Name: examining monosynaptic connections in drosophila using tetrodotoxin resistant sodium channels
Uploaded: 2018-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels at JoVE.com

ברצוננו להודות יהושע זינגר, ג'ונתן שנק, כמו גם מתחשב בודקים עבור הערות על כתב היד. כן נרצה להודות לבן בן, הרולד אשות לדיונים על הטכניקה. ג'ונתן שנק סיפקה את הנתונים עבור איור 3A. עבודה זו נתמכה על ידי מענק קרן וייטהול, R21 של NIH על QG.

1. מכינים זבובים וקווים יזם לזהות GAL4
<ol><li>בחר קו יזם GAL4 וחצו אותה עם זבובים נושאת את transgene UAS-NaChBac והן של transgene optogenetic עבור הפעלה. הערה: UAS-CsChrimson11 נבחרה בשל מוליכות גבוהה שלה ואת הקלות שבה היא מפעילה בתיווך NaChBac פוטנציאל פעולה. UAS-NaChBac והן UAS-CsChrimson זמינים מהמאגר מניות בבלומינגטון.</li>
	<li>להכין כל טרנס רשתית כפתרון מניות אתנול (35 מ מ) ולאחסן את הפתרון במקפיא ב-20 ° C.</li>
	<li>מיקס 28 µL של המניה הזו אל תוך כ- 5 מ של תפוחי אדמה ולמיומנות אגיע מזון ומוסיפים תערובת זו העליון של הבקבוקון של מדיום דרוזופילה קונבנציונלי.</li>
	<li>להעלות את הזבוב הבוגר לבטא csChrimson על מזון המכיל 0.2 מ מ כל-טרנס-רשתית 1 – 3 ימים11.</li>
</ol>2. מכינים TTX מניות
<ol><li>ליצור פתרון מניות של 1 מ מ TTX במים מזוקקים או יונים. לאחסן פתרון זה מקרר מעבדה במשך מספר חודשים. בדוק את מדיניות מוסדות לגבי האחסון של TTX כמו מוסדות רבים לסווג TTX בתור חומר מסוכן או מבוקר.</li>
</ol>3. מכינים את הזבובים עבור אלקטרופיזיולוגיה
<ol><li>לאסוף יום 1 – 3 זבובים מבוגר בן מגודלים על האוכל עם כל-טרנס-רשתית. הערה: עיין Murthy ואת טרנר בשנת 2013 לתיאור מפורט של תיקון מחבר חובק למעקה דרוזופילה נוירונים12,13.</li>
	<li>הכניסו את הזבובים בקבוקון זכוכית נצנוץ. מקם את המבחנה לתוך קרח 1 דקות לשתק את הזבובים.</li>
	<li>להשתמש מלקחיים גס להוסיף לעוף לתוך חדר הקלטה בהזמנה אישית. התא מורכב 3 ½" מעגל לייזר לחתוך מ" 1/16" אקריליק. לחתוך חור ¾" היא המרכז שבו תשובה מכשילה מותאמת אישית מצורפת באפוקסי בשני חלקים. מסכל מכיל של משולש בצורת תקווה כי הזבוב מוכנס לתוך.</li>
	<li>החל שעווה או UV לריפוי אפוקסי סביב החיה לאבטח אותו בחוזקה בתוך תא הקלטה.</li>
	<li>יאיר ההכנה עם סיב אופטי מתכווננת ויזואליזציה תחת stereomicroscope. הגדר את הסיבים מתכווננת לתאורת עקיפה על ידי התאמת אותם כך מאירים לטוס ישירות מן הצד.</li>
	<li>להתאים את רמת האור הנמוך ביותר להגדרת אפשרי זה עדיין מאפשר הדמיה ברורה של הזבוב. עוצמת האור הזה ישתנו לאורך ניסויים בודדים. הערה: פרוטוקול זה ניתן להתאים באמצעות בתוך המוח באתרו explant השיטה14.</li>
	<li>אחזר הקלטה חיצוני תמיסת מלח. תמיסת המלח מכיל במ מ: 103 NaCl, 3 אשלגן כלורי, חומצה מתיל-2-aminoethane-sulfonic 5 N-טריס (hydroxymethyl), טרהלוז 8, גלוקוז 10, 26 NaHCO3,2פו ' NaH 1 '4, 1.5 CaCl2ו- 4 MgCl2 (מותאם mΩ 270-275). תמיסת המלח הוא מבעבע עם 95% או2/5% CO2 (carbogen), הסתגל pH 7.315.</li>
	<li>מקום 4-6 טיפות של תמיסת מלח הקלטה חוץ-תאית על הכנת לעוף. בשלב זה, להגביר את רמת האור-המיקרוסקופ לנתיחה עבור ניראות טובה יותר.</li>
	<li>בצעו חידוד חוט טונגסטן באמצעות אלקטרוליזה. כדי להפוך את החוט, להכין תמיסה רוויה של יודע3 ולהחיל כ 20 V של AC זרם בעודכם טובלים את קצה החוט בתוך תמיסת 20 פעמים למשך 100 אלפיות השניה עד קצהו הוא מחודד. להשתמש את החוט טונגסטן מחודדים כדי להסיר את הקוטיקולה על ראשו של הזבוב, ובכך חושף את המוח.</li>
	<li>בהמשך חושפים את המוח על-ידי הסרת קנה הנשימה וגופים שומן המקיפים אותו. אם ניגש האונות antennal, השתמש כפופות טונגסטן תילים או כלי דומה להכניס בעדינות אנטנות מתחת רדיד האלומיניום הקלטה קאמרית כדי להגדיל את הנראות. להשתמש מלקחיים חדה בעדינות תקרע מעליך את לנדן גליה המכסים את שטח עניין שבו יבוצעו הקלטות.</li>
	<li>העברה לחדר ההקלטה המתקן אלקטרופיזיולוגיה. מיד להתחיל זלוף בתמיסת הקלטה חיצוני מבעבע עם carbogen כדי לשמר את המוח. המאגר תמיסת ממוקמת מעל הבמה מיקרוסקופ, כוח המשיכה-מוזן ההכנה. השתמש קו ואקום, בקבוקון 2 ל' Erlenmeyer כדי לאסוף את תמיסת המלח פסולת.</li>
</ol>4. להשיג את הקלטת כולה-תא
<ol><li>משוך תיקון פיפטות פולר פיפטה מסחרי. עיין במדריך של הגדרות להגיע עם פיפטה המתאים עם התנגדות עצה ליד 7 mΩ.</li>
	<li>להוסיף 4 µL של פתרון הקלטה פנימית פיפטה תיקון. תמיסת המלח פנימי מורכב אספרטט אשלגן 140, 10 HEPES, 4 MgATP, 0.5 נה3GTP, 1 EGTA ו- 1 אשלגן כלורי במ מ.</li>
	<li>להגדיר את תיקון מגבר המלחציים עבור הקלטת כל תא. אפס היסט של המגבר ולהגדיר המגבר להעביר מבחן פולסים. . הנה, משמש מגבר מלחציים תיקון מערכות 2,400 AM.</li>
	<li>החל בלחץ חיובי פיפטה, מתקרבים התא. השתמש micromanipulator כדי לכוון את פיפטה ולפנות אל התא. שחרור הלחץ. ערכת הפוטנציאל החזקה של הקרום ל-60 mV. פיפטה יוצרות גושפנקה ג'יגה אוהם עם הממברנה של התא כפי שמעידים נמוך sub-picoamp מחזיק הנוכחי. הערה: אם באמצעות ה-GFP מודרכת תא מיקוד, לנסות לצמצם השימוש אור פלורסנטי כדי למנוע הפעלת ChR2 ודיכאון סינפטית פוטנציאליים. בנוסף להמתין כמה דקות לפני יישום שלב 5.</li>
	<li>להגדיר את מגבר להעברת פולסים מבחן מ-50 mV ל-60 mV. הגדרה זו היא תקן על תיקון-קלאמפ מגברים. מבחן פולסים תחשוף גדול capacitative הציעה שתושב זמני המייצג את הצורך הנוכחי כדי לחייב את פיפטה תיקון. הסר שנחשולי capacitative על-ידי התאמת בידית פיצוי קיבולת על אני 2400 או מגבר דומה.</li>
	<li>החל פולסים קצרים של לחץ שלילי לקרע קרום התא ולקבל כל-תא תצורה. הערה: תצורה התא כולו הוא ציין כאשר יש עלייה גדולה תופעות מעבר capacitative מציג את קיבול של הנוירון. עלייה קטנה במעצר הנוכחי (בסיסית) גם סביר להניח יתקיימו. הגדרת המגבר למצב הנוכחי של קלאמפ ולהתאים את הפוטנציאל של התא-50 עד-60 mV.</li>
</ol>5. בדיקת קישוריות סינפטית
<ol><li>תצורת המערכת רכישה (DAQ) נתונים כדי להפעיל התקן LED כדי להפיק להבזקי האור. כאן, מערכת DAQ מכשירים הלאומית משמשת עם Matlab להעביר אות אנלוגי נהג LED. עוצמת LED מותאמת באמצעות האות האנלוגי לנהג. ה-LED הוא 620-630 ננומטר אורך גל LED.</li>
	<li>מקם את עוצמה אדום LED ישירות מתחת ההכנה. להתאים את עוצמת האור כך mW/מ מ 0.2382 מגיע הזבוב.</li>
	<li>להפעיל את הנוירונים presynaptic תוך כדי הקלטה מהתא postsynaptic עניין. להשיג תא הפעלה optogenetically, pharmacogentically, או באמצעות גירוי עצבי. כאן, csChrimson, פולסים קצרים של אור אדום מוחלים. הערה: קשרים סינפטיים ניתן לנטר קלאמפ הנוכחי כמו EPSPs או מתח קלאמפ כמו EPSCs. חיבור סינפטית צריכים להיות גלויים לפני החלת TTX בתגובה פולס אור של 40 אלפיות. אם אין קשר הוא ציין, אין זה סביר כי הנוירונים synaptically מחוברים או מונו - או polysynaptically. החזקת פוטנציאלי עשוי להיות מותאם כדי להדגיש את חיבורי סינאפסות או מעכבות בהתאם.</li>
	<li>אם חיבור נצפית בתמיסת מלח, להוסיף TTX למערכת זלוף להשגת ריכוז סופי של 1 מיקרומטר. השתמש משאבה recirculating ללכוד ולהשתמש את תמיסת המלח כדי לחסוך טטרודוטוקסין. משאבת סחרור לצייר את תמיסת מהאמבטיה ולהחזיר אותה למאגר המים מלוחים.</li>
	<li>להתאים את מהירות המשאבה לספק ואקום קבוע חזק שאינו מאפשר את רמת מלוחים באמבטיה עם תוכי. הערה: היישום של TTX צריך לגרום הפסקת spiking פעילות הנוירון המנוטר בתא-שלם. זה מאשר כי מספיק TTX נוספה מלוחים...</li>
	<li>החל פולסים קצרים של אור אדום (40 ms לכל פעימה) שוב. בשלב זה, כל קשר סינפטית הנשאר סביר monosynaptic. להוסיף היריבים תרופתי מלוחים recirculating לבחון את האופי הכימי של קשרים סינפטיים שנותרו ב טטרודוטוקסין. הערה: כאשר שילוב של optogenetics ומיקוד פלורסנט של נוירונים, זה עשוי להיות חשוב לא לבצע את הפעלת בהתמדה את האוכלוסייה presynaptic של הנוירונים ניסה להשיג הקלטה. זה יכול להוביל לדיכאון סינפטית והופכת אותו קשה לראות את החיבורים. מכיוון csChrimson יש להקה עירור ארוכות המרחיבה בהרחבה לתוך הטווח של חלבון פלואורסצנטי ירוק, fluorophore אדום יכול לשמש כדי להמחיש נוירונים ו- channel2rhodopsin (Ch2R) יכול לשמש כדי לרגש אוכלוסיות תאים. כך דורש גנטיקה מסוימת קוביה מסנן מותאם אישית. כדי ליצור זבובים מתאימים, להפוך זבובים המבטאים את fluorophore אדום (RFP או mCherry) תחת מערכת בינארית ביטוי מערכת לקסה או Q. אלה יצטרכו חצה עם זבובים לבטא מקדם Gal4 וגם הגנים אפקטור UAS-Ch2R ו- UAS-NaChBac. הקוביה מסנן אופטימלי עבור epifluorescence יהיה מגוון עירור צר כדי לרגש את fluorophore אדום, אבל לא לרגש את Ch2R. בנוסף, ערכת מסנן צריכה לכלול מסנן פליטה מסירה ארוכה כדי לאסוף כמה שיותר האור הנפלט. השתמשנו מסנן מותאם אישית של Chroma שכלל חלק מספרי et580/25 x ו- t600lpxr (מקבוצת 49306), אבל עם מסנן פליטה/מכשול et610lp.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections.">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li><li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain.">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. , 684-696 (2012).</li><li>Doyle, M. W., Andresen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+monosynaptic+sensory+transmission+in+brain+stem+neurons+in+vitro.">Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro.</a> J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).</li><li>Nicholls, J. G., Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+chemical+and+electrical+connexions+between+sensory+and+motor+cells+in+the+central+nervous+system+of+the+leech.">Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech.</a> J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).</li><li>Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+individual+mechanoreceptor+sensory+neurons+to+defensive+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia.">Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).</li><li>Liao, X., Walters, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+elevated+divalent+cation+solutions+to+isolate+monosynaptic+components+of+sensorimotor+connections+in+Aplysia.">The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia.</a> J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).</li><li>Feinberg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP+Reconstitution+Across+Synaptic+Partners+(GRASP)+Defines+Cell+Contacts+and+Synapses+in+Living+Nervous+Systems.">GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems.</a> Neuron. 57, 353-363 (2008).</li><li>Macpherson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+labelling+of+neural+connections+in+multiple+colours+by+trans-synaptic+fluorescence+complementation.">Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation.</a> Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).</li><li>Zhang, X., Gaudry, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+integration+of+a+serotonergic+neuron+in+the+Drosophila+antennal+lobe.">Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+olfactory+processing+in+Drosophila:+mechanisms+and+principles.">Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Murthy, M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+in+vivo+patch-clamp+recordings+in+the+Drosophila+brain.">Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).</li><li>Murthy, M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+head+cuticle+and+sheath+of+living+flies+for+whole-cell+patch-clamp+recordings+in+the+brain.">Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).</li><li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Cell+Recordings+from+Brain+of+Adult+Drosophila.">Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+olfactory+representations+in+the+Drosophila+antennal+lobe.">Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe.</a> Science. 303, 366-370 (2004).</li><li>Kazama, H., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeostatic+Matching+and+Nonlinear+Amplification+at+Identified+Central+Synapses.">Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses.</a> Neuron. 58, 401-413 (2008).</li><li>Becnel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DREADDs+in+Drosophila:+a+pharmacogenetic+approach+for+controlling+behavior,+neuronal+signaling,+and+physiology+in+the+fly.">DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly.</a> Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).</li><li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand.">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).</li><li>Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laserspritzer:+A+Simple+Method+for+Optogenetic+Investigation+with+Subcellular+Resolutions.">Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions.</a> PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).</li><li>Holloway, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+Glutamatergic+Activation+of+Locus+Coeruleus+and+Other+Lower+Brainstem+Noradrenergic+Neurons+by+the+C1+Cells+in+Mice.">Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice.</a> J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).</li><li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections.">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457, 1142-1145 (2009).</li><li>Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+enhances+central+olfactory+neuron+responses+to+female+sex+pheromone+in+the+male+sphinx+moth+manduca+sexta.">Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta.</a> J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).</li><li>Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+GAL4-driven+transgene+expression+in+Drosophila+with+a+GAL80+enhancer-trap.">Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap.</a> Genesis. 39, 240-245 (2004).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

ניתוח TERPS מחמאות הנוכחי טכניקות המשמשות עבור מעגל פיצוח על-ידי הפיכת זיהוי הסינפסות בין נוירונים שזוהה. באופן ספציפי, הגישה חושף קשרים monosynaptic על ידי בהרחבה להשתיק פוטנציאל פעולה עם TTX בעת שיחזור דעתנית אוכלוסיה בחירה של נוירונים עם תעלת נתרן TTX-רגישות NaChBac. שחרור סינפטית היא שהפיק optogenetic גי?...

יעד מרכזי של מדעי המוח הוא למפות את הקשרים בין הנוירונים כדי להבין כיצד מידע זורם דרך מעגלים. גישות ומשאבים רבים הפכו להיות זמין לבדוק את תפקודי קישוריות בין הנוירונים בטווח של דגם מערכות1,2. כדי להפיק את תרשימים בחיווט המדויקות ביותר באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, חשוב לפתור אם חיבורים שנצפה בין שני תאים הם monosynaptic לעומת עקיף ו polysynaptic הישירים. תקן הזהב להכנת הבחנה זו בנוירונים יונקים זה מודדים ההשהיה בין יחיד action potentials בתאים presynaptic תחילתה של זרמי postsynaptic מעוררים (EPSCs) בתוך הנוירון השני. חיבורים monosynaptic צריך השהיות ארוכות יותר קצר של כמה אלפיות השניה, השתנות נמוכה3. גישה זו יכולה להיות מסובכת בנוירונים הגעה מכיוון הסינפסות עלולה להתרחש שלהם דנדריטים רחוק באתר הקלטה הסומטית, גרימת עיכובים בזיהוי בשל המרחקים זמן electrotonic בין postsynaptic conductances את ההקלטה אלקטרודה. עיכובים כאלה יכולים להציג את עמימות בנוגע פולי-לעומת תרומות monosynaptic. בנוסף, אירועים קטנים סינפטית ייתכן ריקבון לפני שמגיעים לאתר הקלטות הסומטית, נהיגה פעילות presynaptic חזק יותר, סביר להניח לגייס אירועים polysynaptic.
טכניקות שונות פותחו כדי לבדוק חיבורים monosynaptic חסרי חוליות. גישה אחת משתמשת הקטיון כלט גבוהה פתרונות (Hi-Di) המכילים עודף מ ג++ ו- Ca++. פתרון זה חוסמת חיבורים polysynaptic על-ידי הפחתת שחרור ההסתברות הסף הגדלת פוטנציאל הפעולה לטובת גילוי של קלט monosynaptic4,5. קביעת היחס המדויק של מ ג++ ל Ca++ הנדרשים, עם זאת, לא טריוויאלי, תרומות polysynaptic עלול להימשך אפילו צנוע גירוי6. גישה חלופית בשם GFP שיחזור על פני סינפטית שותפים (תפיסה) מנצל הקירבה בין ממברנות קדם ו postsynaptic ב הסינפסות להסיק חיבור monosynaptic 7. . הנה, רכיב של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), מתבטאת נוירון אחד, הרסיס משלימים של המולקולה מתבטאת שותף postsynaptic בשם. הנוכחות של קרינה פלואורסצנטית מציין כי שני הנוירונים נמצאים מספיק קרוב מאוד להתיר הכינון של מולקולת ה-GFP, מרמז על קיום סינפסה. תפיסתו יכולים לדווח הסינפסות זכריה, אם שני תאים יש קשר הדוק אני בטוחה ממברנות, כמו עצב או fascicle. וריאציות של תפיסתו לחסל תוצאות חיוביות שגויות כאלה על ידי קשירה של שבר presynaptic של GFP ישירות אל synaptobrevin, ובכך מאפשר שיחזור רק ב הסינפסות פעיל8. בעוד תפיסתו והווריאנטים שלה היה תפקיד חשוב בקביעת פונקציונלי קישוריות דרוזופילה CNS, קשרים לא עשויים להיות גלויים לפי תפיסתו אם המרחקים בין שותפים קדם ו postsynaptic גדול יחסית. זה רלוונטי במיוחד על פי הערכות של העברת אמצעי האחסון המשויך neuromodulation9 או עיכוב GABAergic10.
כאן, טכניקה משלימה ואת הרומן הוא הפגין לבדיקה חיבורים ישירים monosynaptic דרוזופילה CNS. שיטה זו, הנקראת טטרודוטוקסין מהונדסים ההתנגדות על חיטוט Synapses (TERPS), פועלת על-ידי ביטוי משותף טטרודוקסין (TTX)-ערוץ נתרן עמידים NaChBac, של optogenetic activator בתא presynaptic תוך כדי הקלטה מ בשם שותפים postsynaptic9. בנוכחות TTX, מדוכא כל פעילות בתיווך פוטנציאל הפעולה בתאים שאינם לבטא NaChBac. ערוץ NaChBac משחזר באופן סלקטיבי דעתנית ב יישוב presynaptic תא (ים), המתיר הסינאפסית עורר-אור. שיטה זו מאפשרת הפעלה חזקה של הנוירונים presynaptic, כך חיבורים יכולים להיפתר postsynaptically על ידי הקלטה סומאטית תוך צמצום ההסתברות של גיוס מעגלים polysynaptic. חשוב, טכניקה זו מאפשרת לימוד אמצעי שידור, חושף את התפשטות המשדר שוחררו נוירון בודד לאורך כל מעגל. בנוסף, TERPS יכול לחשוף הטבע כימי של החיבור באמצעות פרמקולוגיה קונבנציונלי. TERPS מתאים לשימוש בכל מערכת מודל המאפשר את הביטוי הטרנסגניים של תעלות נתרן TTX-רגישות.

<table><tbody><tr><td>UAS-csChrimson</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55135</td><td>Used as a neural activator</td></tr><tr><td>UAS-NaChBac</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9466</td><td>Resotores excitibility in cells in TTX</td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Tochris</td><td>1078</td><td>Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance</td></tr><tr><td>all trans-Retinal</td><td>Sigma-Aldrichall trans-Retinal</td><td>R2500</td><td>Require co-factor for channelrhodopsin</td></tr><tr><td>Weldable 321 Stainless Steel&amp;nbsp;Sheet,&amp;nbsp;0.002&quot;&amp;nbsp;Thick,&amp;nbsp;10&quot;&amp;nbsp;Wide</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file</td></tr><tr><td>Dissection Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Used for dissection of preparation</td></tr><tr><td>Waxer</td><td>Almore</td><td>Eectra Waxer 66000</td><td>Used during dissection to secure fly in foil</td></tr><tr><td>Paraffin Wax</td><td>Joann</td><td>4917217</td><td>Used with waxer</td></tr><tr><td>Number 5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>#5CO</td><td>Used for dissection and desheathing</td></tr><tr><td>Dissection Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td>Used to remove parts of the cuticle during dissection</td></tr><tr><td>Tungsten wire</td><td>A-M Systems</td><td>797500</td><td>Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection</td></tr><tr><td>Reciculating Peristaltic Pump</td><td>Simply Pumps (Amazon)</td><td>PM200S</td><td>for recirculating TTX</td></tr><tr><td>Speed Controller for peristaltic pump</td><td>Zitrades (Amazon)</td><td>N/A</td><td>PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B</td></tr><tr><td>Versa-Mount&amp;nbsp;Precision Compressed Air Regulator</td><td>McMaster Carr</td><td>1804T1</td><td>For applying positive pressure during patching</td></tr><tr><td>Glass capilaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-3</td><td>For patch pipettes</td></tr><tr><td>Multipurpose Gauge</td><td>McMaster Carr</td><td>3846K431</td><td>Gauge for pressure regulator</td></tr><tr><td>Electrophysiology Camera</td><td>Dage MTI&amp;nbsp;</td><td>IR-1000</td><td>Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson</td></tr><tr><td>IR LED</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>M850F2</td><td>For oblique illumination</td></tr><tr><td>fiber optic for IR LED</td><td>Thorlabs</td><td>M89L01</td><td>Couples to IR LED</td></tr><tr><td>Objective lens&amp;nbsp;</td><td>Olympus 40X</td><td>LUMPlanFLN</td><td>This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons.</td></tr><tr><td>Amber LED</td><td>Thorlabs</td><td>M590L3d</td><td>For visualizing RFP and mCherry</td></tr><tr><td>Blue LED</td><td>Thorlabs</td><td>&lt;strong&gt;M470L3&lt;/strong&gt;&lt;sup&gt;d&lt;/sup&gt;</td><td>For visualizing GFP</td></tr><tr><td>GFP filter set</td><td>Chroma</td><td>&lt;strong&gt;49011&lt;/strong&gt;</td><td>For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Custom mCherry Filter Set</td><td>Chroma</td><td>&amp;nbsp;et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic</td><td>Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Dichroic to combine Amber and blue LED</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP550R</td><td>Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light.</td></tr><tr><td>Red LED</td><td>LEDSupply</td><td>Cree XPE 620 - 630 nm</td><td>Used to drive csChrimson</td></tr><tr><td>LED Driver</td><td>LEDSupply</td><td>3021-D-E-1000</td><td>Used to drive LEDs for optogenetic stimulation</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td>Used to position pipette during recordings</td></tr><tr><td>Patchclamp Amplifier</td><td>A-M Systems</td><td>Model 2400</td><td>An equivalent amplifier is suitable</td></tr><tr><td>Bessel Filter</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;</td><td>LPF 202A</td><td>Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching.</td></tr><tr><td>Data Acquisition System&amp;nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>NI PCIe-6321&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 781044-01</td><td>Used to record data from amplifier to computer</td></tr><tr><td>Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A</td><td>National Instruments</td><td>779556-01</td><td>Used to connect amplifier to DAQ card.</td></tr><tr><td>Steel Foil&amp;nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Steel foil for custom recording chamber</td></tr><tr><td>Magnets</td><td>K&amp;amp;J Magnetics</td><td>D42</td><td>To secure recording chamber to ring stand</td></tr><tr><td>1/16&quot; Cell Cast Acrylic Clear</td><td>Pololu</td><td></td><td>Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file</td></tr></tbody></table>

examining monosynaptic connections in drosophila using tetrodotoxin resistant sodium channels

. הנה, טכניקה חדשה כינה Tetrotoxin (TTX) מהונדסים ההתנגדות של חיטוט Synapses (TERPS) מוחל לבדיקת monosynaptic קשרים בין נוירונים היעד. השיטה מסתמכת על ביטוי משותף activator הטרנסגניים עם הערוץ עמידים טטרודוטוקסין נתרן, NaChBac, ב presynaptic נוירון מסוים. קשרים עם שותפים הפוסט-סינפטית בשם נקבעים לפי כל-תא הקלטות בנוכחות TTX, אשר חוסם פעילות חשמלית בנוירונים המבטאים לא NaChBac. גישה זו יכול להיות שונה כדי לעבוד עם activator או סידן הדמיה ככתב של חיבורים. TERPS מוסיף ערכת הכלים הזמינים עבור קביעת קישוריות בתוך רשתות הולך וגדל. עם זאת, TERPS הוא ייחודי בכך שהוא גם אמין ידווח בצובר או אמצעי שידור ושידור והתאמת.

TERPS משמש להבחנה בין מונו - polysynaptic סיועה של קשרים סינפטיים בין נוירונים. בזמן גירוי חלשים של תא עשוי לשמש כדי לבדוק חיבורים ישירים, נהיגה יותר פעילות presynaptic לעיתים קרובות מגייס חיבורים polysynaptic (איור 1 א'). TERPS עובד על-ידי שיתוף לבטא תעלת נתרן TTX-רגישות NaChBac ו- activat...

Watch this Scientific Journal Video about Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels at JoVE.com

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

מאמר זה כולל שיטה לבדוק את החיבורים monosynaptic בין נוירונים בהחלת טטרודוטוקסין וערוץ עמידים טטרודוטוקסין נתרן, NaChBac.

בחינת חיבורים Monosynaptic דרוזופילה באמצעות ערוצי נתרן עמיד לטטרודוקסין

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

examining-monosynaptic-connections-drosophila-using-tetrodotoxin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

9.9K Views.  University of Maryland. מאמר זה כולל שיטה לבדוק את החיבורים monosynaptic בין נוירונים בהחלת טטרודוטוקסין וערוץ עמידים טטרודוטוקסין נתרן, NaChBac.

Video: Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. The larval neuromuscular system is a model synapse for the study of synaptic physiology and neurotransmission, and is a valuable research tool that has defined genetics and is accessible to experimental manipulation. Larvae can be dissected to expose the body wall musculature, central nervous system, and peripheral nerves. The muscles of Drosophila and their innervation pattern are well characterized and muscles are easy to access for intracellular recording. Individual muscles can be identified by their location and orientation within the 8 abdominal segments, each with 30 muscles arranged in a pattern that is repeated in segments A2 - A7. Dissected drosophila larvae are thin and individual muscles and bundles of motor neuron axons can be visualized by transillumination1. Transgenic constructs can be used to label target cells for visual identification or for manipulating gene products in specific tissues. In larvae, excitatory junction potentials (EJP&#8217;s) are generated in response to vesicular release of glutamate from the motoneurons at the synapse. In dissected larvae, the EJP can be recorded in the muscle with an intracellular electrode. Action potentials can be artificially evoked in motor neurons that have been cut posterior to the ventral ganglion, drawn into a glass pipette by gentle suction and stimulated with an electrode. These motor neurons have distinct firing thresholds when stimulated, and when they fire simultaneously, they generate a response in the muscle. Signals transmitted across the NMJ synapse can be recorded in the muscles that the motor neurons innervate. The EJP&#8217;s and minature excitatory junction potentials (mEJP&#8217;s) are seen as changes in membrane potential. Electrophysiological responses are recorded at room temperature in modified minimal hemolymph-like solution2 (HL3) that contains 5 mM Mg2+ and 1.5 mM Ca2+. Changes in the amplitude of evoked EJP&#8217;s can indicate differences in synaptic function and structure. Digitized recordings are analyzed for EJP amplitude, mEJP frequency and amplitude, and quantal content.

Here we describe electrophysiological methods for measuring synaptic transmission at the neuromuscular junction of Drosophila larva. Evoked release is initiated artificially by stimulating the motor neuron axons, and transmission through the NMJ can be measured by the postsynaptic response evoked in the muscle.

שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Biology

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

Channelrhodopsin2 גירוי מתווכת של פוטנציאלים Synaptic בבית תסיסנית Neuromuscular כלאיים

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

מסיק והכנת תסיסנית עוברים הקלטה אלקטרו ונהלים אחרים

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Developmental Biology

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal degeneration are remarkably similar in humans and invertebrates as are the molecular mechanisms that drive these processes. The fruit fly, Drosophila melanogaster, provides a powerful yet simple genetic model organism to study the cellular complexities of neurodegenerative diseases. In fact, approximately 70% of disease-associated human genes have a Drosophila homolog and a plethora of tools and assays have been described using flies to study human neurodegenerative diseases. More specifically the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila has proven to be an effective system to study neuromuscular diseases because of the ability to analyze the structural connections between the neuron and the muscle. Here, we report on an in vivo motor neuron injury assay in Drosophila, which reproducibly induces neurodegeneration at the NMJ by 24 h. Using this methodology, we have described a temporal sequence of cellular events resulting in motor neuron degeneration. The injury method has diverse applications and has also been utilized to identify specific genes required for neurodegeneration and to dissect transcriptional responses to neuronal injury.

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Here we describe a simple and widely accessible method to injure segmental nerves in Drosophila larvae to visualize and quantify neurodegeneration of motor neurons at the neuromuscular junction (NMJ) of third instar larvae.

פשוט Neuronal מכני מתודולוגיה פגיעה ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; נוירון מוטון ניוון

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

צפייה ברשתות מיקרוטובולים בצמתים עצביים-שריריים של דרוזופילה ובתאי שריר

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

מחבר זרקור: הבנת רשת מיקרוטובולים בצמתים עצביים-שריריים דרוזופילה 

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

בחינת חיבורים Monosynaptic דרוזופילה באמצעות ערוצי נתרן עמיד לטטרודוקסין

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית

Channelrhodopsin2 גירוי מתווכת של פוטנציאלים Synaptic בבית תסיסנית Neuromuscular כלאיים

מסיק והכנת תסיסנית עוברים הקלטה אלקטרו ונהלים אחרים

הקלטה של אלקטרו תסיסנית עובריים

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

פשוט Neuronal מכני מתודולוגיה פגיעה ללמוד

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

בחינת חיבורים Monosynaptic דרוזופילה באמצעות ערוצי נתרן עמיד לטטרודוקסין

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Dissection והדמיה של אזורי פעיל תסיסנית Neuromuscular צומת

שיטות אלקטרו עבור הקלטה פוטנציאלים Synaptic מן NMJ של הזחלים תסיסנית

Channelrhodopsin2 גירוי מתווכת של פוטנציאלים Synaptic בבית תסיסנית Neuromuscular כלאיים

מסיק והכנת תסיסנית עוברים הקלטה אלקטרו ונהלים אחרים

הקלטה של ​​אלקטרו תסיסנית עובריים

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

פשוט Neuronal מכני מתודולוגיה פגיעה ללמוד

מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

שימוש בצומת עצבי-שרירי של זחל דרוזופילה ובתאי שריר כדי להמחיש רשת מיקרוטובולים

הקלטה של אלקטרו תסיסנית עובריים