Wir möchten danken Joshua Singer, Jonathan Schenk sowie durchdachte Rezensenten für Kommentare auf das Manuskript. Wir möchten auch Danke Ben White und Harold Zakon für Diskussionen über die Technik. Jonathan Schenk lieferten die Daten für die Abbildung 3A. Diese Arbeit wurde durch ein Whitehall Foundation Grant und einem NIH-R21, QG unterstützt.

1. bereiten Sie fliegen und identifizieren GAL4-Promotor-Linien
<ol><li>Wählen Sie eine GAL4-Promotor-Linie und überqueren sie mit fliegen, die Durchführung des Transgens UAS-NaChBac und ein optogenetische Transgen für die Aktivierung. Hinweis: FH-CsChrimson11 aufgrund seiner hohen Leitfähigkeit und die Leichtigkeit, mit der NaChBac-vermittelten Aktionspotentialen aktiviert, ausgewählt ist. FH-NaChBac und FH-CsChrimson sind aus dem Bloomington Bestände Repository verfügbar.</li>
	<li>Bereiten Sie All-Trans Retinal als eine Stammlösung in Ethanol (35 mM) und speichern Sie die Lösung im Gefrierschrank bei-20 ° C.</li>
	<li>Mix-28 µL von diesem Bestand in etwa 5 mL konzentrierter Kartoffel Essen blättert nicht ab und fügen Sie diese Mischung an die Spitze der ein Fläschchen mit konventionellen Drosophila -Medium.</li>
	<li>Fliegen mit dem Ausdruck CsChrimson auf Lebensmittel, die 0,2 mM All-Trans-Retinal für 1 – 3 Tage11zu erhöhen.</li>
</ol>2. bereiten Sie TTX Lager
<ol><li>Erstellen Sie eine Stammlösung 1 mm TTX in destilliertem oder entionisiertem Wasser. Diese Lösung für mehrere Monate im Labor Kühlschrank aufbewahren. Überprüfen Sie die Institutionen Richtlinien in Bezug auf die Speicherung von TTX, wie viele Institutionen TTX als gefährlich oder kontrollierte Substanz einzustufen.</li>
</ol>3. bereiten Sie fliegen für Elektrophysiologie
<ol><li>Sammeln Sie 1 – 3 Tage alten Erwachsenen fliegen, die ausgelöst werden, auf das Essen mit All-Trans-Retinal. Hinweis: Siehe Murthy und Turner im Jahr 2013 für eine detaillierte Beschreibung der Patch spannen Drosophila Neuronen12,13.</li>
	<li>Legen Sie die fliegen in eine Glasflasche funkeln. Legen Sie das Fläschchen auf Eis für 1 min um die fliegen zu immobilisieren.</li>
	<li>Verwenden Sie grobe Zange um eine Fliege in eine maßgeschneiderte Aufnahme Kammer einzufügen. Die Kammer besteht aus einem 3 ½" Kreis Laser Schnitt von 1/16" Acryl. Schnitt ein Loch ¾" ist in der Mitte, wo eine benutzerdefinierte Folie mit 2-Komponenten-Epoxy befestigt ist. Die Folie enthält eine dreieckige geformte Hoffnung, die die Fliege eingefügt ist.</li>
	<li>Wenden Sie Wachs oder UV heilbar Epoxy rund um das Tier, um es innerhalb der Aufnahme Kammer zu befestigen an.</li>
	<li>Die Vorbereitung mit einem Schwanenhals-Lichtleiter für Visualisierung unter einem Stereomikroskop zu beleuchten. Legen Sie die Schwanenhals-Fasern für Schrägbeleuchtung sie so angepasst, dass sie fliegen direkt von der Seite beleuchten.</li>
	<li>Passen Sie die Lichtintensität auf die niedrigste mögliche Einstellung, noch klare Visualisierung der Fliege ermöglicht. Diese Lichtintensität variiert in einzelnen Experimente. Hinweis: Dieses Protokoll kann angepasst werden durch eine in Situ Gehirn explant Methode14.</li>
	<li>Rufen Sie externe Aufnahme Kochsalzlösung. Die Kochsalzlösung enthält in mM: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-Tris (Hydroxymethyl)-Methyl-2-Aminoethane-Sulfo-Säure, 8 Trehalose, 10 Glukose, 26 Nahco33, 1 NaH2PO4, 1,5 CaCl2und 4 MgCl2 (eingestellt auf mΩ 270-275). Die Kochsalzlösung wird mit 95 % O25 % CO2 (Carbogen) übergeben und hat ein pH-Wert 7,315angepasst.</li>
	<li>Platzieren Sie 4-6 Tropfen von extrazellulären Aufnahme Kochsalzlösung über die Fliege Vorbereitung. An diesem Punkt erhöhen Sie die Beleuchtungsstärke am Dissektion Mikroskop für bessere Sichtbarkeit.</li>
	<li>Ein Wolframdraht mit Elektrolyse zu schärfen. Um den Draht zu machen, Vorbereiten einer gesättigten Lösung von KNO3 und ca. 20 V AC Strom nicht anzuwenden, wenn die Spitze des Drahtes in die Lösung 20 Mal für 100 ms eintauchen, bis die Spitze geschärft ist. Verwenden Sie die geschärften Wolframdraht, entfernen die Nagelhaut auf den Kopf der Fliege und damit das Gehirn aussetzen.</li>
	<li>Weiter aussetzen des Gehirns durch Entfernen von Luftröhre und Fett stellen, die sie umgeben. Wenn die Riechzentrum Lappen zugreifen, verwenden Sie eine gebogene Wolframdraht oder ähnliches Werkzeug, sanft tuck Antennen unter der Folie Aufnahme Kammer um die Sichtbarkeit zu erhöhen. Verwenden Sie scharfe Pinzette sanft losreißen der Glia Ummantelung mit einer Fläche von Interesse, wo Aufnahmen gemacht werden.</li>
	<li>Übertragen Sie die Aufnahme-Kammer auf die Elektrophysiologie-Rig. Sofort sprudelte Start Perfusion mit externen Aufnahme Kochsalzlösung mit Carbogen, das Gehirn zu bewahren. Die Kochsalzlösung Reservoir wird über den Mikroskoptisch gesetzt und ist Schwerkraft-gefütterten zur Vorbereitung. Verwenden einer Vakuumleitung und eine 2 L-Erlenmeyerkolben, um die Abfälle Kochsalzlösung zu sammeln.</li>
</ol>4. erhalten Sie Whole-Cell Aufnahme
<ol><li>Ziehen Sie Patch Pipetten auf einem kommerziellen Pipette Abzieher. Konsultieren Sie das Handbuch für Einstellungen, um einen geeigneten Pipette mit einem Tipp-Widerstand in der Nähe von 7 mΩ zu erreichen.</li>
	<li>Fügen Sie 4 µL interne Aufnahme-Lösung in einer Patch-Pipette. Die interne Kochsalzlösung besteht aus 140 Kalium Aspartat-, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA und 1 KCl in mM.</li>
	<li>Patch Clamp Verstärker für die gesamte Zelle Aufnahme eingerichtet. Des Verstärkers Offset Null und legen Sie den Verstärker Testimpulse liefern. Hier wird AM Systeme Patch Clamp Verstärkers 2.400 verwendet.</li>
	<li>Positiver Druck durch die Pipette und nähern sich die Zelle. Verwenden Sie einen Mikromanipulator leiten die Pipette und wenden Sie sich an die Zelle. Entlasten Sie positiven Druck. Satz der Holding-Potenzial der Membran zu-60 mV. Die Pipette sollte eine Gigaohm Dichtung mit der Zellmembran wie durch eine niedrige Sub-Picoamp Haltestrom zu bilden. Hinweis: Wenn mit GFP Zelle Ausrichtung geleitet, versuchen Sie, Einsatz von Epifluorescent Licht auf ChR2 Aktivierung und potenzielle synaptische Depression verhindern zu minimieren. Auch für ein paar Minuten vor dem Auftragen Schritt 5 warten.</li>
	<li>Festlegen den Verstärker liefern Testimpulse von-50 mV bis-60 mV. Diese Einstellung ist standardmäßig in Patch-Clamp-Verstärker. Prüfimpulse zeigen eine große kapazitative transiente repräsentieren die aktuellen notwendig, laden Sie die Patch-Pipette. Entfernen Sie kapazitative Transienten durch Anpassung der Kapazität Entschädigung Knöpfe auf der AM 2400 oder ähnlichen Verstärker.</li>
	<li>Wenden Sie kurze Impulse von Unterdruck, Ruptur der Zellmembran und erhalten ganz-Zell Konfiguration an. Hinweis: Eine ganze Zelle Konfiguration wird beobachtet, wenn gibt es eine große Zunahme der kapazitative Transienten zeigt die Kapazität des Neurons. Eine geringe Erhöhung der Haltestrom (Baseline) wird wahrscheinlich auch beobachtet werden. Den Verstärker zu aktuellen Klemme Modus einstellen und anpassen der Zelle Potential,-50 bis-60 mV.</li>
</ol>5. Testen Sie die synaptischen Konnektivität
<ol><li>Konfigurieren Sie das Datenerfassungssystem (DAQ) um einen LED-Treiber um die Lichtimpulse erzeugen auszulösen. Hier wird eine nationale Instrumente DAQ-System mit Matlab verwendet, um ein analoges Signal auf einen LED-Treiber liefern. Die LED-Intensität wird über das analoge Signal an den Fahrer angepasst. Die LED ist ein 620-630 nm Wellenlänge LED.</li>
	<li>Positionieren Sie die High-Power LED direkt unterhalb der Vorbereitung. Passen Sie die Intensität des Lichts, sodass 0.238 mW/mm2 im Handumdrehen erreicht.</li>
	<li>Aktivieren Sie die präsynaptischen Neuronen während der Aufnahme aus der postsynaptischen Zelle von Interesse. Zelle Aktivierung Optogenetically, Pharmacogentically, zu erreichen oder über Nervenstimulation. Hier sind CsChrimson und kurze Impulse von rotem Licht angewendet. Hinweis: Synaptische Verbindungen können entweder in Stromzange als EPSPs oder Spannung Klemme als EPSCs überwacht werden. Eine synaptische Verbindung sollte sichtbar sein, bevor Sie in Reaktion auf einen Lichtpuls 40 ms TTX anwenden. Wenn keine Verbindung zu beobachten ist, ist es unwahrscheinlich, dass die Nervenzellen synaptisch verbunden entweder Mono- oder polysynaptically. Im Betrieb möglichen kann angepasst werden, um erregenden oder hemmenden Anschlüsse entsprechend zu betonen.</li>
	<li>Wenn eine Verbindung in normalen Kochsalzlösung beobachtet wird die Perfusion System, eine Endkonzentration von 1 zu erreichen TTX hinzufügen verwenden µM eine Umwälzpumpe zu erfassen und Wiederverwenden von Kochsalzlösung um TTX zu sparen. Die peristaltische Pumpe wird Salzlösung aus dem Bad zu ziehen und an der saline Reservoir zurück.</li>
	<li>Passen Sie die Pumpe Geschwindigkeit um ein starkes Vakuum konstant bereitzustellen, das nicht, dass Kochsalzlösung Ebene in der Badewanne zulässt zu steigen und fallen. Hinweis: Die Anwendung der TTX sollte die Einstellung der Spick Aktivität in der Nervenzelle, die ganze Zelle überwacht wird führen. Dies bestätigt, dass die Kochsalzlösung genug TTX hinzugefügt wurde.</li>
	<li>Kurze Impulse von rotem Licht (40 ms bei jedem Impuls) erneut anwenden. An dieser Stelle synaptische Verbindung, die bleibt ist wahrscheinlich monosynaptischen. Die umlaufenden Kochsalzlösung testen die chemische Natur der synaptischen Verbindungen, die bleiben in TTX fügen Sie pharmakologische Antagonisten hinzu. Hinweis: Bei der Kombination von Optogenetik und fluoreszierende Ausrichtung der Neuronen kann es wichtig, nicht zu anhaltend aktivieren die präsynaptischen Bevölkerung der Neuronen bei dem Versuch, eine Aufnahme zu erhalten sein. Dies kann zu synaptische Depression führen und erschwert es, Verbindungen zu sehen. Da CsChrimson eine lange Erregung Band, die weitgehend in den Bereich des grün fluoreszierenden Proteins erstreckt hat, kann eine rote Fluorophor verwendet werden, um Neuronen und channel2rhodopsin visualisieren (Ch2R) kann verwendet werden, um Zellpopulationen zu begeistern. Dies erfordert spezielle Genetik und einen benutzerdefinierten Filter-Cube. Um geeignete fliegen zu erzeugen, machen Sie fliegen, die die rote Fluorophor (RFP oder mCherry) ausdrücken unter die LexA oder Q-System binärer Ausdruck Systeme. Diese müssen mit der Fliege Gal4 Förderer und FH-Ch2R und FH-NaChBac-Effektor-Gene auszudrücken überquert werden. Der optimale Filter-Cube für Epifluoreszenz haben eine Reihe von schmalen Erregung zu begeistern die rote Fluorophor, aber nicht begeistern Ch2R. zusätzlich, die Filter-Set sollte einen langen Pass Emission Filter, um möglichst viel emittierte Licht zu sammeln. Wir verwendeten einen benutzerdefinierten Filter set von Chroma, die Teil-Nummern et580/25 X und t600lpxr (aus dem 49306 Satz), enthalten aber mit einem et610lp Barriere/Emission Filter.</li>
</ol>

<ol>
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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+enhances+central+olfactory+neuron+responses+to+female+sex+pheromone+in+the+male+sphinx+moth+manduca+sexta.">Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta.</a> J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).</li><li>Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+GAL4-driven+transgene+expression+in+Drosophila+with+a+GAL80+enhancer-trap.">Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap.</a> Genesis. 39, 240-245 (2004).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Terpen Analyse ergänzt aktuelle Techniken zur Schaltung Rissbildung durch ermöglicht die Erkennung von Synapsen zwischen bestimmten Nervenzellen verwendet. Insbesondere offenbart der Ansatz monosynaptische Verbindungen im großen und ganzen Aktionspotentiale mit TTX-Stummschaltung während der Wiederherstellung Erregbarkeit in einer ausgewählten Population von Neuronen mit dem TTX-unempfindliche Natrium-Kanal NaChBac. Synaptischen Freisetzung wird durch optogenetische Stimulation ausgelöst, während postsynaptischen ...

Ein wesentliches Ziel der Neurowissenschaften ist, ordnen Sie die Verbindungen zwischen den Neuronen zu verstehen, wie Informationen über Schaltkreise fließt. Zahlreiche Ansätze und Ressourcen haben, um funktionelle Verknüpfung zwischen den Neuronen in einer Reihe von Modell-Systeme1,2Testen verfügbar. Um die genauesten Schaltpläne mit Elektrophysiologie zu erzeugen, ist es wichtig, zu lösen, ob beobachtete Verbindungen zwischen zwei Zellen direkt und monosynaptischen versus indirekte und polysynaptische sind. Ein Gold-Standard für die Herstellung dieser Unterscheidung in Säugetier-Neuronen ist die Wartezeit zwischen den einzelnen Action potentials in den präsynaptischen Zellen und dem Beginn der exzitatorischen postsynaptischen Ströme (EPSCs) in der zweiten Nervenzelle messen. Monosynaptische Verbindungen sollten kurze Wartezeiten von ein paar Millisekunden und geringe Variabilität3haben. Dieser Ansatz kann in Wirbellosen Neuronen kompliziert sein, denn Synapsen in ihre Dendriten weit von der somatische Aufnahme Website, was zu Verzögerungen in der Erkennung durch lange electrotonic Abstände zwischen postsynaptischen maßgearbeitet und der Aufnahme auftreten können Elektrode. Solche Verzögerungen können Unklarheiten bezüglich Poly-im Vergleich zu monosynaptischen Beiträge vorstellen. Darüber hinaus kleine synaptische Ereignisse kann vor Erreichen der somatischen Aufnahmen Website zerfallen, und fahren stärker präsynaptischen Aktivität wird voraussichtlich polysynaptische Veranstaltungen zu rekrutieren.
Verschiedene Techniken sind entwickelt worden, um für monosynaptischen Verbindungen bei Wirbellosen zu testen. Ein Ansatz setzt hohe zweiwertigen kationen (Hi-Di) mit überschüssigem Mg++ und Ca++. Diese Lösung blockiert polysynaptische Verbindungen durch reduzierende Release Wahrscheinlichkeit und zunehmende Aktionspotential Schwelle, Erkennung von monosynaptischen Eingang4,5zu bevorzugen. Bestimmung der genauen Verhältnis von Mg++ bis ca.++ erforderlich, jedoch ist nicht trivial und polysynaptische Beiträge können selbst bescheidene Stimulation6anhalten. Ein alternativer Ansatz namens GFP Rekonstitution über Synaptic Partner (GRASP) nutzt die Nähe zwischen Prä- und postsynaptischen Membranen gefunden an den Synapsen, einem monosynaptischen Verbindung 7abzuleiten. Hier eine Komponente des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) äußert sich in einer Nervenzelle und der ergänzenden Fragment des Moleküls drückt sich in einem vermeintlichen postsynaptischen Partner. Das Vorhandensein der Fluoreszenz zeigt, dass die zwei Neuronen sind in der Nähe genug, Rekonstitution des GFP-Moleküls zu gestatten und setzt die Existenz einer Synapse. Griff kann Synapsen falsch, jedoch melden, wenn zwei Zellen eng Membranen, wie in einem Nerv oder Faszikel apposed haben. Varianten von GRASP beseitigen solche Fehlalarme durch begrenzen der präsynaptischen Fragments der GLP direkt an Synaptobrevin, wodurch Rekonstitution nur bei aktiven Synapsen8. Während Griff und seine Varianten Bestimmung funktionelle Verknüpfung bei der Drosophila CNS beigetragen haben, können einige Verbindungen nicht sichtbar gemacht werden durch Verständnis wenn die Abstände zwischen Prä- und postsynaptischen Partner ist relativ groß. Dies ist besonders relevant bei der Bewertung der Lautstärke Übertragung Neuromodulation9 oder GABAergen Hemmung10zugeordnet.
Hier zeigt sich eine ergänzende und neuartige Technik zum Testen monosynaptischen Direktverbindungen in Drosophila CNS. Diese Methode, genannt Tetrodotoxin entwickelt Widerstand für Probing Synapsen (WARFTEN), funktioniert durch Co Ausdruck von Tetrodotoxin (TTX)-resistenten Natrium-Kanal, NaChBac und Aktivator optogenetische in einer präsynaptischen Zelle während der Aufnahme von vermeintlichen postsynaptischen Partner9. In Anwesenheit von TTX wird alle Aktionspotential-vermittelte Aktivität in den Zellen als die mit dem Ausdruck NaChBac unterdrückt. Der NaChBac-Kanal wird selektiv Erregbarkeit in die gezielte präsynaptischen Zellen bei schönem Licht-evozierten synaptische Übertragung wiederhergestellt. Diese Methode ermöglicht starke Aktivierung der präsynaptischen Neuronen, so dass Verbindungen postsynaptically durch somatische Aufnahme und reduziert die Wahrscheinlichkeit von recruiting polysynaptische Schaltungen gelöst werden können. Wichtig ist, diese Technik erlaubt die Untersuchung der Volumen-Übertragung und zeigt die Verbreitung des Senders aus ein einzelnes Neuron in einer Schaltung entlassen. Darüber hinaus können Terpen die chemische Natur der Verbindung durch konventionelle Pharmakologie offenbaren. Terpen eignet sich für den Einsatz in jedem Modellsystem, das die transgenen Ausdruck der TTX-unempfindliche Natriumkanäle ermöglicht.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="946">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">UAS-csChrimson</td>
			<td style="width:219px;">Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td style="width:344px;">55135</td>
			<td style="width:167px;">Used as a neural activator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">UAS-NaChBac</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>9466</td>
			<td style="width:167px;">Resotores excitibility in cells in TTX</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tetrodotoxin</td>
			<td>Tochris</td>
			<td>1078</td>
			<td style="width:167px;">Special permission may be needed to purchase TTX as it is a controlled substance</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">all trans-Retinal</td>
			<td>Sigma-Aldrichall trans-Retinal</td>
			<td>R2500</td>
			<td style="width:167px;">Require co-factor for channelrhodopsin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Weldable 321 Stainless Steel&#160;Sheet,&#160;0.002&#34;&#160;Thick,&#160;10&#34;&#160;Wide</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3254K7</td>
			<td style="width:167px;">Used to make custom fly holder. Custom foil can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dissection Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td style="width:167px;">Used for dissection of preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Waxer</td>
			<td>Almore</td>
			<td>Eectra Waxer 66000</td>
			<td style="width:167px;">Used during dissection to secure fly in foil</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraffin Wax</td>
			<td>Joann</td>
			<td>4917217</td>
			<td style="width:167px;">Used with waxer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Number 5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>#5CO</td>
			<td style="width:167px;">Used for dissection and desheathing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dissection Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15001-08</td>
			<td style="width:167px;">Used to remove parts of the cuticle during dissection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tungsten wire</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>797500</td>
			<td style="width:167px;">Use with electrolysis to make sharpened needles for dissection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Reciculating Peristaltic Pump</td>
			<td>Simply Pumps (Amazon)</td>
			<td>PM200S</td>
			<td style="width:167px;">for recirculating TTX</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Speed Controller for peristaltic pump</td>
			<td>Zitrades (Amazon)</td>
			<td style="width:344px;">N/A</td>
			<td style="width:167px;">PWM Dimming Controller For LED Lights or Ribbon, 12 Volt 8 Amp,Adjustable Brightness Light Switch Dimmer Controller DC12V 8A 96W for Led Strip Light B</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Versa-Mount&#160;Precision Compressed Air Regulator</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td style="width:344px;">1804T1</td>
			<td style="width:167px;">For applying positive pressure during patching</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glass capilaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td style="width:344px;">TW150F-3</td>
			<td style="width:167px;">For patch pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Multipurpose Gauge</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3846K431</td>
			<td style="width:167px;">Gauge for pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrophysiology Camera</td>
			<td>Dage MTI&#160;</td>
			<td>IR-1000</td>
			<td style="width:167px;">Any camera that works in the IR range (850 nm) will work. You do not want to use red illumination as this can activate csChrimson</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">IR LED</td>
			<td>Thorlabs&#160;</td>
			<td>M850F2</td>
			<td style="width:167px;">For oblique illumination</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">fiber optic for IR LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M89L01</td>
			<td style="width:167px;">Couples to IR LED</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Objective lens&#160;</td>
			<td>Olympus 40X</td>
			<td>LUMPlanFLN</td>
			<td style="width:167px;">This can be used on most microscipes and works well for visualizing fly neurons.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Amber LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M590L3d</td>
			<td style="width:167px;">For visualizing RFP and mCherry</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blue LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M470L3d</td>
			<td style="width:167px;">For visualizing GFP</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GFP filter set</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>49011</td>
			<td style="width:167px;">For visualizing GFP or stimulating channel2rhodopsin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Custom mCherry Filter Set</td>
			<td>Chroma</td>
			<td style="width:344px;">&#160;et580/25x and t600lpxr (from the 49306 set) but with an et610lp barrier/emission optic</td>
			<td style="width:167px;">Use only if you wish to patch identified neurons with channel2rhodopsin</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dichroic to combine Amber and blue LED</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td style="width:344px;">DMLP550R</td>
			<td style="width:167px;">Use only patch under mCherry and excite channel2rhodopsin with blue light.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Red LED</td>
			<td>LEDSupply</td>
			<td>Cree XPE 620 - 630 nm</td>
			<td style="width:167px;">Used to drive csChrimson</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">LED Driver</td>
			<td>LEDSupply</td>
			<td>3021-D-E-1000</td>
			<td style="width:167px;">Used to drive LEDs for optogenetic stimulation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Manipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>MP-225</td>
			<td style="width:167px;">Used to position pipette during recordings</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Patchclamp Amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 2400</td>
			<td style="width:167px;">An equivalent amplifier is suitable</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bessel Filter</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td>LPF 202A</td>
			<td style="width:167px;">Auxillary filter used to filter current trace to oscilloscope during patching.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Data Acquisition System&#160;</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>NI PCIe-6321&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 781044-01</td>
			<td style="width:167px;">Used to record data from amplifier to computer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Connector Block - BNC Terminal BNC-2090A</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>779556-01</td>
			<td style="width:167px;">Used to connect amplifier to DAQ card.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Steel Foil&#160;</td>
			<td>McMaster Carr</td>
			<td>3254K7</td>
			<td style="width:167px;">Steel foil for custom recording chamber</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Magnets</td>
			<td>K&#38;J Magnetics</td>
			<td>D42</td>
			<td style="width:167px;">To secure recording chamber to ring stand</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;">1/16&#34; Cell Cast Acrylic Clear</td>
			<td>Pololu</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;">Used to make custom recording chamber. Acrylic can be laser cut at pololu.com from the provided PDF file</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examining monosynaptic connections in drosophila using tetrodotoxin resistant sodium channels

Hier ist eine neue Technik, genannt Tetrotoxin (TTX) Engineered Widerstand für Probing Synapsen (WARFTEN) angewendet, um monosynaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen Ziel zu testen. Die Methode beruht auf Co Ausdruck einer transgenen Aktivator mit dem Tetrodotoxin-resistente Natrium-Kanal, NaChBac, in ein bestimmtes präsynaptischen Neuron. Verbindungen mit vermeintlichen postsynaptischen Partner richten sich nach ganzen Zelle Aufnahmen im Beisein von TTX, die elektrischen Aktivität in Nervenzellen blockiert, die nicht NaChBac ausdrücken. Dieser Ansatz kann geändert werden, um mit Aktivator oder Kalzium Imaging als Reporter der Verbindungen arbeiten. Terpen verleiht den wachsenden Satz von Werkzeugen für die Bestimmung der Konnektivität innerhalb von Netzwerken zur Verfügung. WARFTEN ist jedoch eindeutig, dass es auch zuverlässig Masse oder Volumen Übertragung und Spillover Übertragung meldet.

Terpen dient zur Unterscheidung zwischen Mono- und polysynaptische Beiträge in synaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen. Während schwache Stimulation einer Zelle verwendet werden, um direkte Verbindungen zu testen, Rekruten fahren größeren präsynaptischen Aktivität oft polysynaptische Verbindungen (Abbildung 1A). Terpen funktioniert durch die TTX-unempfindliche Natrium-Kanal NaChBac und Aktivator optogenetische Co zum Ausdruck zu bringen, und tes...

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Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Dieser Artikel bietet eine Methode, um die monosynaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen durch Tetrodotoxin und Tetrodotoxin-resistente Natrium-Kanal, NaChBac testen.

Prüfung der monosynaptische Verbindungen in Drosophila mit Tetrodotoxin resistente Natriumkanäle

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

examining-monosynaptic-connections-drosophila-using-tetrodotoxin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

9.9K Aufrufe.  University of Maryland. Dieser Artikel bietet eine Methode, um die monosynaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen durch Tetrodotoxin und Tetrodotoxin-resistente Natrium-Kanal, NaChBac testen.

Serie: Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of the hippocampus is relatively preserved 1. The organotypic culture system allows for the examination of neuronal, astrocytic and microglial effects, but as an ex vivo preparation, does not address effects of blood flow, or recruitment of peripheral inflammatory cells. To that end, this culture method is frequently used to examine excitotoxic and hypoxic injury to pyramidal neurons of the hippocampus, but has also been used to examine the inflammatory response. Herein we describe the methods for generating hippocampal slice cultures from postnatal rodent brain, administering toxic stimuli to induce neuronal injury, and assaying and quantifying hippocampal neuronal death.

The organoptypic hippocampal slice culture model is an in vitro model used to examine neuronal injury in a variety of paradigms. In this article, we describe the methods for generating slice cultures and quantifying neuronal injury.

Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Examining Local Network Processing using Multi-contact Laminar Electrode Recording

Cortical layers are ubiquitous structures throughout neocortex1-4 that consist of highly recurrent local networks. In recent years, significant progress has been made in our understanding of differences in response properties of neurons in different cortical layers5-8, yet there is still a great deal left to learn about whether and how neuronal populations encode information in a laminar-specific manner.
Existing multi-electrode array techniques, although informative for measuring responses across many millimeters of cortical space along the cortical surface, are unsuitable to approach the issue of laminar cortical circuits. Here, we present our method for setting up and recording individual neurons and local field potentials (LFPs) across cortical layers of primary visual cortex (V1) utilizing multi-contact laminar electrodes (Figure 1; Plextrode U-Probe, Plexon Inc).
The methods included are recording device construction, identification of cortical layers, and identification of receptive fields of individual neurons. To identify cortical layers, we measure the evoked response potentials (ERPs) of the LFP time-series using full-field flashed stimuli. We then perform current-source density (CSD) analysis to identify the polarity inversion accompanied by the sink-source configuration at the base of layer 4 (the sink is inside layer 4, subsequently referred to as granular layer9-12). Current-source density is useful because it provides an index of the location, direction, and density of transmembrane current flow, allowing us to accurately position electrodes to record from all layers in a single penetration6, 11, 12.

A fundamental issue in our understanding of cortical circuitry is how networks in different cortical layers encode sensory information. Here we describe electrophysiological techniques utilizing multi-contact laminar electrodes to record single-units and local field potentials and present analyses to identify cortical layers.

Untersuchen Local Network Processing mit Multi-Contact-Laminar Electrode Recording

Cortical layers are ubiquitous structures throughout neocortex1-4 that consist of highly recurrent local networks. In recent years, significant progress ...

Correlating Behavioral Responses to fMRI Signals from Human Prefrontal Cortex: Examining Cognitive Processes Using Task Analysis

The aim of this methods paper is to describe how to implement a neuroimaging technique to examine complementary brain processes engaged by two similar tasks. Participants' behavior during task performance in an fMRI scanner can then be correlated to the brain activity using the blood-oxygen-level-dependent signal. We measure behavior to be able to sort correct trials, where the subject performed the task correctly and then be able to examine the brain signals related to correct performance. Conversely, if subjects do not perform the task correctly, and these trials are included in the same analysis with the correct trials we would introduce trials that were not only for correct performance. Thus, in many cases these errors can be used themselves to then correlate brain activity to them. We describe two complementary tasks that are used in our lab to examine the brain during suppression of an automatic responses: the stroop1 and anti-saccade tasks. The emotional stroop paradigm instructs participants to either report the superimposed emotional 'word' across the affective faces or the facial 'expressions' of the face stimuli1,2. When the word and the facial expression refer to different emotions, a conflict between what must be said and what is automatically read occurs. The participant has to resolve the conflict between two simultaneously competing processes of word reading and facial expression. Our urge to read out a word leads to strong 'stimulus-response (SR)' associations; hence inhibiting these strong SR's is difficult and participants are prone to making errors. Overcoming this conflict and directing attention away from the face or the word requires the subject to inhibit bottom up processes which typically directs attention to the more salient stimulus. Similarly, in the anti-saccade task3,4,5,6, where an instruction cue is used to direct only attention to a peripheral stimulus location but then the eye movement is made to the mirror opposite position. Yet again we measure behavior by recording the eye movements of participants which allows for the sorting of the behavioral responses into correct and error trials7 which then can be correlated to brain activity. Neuroimaging now allows researchers to measure different behaviors of correct and error trials that are indicative of different cognitive processes and pinpoint the different neural networks involved.

The goal of our research is to correlate behavior to brain activity. Accurate behavioral measures and imaging techniques allow us to elucidate brain-behavior relationships.

Korrelation von Verhaltensreaktionen auf fMRI Signalen von Human präfrontalen Kortex: Untersuchung kognitiver Prozesse mit dem Task Analysis

The aim of this methods paper is to describe how to implement a neuroimaging technique to examine complementary brain processes engaged by two similar ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Multi-Photonen-Intrazelluläre Sodium Imaging Kombination mit UV-vermittelten Brenn Uncaging von Glutamat in CA1 Pyramidenzellen

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

Hochaufgelöste Quantifizierung der Geruchsgelenkten Verhalten in<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Verwenden der<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

Linear Agarose Kanäle zu studieren<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Krabbeln Verhalten

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Ein einfacher Weg zu messen Veränderungen in Reward-seeking Verhalten verwenden<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating the neuronal regulation of these behaviors is essential for the understanding of the physiological and molecular mechanisms underlying nutritional homeostasis. The use of genetically tractable animal models such as worms, flies, and fish greatly facilitates these types of studies. In the last decade, the fruit fly Drosophila melanogaster has been used as a powerful animal model by neurobiologists investigating the neuronal control of feeding and foraging behaviors. While undoubtedly valuable, most studies examine adult flies. Here, we describe a protocol that takes advantage of the simpler larval nervous system to investigate neuronal substrates controlling feeding behaviors when larvae are exposed to diets differing in their protein and carbohydrates content. Our methods are based on a quantitative colorimetric no-choice feeding assay, performed in the context of a neuronal thermogenetic-activation screen. As a read-out, the amount of food eaten by larvae over a 1 h interval was used when exposed to one of the three dye-labeled diets that differ in their protein to carbohydrates (P:C) ratios. The efficacy of this protocol is demonstrated in the context of a neurogenetic screen in larval Drosophila, by identifying candidate neuronal populations regulating the amount of food eaten in diets of different macronutrient quality. We were also able to classify and group the genotypes tested into phenotypic classes. Besides a brief review of the currently available methods in the literature, the advantages and limitations of these methods are discussed and, also, some suggestions are provided about how this protocol might be adapted to other specific experiments.

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

Described here is a protocol that enables the colorimetric quantification of the amount of food eaten within a defined interval of time by Drosophila melanogaster larvae exposed to diets of different macronutrient quality. These assays are conducted in the context of a neuronal thermogenetic screen.

Quantifizierung der Zufuhr von Makronährstoffen in einem thermogenetischen neuronalen Bildschirm mit Drosophila Larven

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

Prüfung der monosynaptische Verbindungen in Drosophila mit Tetrodotoxin resistente Natriumkanäle

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Die Organotypische hippokampalen Slice-Kultur-Modell für die Prüfung neuronaler Schädigung

Untersuchen Local Network Processing mit Multi-Contact-Laminar Electrode Recording

Korrelation von Verhaltensreaktionen auf fMRI Signalen von Human präfrontalen Kortex: Untersuchung kognitiver Prozesse mit dem Task Analysis

Visualisierung von Propriozeptoren in

Multi-Photonen-Intrazelluläre Sodium Imaging Kombination mit UV-vermittelten Brenn Uncaging von Glutamat in CA1 Pyramidenzellen

Hochaufgelöste Quantifizierung der Geruchsgelenkten Verhalten in

Linear Agarose Kanäle zu studieren

Ein einfacher Weg zu messen Veränderungen in Reward-seeking Verhalten verwenden

Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ

Quantifizierung der Zufuhr von Makronährstoffen in einem thermogenetischen neuronalen Bildschirm mit Drosophila Larven