن كشريمسون على الأغذية التي تحتوي على 0.2 مم كل-ترانس-الشبكية لمدة 1 – 3 أيام11.</li>
</ol>2-إعداد الأوراق المالية ت
<ol><li>إنشاء حل أسهم 1 مم تتكس في الماء المقطر أو منزوع. تخزين هذا الحل في ثلاجة مختبر لعدة أشهر. تدقيق سياسات المؤسسات فيما يتعلق بتخزين ت تصنيف العديد من المؤسسات ت كمادة خطرة أو السيطرة عليها.</li>
</ol>3-إعداد الذباب للكهربية
<ol><li>جمع يوم 1 – 3 الذباب الكبار القديمة التي تثار على الطعام مع كل-ترانس-الشبكية. ملاحظة: تشير إلى مورثي وتيرنر في عام 2013 لوصف مفصل للتصحيح لقط المورفولوجية الخلايا العصبية،من1213.</li>
	<li>وضع الذباب في قنينة زجاج التﻷلؤ. مكان القنينة على الجليد لمدة 1 دقيقة شل الذباب.</li>
	<li>استخدام الملقط الخشنة لإدراج يطير إلى دائرة تسجيل مصنوعة خصيصا. وتتكون الغرفة 3 ½ "دائرة ليزر قطع من اﻷكريليك 1/16". قص حفرة ¾ "داخل المركز حيث تم إرفاق إحباط مخصصة مع الإيبوكسي الجزء 2. إحباط يحتوي على الثلاثي على شكل الأمل في أن يتم إدراج الطاير.</li>
	<li>تطبيق الشمع أو الإيبوكسي الأشعة فوق البنفسجية الشفاء حول الحيوان لضمان الحصول عليها بشدة داخل قاعة تسجيل.</li>
	<li>إلقاء الضوء على الإعداد مع ألياف ضوئية gooseneck للتصور تحت ستيريوميكروسكوبي. مجموعة ألياف gooseneck لإنارة منحرف بضبط لهم ذلك لإلقاء الضوء على الطاير مباشرة من الجانب.</li>
	<li>ضبط مستوى الضوء إلى أدنى الإعداد الممكنة التي ما زال يسمح التصور الواضح ذبابة. سوف تختلف هذه الكثافة الخفيفة عبر التجارب الفردية. ملاحظة: يمكن تكييف هذا البروتوكول باستخدام في الدماغ الموقع explant الأسلوب14.</li>
	<li>استرداد التسجيل الخارجي المالحة. يحتوي على المياه المالحة في مم: 103 كلوريد الصوديوم، 3 بوكل و 5 حامض الميثيل-2-أمينوثاني-سولفونيك ن-تريس (هيدروكسيميثيل)، تريهالوسي 8، الجلوكوز 10, 26 ناكو3، 1 نة2بو4، 1.5 كاكل2و 4 مجكل2 (المعدل إلى mΩ 270-275). هو bubbled المحلول الملحي مع 95% O2%5 CO2 (كاربوجين) وعدل الرقم الهيدروجيني إلى 7.315.</li>
	<li>ضع 4-6 قطرات من المحلول الملحي التسجيل خارج الخلية على إعداد الذبابة. عند هذه النقطة، زيادة مستوى الضوء في مجهر تشريح لرؤية أفضل.</li>
	<li>شحذ سلك تنغستن استخدام التحليل الكهربائي. جعل الأسلاك، تعد حلاً مشبعة كنو3 وتطبيق ما يقارب 20 "الخامس للتيار المتردد" الحالي حين غمس غيض الأسلاك في حل 20 مرة لكل 100 مللي ثانية حتى يتم شحذ التلميح. استخدام سلك التنغستن شحذ لإزالة بشرة على رأسه الطاير ومما يعرض في الدماغ.</li>
	<li>كذلك كشف الدماغ بإزالة القصبة الهوائية والهيئات الدهون التي تحيط بها. إذا كان الوصول إلى الفصوص باللوامس، استخدام سلك التنغستن بنت أو أداة مماثلة لشد بلطف هوائيات تحت إحباط تسجيل الدائرة زيادة وضوح الرؤية. استخدام الملقط حادة للدموع بلطف بعيداً اﻷغماد الدبقية تغطي مجال الاهتمام حيث سيجري إعداد تسجيلات.</li>
	<li>نقل غرفة تسجيل لتلاعب الكهربية. فورا bubbled نضح ابدأ مع تسجيل خارجي المحلول الملحي مع كاربوجين للحفاظ على الدماغ. ويوضع فوق المرحلة مجهر خزان المحلول الملحي وهو الجاذبية للإعداد. استخدام خط فراغ وقارورة Erlenmeyer ل 2 لجمع المياه المالحة النفايات.</li>
</ol>4-الحصول على تسجيل كامل الخلية
<ol><li>سحب الماصات التصحيح ساحبة ماصة تجارية. راجع الدليل لإعدادات لتحقيق ماصة مناسبة مع مقاومة نصيحة قرب 7 mΩ.</li>
	<li>إضافة 4 ميليلتر من تسجيل الداخلية حل إلى ماصة تصحيح. المياه المالحة الداخلية يتكون من 140 البوتاسيوم اسبارتاتي وحبيس 10، مجاتب 4، 0.5 غ3أنشئ، عطا 1 و 1 بوكل في مم.</li>
	<li>إعداد تصحيح المشبك مكبر للصوت لتسجيل كامل الخلية. صفر الإزاحة في مكبر للصوت ومكبر للصوت توصيل نبضات الاختبار. وهنا، يستخدم صباحا نظم تصحيح المشبك مكبر للصوت 2,400.</li>
	<li>تطبيق الضغط الإيجابي من خلال ماصة والاقتراب من الخلية. استخدام ميكرومانيبولاتور للمباشرة الماصة، والاتصال بالخلية. الإفراج عن الضغط الإيجابي. مجموعة القدرة القابضة للغشاء إلى-60 أم. وينبغي أن تشكل ماصة ختم جيجاوهم مع غشاء الخلية كما يدل على ذلك انخفاض sub-بيكوامب عقد الحالية. ملاحظة: إذا استخدام بروتينات فلورية خضراء تسترشد استهداف الخلية، في محاولة للتقليل من استخدام الضوء ابيفلوريسسينت لمنع التنشيط ChR2 والاكتئاب متشابك المحتملة. أيضا الانتظار لبضع دقائق قبل تطبيق الخطوة 5.</li>
	<li>تعيين مكبر للصوت توصيل نبضات الاختبار من-50 أم إلى-60 أم. هذا الإعداد المعيار على التصحيح-المشبك مكبرات الصوت. وستكشف البقول اختبار عابرة capacitative كبيرة تمثل الحالية اللازمة لشحن ماصة التصحيح. إزالة capacitative العابرين بضبط المقابض تعويضاً قدرة على الساعة 2400 أو مماثلة مكبر للصوت.</li>
	<li>تطبيق نبضات قصيرة من الضغط السلبي تمزق غشاء الخلية والحصول على تكوين كامل الخلية. ملاحظة: تكوين خلية كاملة من الملاحظ عندما تكون هناك زيادة كبيرة في العابرين capacitative عرض السعة للخلايا العصبية. المرجح أن يلاحظ أيضا زيادة صغيرة في عقد الحالية (خط الأساس). تعيين مكبر للصوت لوضع المشبك الحالي وضبط يمكن للخلية أن من-50 إلى-60 أم.</li>
</ol>5-اختبار اتصال متشابك
<ol><li>تكوين نظام حيازة (دق) البيانات لتشغيل برنامج تشغيل الصمام لتوليد نبضات الضوء. هنا، يتم استخدام نظام "دق الصكوك الوطنية" مع مطلب لتوصيل إشارة تمثيلية إلى برنامج تشغيل الصمام. يتم ضبط كثافة الصمام عن طريق الإشارات التناظرية إلى برنامج التشغيل. الصمام 620 630 الطول موجي نانومتر الصمام.</li>
	<li>ضع LED الحمراء رفيع المستوى مباشرة تحت التحضير. ضبط شدة الضوء بحيث تصل إلى 0.238 ميغاواط/مم2 الطاير.</li>
	<li>تنشيط الخلايا العصبية presynaptic أثناء التسجيل من الخلية بوستسينابتيك للفائدة. تحقيق خلية التنشيط أوبتوجينيتيكالي، فارماكوجينتيكالي، أو عن طريق تحفيز الأعصاب. وهنا، يتم تطبيق كشريمسون ونبضات قصيرة من الضوء الأحمر. ملاحظة: يمكن رصد اتصالات متشابك في المشبك الحالية ابسبس أو المشبك الجهد ابسكس. ينبغي أن يكون اتصال متشابك مرئية قبل تطبيق ت ردا على 40 نبضة خفيفة. إذا لوحظ أي اتصال، فإنه من غير المحتمل أن الخلايا العصبية سينابتيكالي متصلة أما مونو-أو بوليسينابتيكالي. يمكن تعديل عقد محتمل للتأكيد على اتصالات ضادات أو المثبطة تبعاً لذلك.</li>
	<li>إذا كان اتصال من الملاحظ في المحلول الملحي العادي، أضف ت إلى نظام التروية لتحقيق تركيز نهائي من 1 ميكرومتر. استخدام مضخة تعمل لالتقاط وإعادة استخدام المياه المالحة للمحافظة على ت. مضخة تمعجية سيتم استخلاص المحلول الملحي من الحمام وإعادته إلى الخزان المالحة.</li>
	<li>ضبط سرعة المضخة توفير فراغ ثابتة قوية تسمح بأن مستوى الملوحة في الحمام صعود وهبوط. ملاحظة: ينبغي أن يؤدي تطبيق ت وقف النتوءات النشاط في الخلايا العصبية التي تتم مراقبته في كل خلية. وهذا يؤكد أن ما يكفي ت المضاف إلى المياه المالحة.</li>
	<li>تطبيق نبضات قصيرة من الضوء الأحمر (40 مللي ثانية لكل نبضة) مرة أخرى. ومن المرجح في هذه المرحلة، أي اتصال متشابك الذي ما زال مونوسينابتيك. إضافة الخصوم الدوائية لتدوير المياه المالحة لاختبار الطبيعة الكيميائية اتصالات متشابك التي تظل في تتكس. ملاحظة: عند الجمع بين أوبتوجينيتيكس ونيون استهداف الخلايا العصبية، قد يكون من المهم عدم استمرار تفعيل السكان بريسينابتيك من الخلايا العصبية أثناء محاولة الحصول على تسجيل. وهذا يمكن أن يؤدي إلى الاكتئاب متشابك، ويجعل من الصعب على راجع اتصالات. بسبب كشريمسون عصابة إثارة طويل الذي يمتد على نطاق واسع في مجموعة البروتينات الفلورية الخضراء، فلوروفوري أحمر يمكن استخدامها لتمثيل الخلايا العصبية و channel2rhodopsin (Ch2R) يمكن استخدامها لإثارة السكان الخلية. ويتطلب القيام بذلك علم الوراثة محددة ومكعب عامل تصفية مخصص. لتوليد الذباب مناسبة، تجعل الذباب التي تعبر عن فلوروفوري الأحمر (طلب تقديم العروض أو مشري) تحت نظم التعبير الثنائي نظام ليزا أو Q. وهذه ستحتاج إلى تكون متقاطعة مع الذباب معربا عن مروج Gal4 وجينات المستجيب UAS-Ch2R وناتشباك UAS. سوف المكعب المرشح الأمثل ابيفلوريسسينسي مجموعة إثارة ضيقة تثير fluorophore أحمر، ولكن لا تثير Ch2R. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تشمل تعيين عامل التصفية عامل تصفية انبعاثات تمريره طويلة لجمع الكثير من الضوء المنبعثة. قمنا باستخدام عامل تصفية مخصص من صفاء التي شملت جزء أرقام et580/25 x و t600lpxr (من مجموعة 49306)، ولكن مع عامل تصفية حاجز/انبعاثات et610lp.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li><li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain.">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. , 684-696 (2012).</li><li>Doyle, M. W., Andresen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+monosynaptic+sensory+transmission+in+brain+stem+neurons+in+vitro.">Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro.</a> J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).</li><li>Nicholls, J. G., Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+chemical+and+electrical+connexions+between+sensory+and+motor+cells+in+the+central+nervous+system+of+the+leech.">Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech.</a> J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).</li><li>Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+individual+mechanoreceptor+sensory+neurons+to+defensive+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia.">Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).</li><li>Liao, X., Walters, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+elevated+divalent+cation+solutions+to+isolate+monosynaptic+components+of+sensorimotor+connections+in+Aplysia.">The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia.</a> J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).</li><li>Feinberg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+Reconstitution+Across+Synaptic+Partners+(GRASP)+Defines+Cell+Contacts+and+Synapses+in+Living+Nervous+Systems.">GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems.</a> Neuron. 57, 353-363 (2008).</li><li>Macpherson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+labelling+of+neural+connections+in+multiple+colours+by+trans-synaptic+fluorescence+complementation.">Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation.</a> Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).</li><li>Zhang, X., Gaudry, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+integration+of+a+serotonergic+neuron+in+the+Drosophila+antennal+lobe.">Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+olfactory+processing+in+Drosophila:+mechanisms+and+principles.">Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Murthy, M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+in+vivo+patch-clamp+recordings+in+the+Drosophila+brain.">Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).</li><li>Murthy, M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+head+cuticle+and+sheath+of+living+flies+for+whole-cell+patch-clamp+recordings+in+the+brain.">Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).</li><li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Cell+Recordings+from+Brain+of+Adult+Drosophila.">Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+olfactory+representations+in+the+Drosophila+antennal+lobe.">Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe.</a> Science. 303, 366-370 (2004).</li><li>Kazama, H., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+Matching+and+Nonlinear+Amplification+at+Identified+Central+Synapses.">Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses.</a> Neuron. 58, 401-413 (2008).</li><li>Becnel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+in+Drosophila:+a+pharmacogenetic+approach+for+controlling+behavior,+neuronal+signaling,+and+physiology+in+the+fly.">DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly.</a> Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).</li><li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand.">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).</li><li>Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laserspritzer:+A+Simple+Method+for+Optogenetic+Investigation+with+Subcellular+Resolutions.">Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions.</a> PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).</li><li>Holloway, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+Glutamatergic+Activation+of+Locus+Coeruleus+and+Other+Lower+Brainstem+Noradrenergic+Neurons+by+the+C1+Cells+in+Mice.">Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice.</a> J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457, 1142-1145 (2009).</li><li>Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+enhances+central+olfactory+neuron+responses+to+female+sex+pheromone+in+the+male+sphinx+moth+manduca+sexta.">Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta.</a> J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).</li><li>Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+GAL4-driven+transgene+expression+in+Drosophila+with+a+GAL80+enhancer-trap.">Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap.</a> Genesis. 39, 240-245 (2004).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

تحليل تيربس تكمل التقنيات الحالية المستخدمة لحلبة تكسير بتمكين الكشف عن نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا العصبية التي تم تحديدها. على وجه التحديد، النهج الذي يكشف عن اتصالات مونوسينابتيك بإسكات إمكانات العمل مع تتكس على نطاق واسع أثناء استعادة استثارة في عدد سكان تحديد الخلايا العصبية ?...

هدفا رئيسيا لعلم الأعصاب خريطة الاتصالات بين الخلايا العصبية لفهم كيفية تدفق المعلومات من خلال الدوائر. أصبحت العديد من النهج والموارد المتاحة لاختبار اتصال وظيفية بين الخلايا العصبية في مجموعة من الأنظمة النموذجية1،2. لإنشاء الرسوم البيانية الأسلاك الأكثر دقة باستخدام الكهربية، من المهم حل سواء كانت اتصالات الملحوظ بين خليتين مونوسينابتيك مقابل بوليسينابتيك وغير المباشرة وغير المباشرة. معيار الذهب لجعل هذا التمييز في الثدييات من الخلايا العصبية لقياس زمن الوصول بين action potentials واحد في الخلايا presynaptic وظهور التيارات بوستسينابتيك ضادات (ابسكس) في الخلايا العصبية الثانية. يجب أن يكون اتصالات مونوسينابتيك الاختفاء قصيرة بضع ميلي ثانية وتقلب منخفضة3. هذا النهج يمكن أن يكون معقداً في اللافقاريات الخلايا العصبية لأنه قد تحدث الاشتباكات العصبية في dendrites بهم بعيداً عن الموقع تسجيل جسدية، مما يؤدي إلى تأخير في الكشف عن سبب مسافات طويلة اليكتروتونيك بين كوندوكتانسيس بوستسينابتيك والتسجيل قطب كهربائي. يمكن إدخال هذه التأخيرات الغموض فيما يتعلق ببولي-مقابل الاشتراكات مونوسينابتيك. بالإضافة إلى ذلك، الأحداث متشابك الصغيرة قد تسوس قبل الوصول إلى الموقع تسجيلات جسدية، وقيادة النشاط presynaptic أقوى، من المرجح أن تجنيد الأحداث بوليسينابتيك.
وقد وضعت تقنيات مختلفة لاختبار اتصالات مونوسينابتيك في اللافقاريات. نهج واحد يستخدم الأيونات الموجبة divalent عالية الحلول (مرحبا دي) التي تحتوي على فائض ملغ++ وكاليفورنيا++. يمنع هذا الحل الاتصالات بوليسينابتيك باحتمال الإفراج عن الحد وزيادة إمكانات العمل عتبة لصالح كشف الإدخال مونوسينابتيك4،5. تحديد نسبة دقة ملغ++ بكاليفورنيا++ المطلوبة، ومع ذلك، ليست تافهة، وقد تستمر الاشتراكات بوليسينابتيك لتحفيز متواضعة حتى6. نهج بديل يسمى "إعادة تشكيل" التجارة والنقل عبر الشركاء متشابك (فهم) يستفيد من القرب بين الأغشية قبل وبوستسينابتيك عثر عليها في نهايات للاستدلال اتصال مونوسينابتيك 7. هنا، وأعرب عن مكون البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) في إحدى الخلايا العصبية، ويعبر عن جزء مكمل للجزيء بشريك بوستسينابتيك المفترضة. وجود الأسفار يشير إلى أن الخلايا العصبية اثنين في قرب قريبة ما يكفي للسماح بإعادة تشكيل جزيء بروتينات فلورية خضراء وينطوي على وجود المشبك. فهم يمكن تقرير نهايات زورا، رغم ذلك، إذا خليتين عن كثب قد الرئيسي يعارضها الأغشية، كما هو الحال في أحد الأعصاب أو كراسة. المتغيرات لفهم القضاء على هذه المغلوطة بالربط الجزء بريسينابتيك من التجارة والنقل مباشرة إلى سينابتوبريفين، مما يتيح إعادة تشكيل فقط في نهايات نشط8. في حين قد ساعدت في تحديد الربط الوظيفي في المورفولوجية CNS فهم وعن المتغيرات، بعض قد لا إجراء اتصالات مرئية بفهم إذا كانت المسافات بين الشركاء قبل وبوستسينابتيك كبيرة نسبيا. وهذا ذات الصلة لا سيما في تقييم نقل وحدة التخزين المرتبطة نيورومودوليشن9 أو تثبيط جابايرجيك10.
هنا، هو أظهر تقنية تكميلية ورواية لاختبار اتصالات مونوسينابتيك مباشرة في المورفولوجية الجهاز العصبي المركزي. يعمل هذا الأسلوب، تسمى "المقاومة تيدرودوتاكسين إجراء هندسة عكسية" لسبر سينابسيس (تيربس)، حسب تعبير المشاركين عن تيدرودوتاكسين (ت)-قناة مقاومة الصوديوم، ناتشباك، ومنشط أوبتوجينيتيك في خلية presynaptic أثناء التسجيل من المفترضة الشركاء بوستسينابتيك9. حضور ت، يتم منع جميع إمكانات العمل بوساطة النشاط في الخلايا غير تلك التي تعرب عن ناتشباك. قناة ناتشباك بشكل انتقائي يعيد استثارة في الخلايا المستهدفة presynaptic، تسمح بانتقال متشابك أثارت الضوء. هذا الأسلوب يسمح التنشيط قوية من الخلايا العصبية presynaptic، مثل أن اتصالات يمكن أن تحلها بوستسينابتيكالي تسجيل جسدية مع الحد من احتمال توظيف الدوائر بوليسينابتيك. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب يسمح بدراسة حجم الإرسال ويكشف عن انتشار الإرسال صدر من خلية واحدة في جميع أنحاء دائرة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكشف عن تيربس الطبيعة الكيميائية للاتصال من خلال الأدوية التقليدية. تيربس غير مناسبة للاستخدام في أي نموذج النظام يتيح التعبير المحورة وراثيا من قنوات الصوديوم ت غير متحسسة.

<table><tbody><tr><td>UAS-csChrimson</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55135</td><td>Used as a neural activator</td></tr><tr><td>UAS-NaChBac</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9466</td><td>Resotores excitibility in cells in TTX</td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Tochris</td><td>1078</td><td>Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance</td></tr><tr><td>all trans-Retinal</td><td>Sigma-Aldrichall trans-Retinal</td><td>R2500</td><td>Require co-factor for channelrhodopsin</td></tr><tr><td>Weldable 321 Stainless Steel&amp;nbsp;Sheet,&amp;nbsp;0.002&quot;&amp;nbsp;Thick,&amp;nbsp;10&quot;&amp;nbsp;Wide</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file</td></tr><tr><td>Dissection Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Used for dissection of preparation</td></tr><tr><td>Waxer</td><td>Almore</td><td>Eectra Waxer 66000</td><td>Used during dissection to secure fly in foil</td></tr><tr><td>Paraffin Wax</td><td>Joann</td><td>4917217</td><td>Used with waxer</td></tr><tr><td>Number 5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>#5CO</td><td>Used for dissection and desheathing</td></tr><tr><td>Dissection Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td>Used to remove parts of the cuticle during dissection</td></tr><tr><td>Tungsten wire</td><td>A-M Systems</td><td>797500</td><td>Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection</td></tr><tr><td>Reciculating Peristaltic Pump</td><td>Simply Pumps (Amazon)</td><td>PM200S</td><td>for recirculating TTX</td></tr><tr><td>Speed Controller for peristaltic pump</td><td>Zitrades (Amazon)</td><td>N/A</td><td>PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B</td></tr><tr><td>Versa-Mount&amp;nbsp;Precision Compressed Air Regulator</td><td>McMaster Carr</td><td>1804T1</td><td>For applying positive pressure during patching</td></tr><tr><td>Glass capilaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-3</td><td>For patch pipettes</td></tr><tr><td>Multipurpose Gauge</td><td>McMaster Carr</td><td>3846K431</td><td>Gauge for pressure regulator</td></tr><tr><td>Electrophysiology Camera</td><td>Dage MTI&amp;nbsp;</td><td>IR-1000</td><td>Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson</td></tr><tr><td>IR LED</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>M850F2</td><td>For oblique illumination</td></tr><tr><td>fiber optic for IR LED</td><td>Thorlabs</td><td>M89L01</td><td>Couples to IR LED</td></tr><tr><td>Objective lens&amp;nbsp;</td><td>Olympus 40X</td><td>LUMPlanFLN</td><td>This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons.</td></tr><tr><td>Amber LED</td><td>Thorlabs</td><td>M590L3d</td><td>For visualizing RFP and mCherry</td></tr><tr><td>Blue LED</td><td>Thorlabs</td><td>&lt;strong&gt;M470L3&lt;/strong&gt;&lt;sup&gt;d&lt;/sup&gt;</td><td>For visualizing GFP</td></tr><tr><td>GFP filter set</td><td>Chroma</td><td>&lt;strong&gt;49011&lt;/strong&gt;</td><td>For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Custom mCherry Filter Set</td><td>Chroma</td><td>&amp;nbsp;et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic</td><td>Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Dichroic to combine Amber and blue LED</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP550R</td><td>Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light.</td></tr><tr><td>Red LED</td><td>LEDSupply</td><td>Cree XPE 620 - 630 nm</td><td>Used to drive csChrimson</td></tr><tr><td>LED Driver</td><td>LEDSupply</td><td>3021-D-E-1000</td><td>Used to drive LEDs for optogenetic stimulation</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td>Used to position pipette during recordings</td></tr><tr><td>Patchclamp Amplifier</td><td>A-M Systems</td><td>Model 2400</td><td>An equivalent amplifier is suitable</td></tr><tr><td>Bessel Filter</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>LPF 202A</td><td>Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching.</td></tr><tr><td>Data Acquisition System&amp;nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>NI PCIe-6321&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 781044-01</td><td>Used to record data from amplifier to computer</td></tr><tr><td>Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A</td><td>National Instruments</td><td>779556-01</td><td>Used to connect amplifier to DAQ card.</td></tr><tr><td>Steel Foil&amp;nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Steel foil for custom recording chamber</td></tr><tr><td>Magnets</td><td>K&amp;amp;J Magnetics</td><td>D42</td><td>To secure recording chamber to ring stand</td></tr><tr><td>1/16&quot; Cell Cast Acrylic Clear</td><td>Pololu</td><td></td><td>Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file</td></tr></tbody></table>

examining monosynaptic connections in drosophila using tetrodotoxin resistant sodium channels

هنا، يتم تطبيق تقنية جديدة تسمى "المقاومة تيتروتوكسين" (ت) إجراء هندسة عكسية ل Synapses السبر (تيربس) لاختبار اتصالات مونوسينابتيك بين الخلايا العصبية المستهدفة. يعتمد الأسلوب على التعبير المشارك من المنشط المحورة وراثيا مع قناة الصوديوم تيدرودوتاكسين المقاوم، ناتشباك، في خلية presynaptic محددة. اتصالات مع الشركاء بعد متشابك المفترضة التي تحددها تسجيلات كامل الخلية حضور ت، الذي يمنع النشاط الكهربائي في الخلايا العصبية التي لا تعبر عن ناتشباك. يمكن تعديل هذا النهج للعمل مع أي منشط أو تصوير الكالسيوم كمراسل للاتصالات. ويضيف تيربس إلى مجموعة متنامية من الأدوات المتاحة لتحديد الاتصال داخل الشبكات. ومع ذلك، تيربس فريدة من نوعها في ذلك تقارير موثوق بها أيضا السائبة أو نقل وحدة التخزين ونقل الفائض.

تيربس يستخدم للتمييز بين مونو والاشتراكات بوليسينابتيك في متشابك الاتصالات بين الخلايا العصبية. بينما يمكن استخدام التحفيز ضعيفة خلية لاختبار اتصالات مباشرة، يقود أكبر نشاط presynaptic غالباً المجندين اتصالات بوليسينابتيك (الشكل 1A). تيربس يعمل من خلال المشت...

Watch this Scientific Journal Video about Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels at JoVE.com

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

هذه المقالة ميزات أسلوب اختبار اتصالات مونوسينابتيك بين الخلايا العصبية باستخدام تيدرودوتاكسين والقناة تيدرودوتاكسين-مقاومة الصوديوم، ناتشباك.

دراسة اتصالات مونوسينابتيك في المورفولوجية استخدام مقاومة تيدرودوتاكسين صوديوم قنوات

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

examining-monosynaptic-connections-drosophila-using-tetrodotoxin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

9.9K Views.  University of Maryland. هذه المقالة ميزات أسلوب اختبار اتصالات مونوسينابتيك بين الخلايا العصبية باستخدام تيدرودوتاكسين والقناة تيدرودوتاكسين-مقاومة الصوديوم، ناتشباك.

Video: Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

تشريح والتصوير من المناطق النشطة في ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

الكهربية طرق تسجيل الإمكانيات متشابك من يرقات ذبابة الفاكهة من NMJ

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Biology

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

Channelrhodopsin2 تحفيز ساطة من الإمكانيات في متشابك ذبابة الفاكهة العضلية المفارق

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

الحصاد وإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لتسجيل الكهربية وغيرها من الإجراءات

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

الكهربية في تسجيل ذبابة الفاكهة الأجنة

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

التتبع العكسي للخلايا العصبية للمحركات الجنينية باستخدام الاصباغ الفلورية الليبوهيلليك

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Developmental Biology

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

A بسيطة العصبية الميكانيكية إصابة منهجية للدراسة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; موتور العصبون التنكس

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

تسجيلات ماكروباتش المحورية للتيارات متشابك من الوصلات العصبية العضلية اليرقات المورفولوجية

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

عرض شبكات الأنابيب الدقيقة في تقاطعات ذبابة الفاكهة العصبية العضلية وخلايا العضلات

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

تسليط الضوء على المؤلف: فهم شبكة الأنابيب الدقيقة في تقاطعات ذبابة الفاكهة العصبية العضلية 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

دراسة اتصالات مونوسينابتيك في المورفولوجية استخدام مقاومة تيدرودوتاكسين صوديوم قنوات

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video