نشكر الدكتور يينغ شيونغ على المناقشات والتعليقات على المخطوطة. يتم دعم هذا العمل بمنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم في الصين (NSFC) إلى C. M. (31500839).

1. تشريح اليرقات
ملاحظة: يتم استخدام محلول تشريح محلول ملحي يشبه الدملمف (HL3.1) 18 ومحلول التثبيت 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) 19،20في درجة حرارة الغرفة لأن الأنابيب الدقيقة تتبلمر عندما تكون درجة الحرارة منخفضة جدا.
<ol><li>اختر يرقة 3 متجولة مع ملقط طويل حاد. اغسله باستخدام HL3.1 وضعه على طبق التشريح تحت المجهر المجسم. ملاحظة: يتم التعرف على اليرقة المتجولة 3الثالثة من خلال spiracle الأمامي المتفرع وتزحف حول الأنبوب عند حوالي 96 ساعة (25 درجة مئوية) 21.</li>
	<li>ضع اليرقة مع الجانب الظهري أو البطني لأعلى. حدد الجانب الظهري من القصبة الهوائية الطويلة والبطني بواسطة أحزمة الأسنان البطنية.<ol><li>اعتمادا على الأنسجة التي يجب مراقبتها ، اختر التشريح الظهري أو البطني. سيسمح ذلك بعرض أكثر دقة وتفصيلا لمجال الاهتمام المحدد. لمراقبة NMJ والخلايا العضلية ، قم بقطع المناطق الظهرية والبطنية اليرقية ، على التوالي.</li>
	</ol></li>
	<li>دبوس السنانير الفم والذيل. اضبط المسامير للحفاظ على اليرقة في حالة ممتدة. أضف قطرة من HL3.1 إلى اليرقة لمنعها من الجفاف. ملاحظة: يمكن استخدام HL 3.1 الخالي من الكالسيوم2+ لتقليل تقلص العضلات أثناء التشريح.</li>
	<li>استخدم مقص التشريح لعمل قطع عرضي صغير بالقرب من الطرف الخلفي ، لكن لا تقطع الطرف الخلفي. ثم قطع على طول خط الوسط البطني نحو الطرف الأمامي.</li>
	<li>أدخل أربعة دبابيس حشرة على الزوايا الأربع لليرقة. إعادة ضبط دبابيس الحشرات بحيث يتم تمديد اليرقة إلى أقصى حد في جميع الاتجاهات.</li>
	<li>استخدم الملقط لإزالة الأعضاء الداخلية مع عدم إتلاف العضلات.</li>
</ol>2. التثبيت
<ol><li>أضف 100 ميكرولتر من PFA (4٪) لغمر الذبائح لمدة 40 دقيقة بينما لا تزال الذبائح مثبتة على طبق التشريح. تنبيه: يتم اتخاذ تدابير حماية فعالة لتجنب الاتصال المباشر بالجلد أو الاستنشاق ، لأن PFA يشكل خطرا.</li>
	<li>قم بفك المسامير ونقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 2 مل. اشطف PFA بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x يحتوي على 0.2٪ Triton X-100 (0.2٪ PBST) لملء أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل لمدة 10 دقائق على شاكر إزالة اللون عند 15 دورة في الدقيقة. كرر عملية الغسيل 5x.</li>
</ol>3. الكيمياء المناعية
<ol><li>اغمر الذبائح في عامل مانع (5٪ مصل الماعز في 0.2٪ PBST) ومنعها لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>قم بإزالة عامل الحجب واستبدله ب 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي (على سبيل المثال ، مضاد α توبولين ، 1: 1000 ؛ مضاد فويتش ، 1:50) مخفف ب 0.2٪ PBST عند 4 درجات مئوية طوال الليل. تصور الأنابيب الدقيقة العضلية عن طريق تلطيخ المناعة باستخدام مضاد α توبولين أحادي النسيلة. يمكن أن يعكس Anti-Futsch بشكل غير مباشر مورفولوجيا الأنابيب الدقيقة في NMJ.</li>
	<li>بعد حضانة الجسم المضاد الأساسي ، اغسل اليرقات بنسبة 0.2٪ PBST لمدة 10 دقائق. كرر 5x.</li>
	<li>احتضان اليرقات ب 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال ، الماعز المضاد للفأر 488 ، 1: 1000) المخفف بنسبة 0.2٪ PBST في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 ساعة في الظلام.</li>
	<li>بعد ذلك ، أضف صبغة نووية مثل TO-PRO (R) 3 يوديد (T3605) بتركيز 1: 1000 في أنبوب الحضانة لمدة 30 دقيقة عند تلطيخ الأنابيب الدقيقة في الظلام20,22.</li>
	<li>اشطف الجسم المضاد الثانوي والصبغة النووية بنسبة 0.2٪ PBST لمدة 10 دقائق. كرر 5x في الظلام.</li>
</ol>4. تصاعد
<ol><li>ضع جثة اليرقات في 0.2٪ PBST على شريحة زجاجية واضبطها تحت المجهر المجسم. تأكد من أن السطح الداخلي لجثة اليرقات متجها لأعلى وأن جميع جثث اليرقات مرتبة حسب الرغبة.</li>
	<li>قم بامتصاص محلول PBST الزائد بمنديل وأضف برفق قطرة من وسيط التثبيت المضاد للتلاشي.</li>
	<li>ضع غطاء على الشريحة لتغطية اليرقات المشرحة ببطء ورفق لتجنب الفقاعات.</li>
	<li>ضعي طلاء الأظافر حول غطاء الغطاء. ضع الشريحة في المساحة المظلمة لتقليل التوهين الفلوري.</li>
</ol>5. الحصول على الصور
<ol><li>للحصول على الصور ، استخدم مجهر المسح بالليزر متحد البؤر ، وحدد هدف غمر الزيت 60x (الفتحة العددية 1.42) أو ما شابه ذلك ، واضبط طاقة الليزر والطول الموجي بناء على التجربة.</li>
	<li>لتحديد NMJ ، التقط صورا في العضلات 4 في الجزء A3 (كما هو موضح في الموقع في الشكل 1F). حدد ليزر 488 نانومتر لتنشيط α-tubulin أو Futsch و 543 نانومتر لتنشيط مسار التصوير HRP. اضبط المعلمات على حجم إطار 800 بكسل × 800 بكسل ، وتكبير رقمي 2.0 ، وفاصل تصوير يبلغ 0.8 ميكرومتر في NMJs (الشكل 2).</li>
	<li>لتحديد الأنابيب الدقيقة في العضلات ، التقط صورا للعضلة 2 في الجزء A3-A5 (كما هو موضح في الموقع في الشكل 1G) لأنها تحتوي على عدد أقل من فروع القصبة الهوائية. اختر ليزر 488 نانومتر لتنشيط α توبولين وليزر 635 نانومتر لتنشيط مسار التصوير T3605. اضبط المعلمات على حجم إطار يبلغ 1024 بكسل × 1024 بكسل ، وتكبير رقمي 3.0 ، وفاصل تصوير يبلغ 0.4 ميكرومتر في خلايا العضلات (الشكل 3).</li>
</ol>

عرض شبكات الأنابيب الدقيقة في تقاطعات ذبابة الفاكهة العصبية العضلية وخلايا العضلات

<ol>
	<li>Halpain, S., Dehmelt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAP1+family+of+microtubule-associated+proteins.">The MAP1 family of microtubule-associated proteins.</a> Genome biology. 7 (6), 224 (2006).</li><li>S&#225;nchez, C., D&#237;az-Nido, J., Avila, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+microtubule-associated+protein+2+(MAP2)+and+its+relevance+for+the+regulation+of+the+neuronal+cytoskeleton+function.">Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function.</a> Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).</li><li>Dehmelt, L., Halpain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAP2/Tau+family+of+microtubule-associated+proteins.">The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins.</a> Genome biology. 6 (1), 204 (2005).</li><li>Roll-Mecak, A., McNally, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-severing+enzymes.">Microtubule-severing enzymes.</a> Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).</li><li>Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-depolymerizing+kinesins.">Microtubule-depolymerizing kinesins.</a> Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).</li><li>Bramblett, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+tau+phosphorylation+at+Ser396+in+Alzheimer's+disease+recapitulates+development+and+contributes+to+reduced+microtubule+binding.">Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding.</a> Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).</li><li>Van Vactor, D., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+morphogenesis,+active+zone+organization+and+structural+plasticity+in+Drosophila.">Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila.</a> Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).</li><li>Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Kl&#228;mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Futsch/22C10+is+a+MAP1B-like+protein+required+for+dendritic+and+axonal+development.">Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development.</a> Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).</li><li>Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Kl&#228;mbt, C., Davis, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Futsch+regulates+synaptic+microtubule+organization+and+is+necessary+for+synaptic+growth.">Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth.</a> Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).</li><li>Packard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+Wnt,+wingless,+provides+an+essential+signal+for+pre-+and+postsynaptic+differentiation.">The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation.</a> Cell. 111 (3), 319-330 (2002).</li><li>Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+and+movement+of+microtubules+in+axonal+growth+cones+and+developing+interstitial+branches.">Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).</li><li>Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+behavior+in+the+growth+cones+of+living+neurons+during+axon+elongation.">Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation.</a> The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).</li><li>Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+role+for+katanin+in+severing+microtubules+in+the+neuron.">An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron.</a> The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).</li><li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fidgetin+regulates+cultured+astrocyte+migration+by+severing+tyrosinated+microtubules+at+the+leading+edge.">Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge.</a> Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).</li><li>Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+Tau+and+taxol+on+polymerization+of+MCF7+microtubules+in+vitro.">The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro.</a> International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).</li><li>Velasco, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+depolymerization+contributes+to+spontaneous+neurotransmitter+release+in+vitro.">Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro.</a> Communications biology. 6 (1), 488 (2023).</li><li>H&#246;&#246;g, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+tomography+reveals+a+flared+morphology+on+growing+microtubule+ends.">Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends.</a> Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Broadie, K. S., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+embryonic+neuromuscular+synapse+of+Drosophila+melanogaster.">Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).</li><li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HDAC6+mutations+rescue+human+tau-induced+microtubule+defects+in+Drosophila.">HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).</li><li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Mao, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-severing+protein+Katanin+regulates+neuromuscular+junction+development+and+dendritic+elaboration+in+Drosophila.">Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila.</a> Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).</li><li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Tubulin-specific+chaperone+E+functions+at+neuromuscular+synapses+and+is+required+for+microtubule+network+formation.">Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation.</a> Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).</li><li>Sarthi, J., Elefant, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dTip60+HAT+activity+controls+synaptic+bouton+expansion+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction.">dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction.</a> PloS one. 6 (10), 26202 (2011).</li><li>Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+factor+essential+for+microtubule+assembly.">A protein factor essential for microtubule assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).</li><li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers.">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li><li>Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hereditary+spastic+paraplegia+gene,+spastin,+regulates+microtubule+stability+to+modulate+synaptic+structure+and+function.">The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function.</a> Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

هنا يتم وصف بروتوكول للتشريح والمناعة من ذبابة الفاكهة اليرقات الوصلات العصبية العضلية وخلايا العضلات. هناك العديد من النقاط الأساسية التي يجب مراعاتها. أولا ، يعد تجنب إصابة العضلات المرصودة أمرا بالغ الأهمية أثناء عملية التشريح. قد يكون من المفيد إصلاح شرائح اللحم قبل إزالة الأعض?...

تلعب الأنابيب الدقيقة (MTs) ، باعتبارها أحد المكونات الهيكلية للهيكل الخلوي ، دورا مهما في العمليات البيولوجية المتنوعة ، بما في ذلك انقسام الخلايا ، ونمو الخلايا وحركتها ، والنقل داخل الخلايا ، والحفاظ على شكل الخلية. يتم تعديل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة ووظيفتها من خلال التفاعلات مع البروتينات الأخرى ، مثل MAP1 و MAP2 و Tau و Katanin و Kinesin1،2،3،4،5.
في الخلايا العصبية ، الأنابيب الدقيقة ضرورية لتطوير وصيانة المحاور العصبية والتغصنات. تشوهات في الأنابيب الدقيقة تؤدي إلى خلل وظيفي وحتى موت الخلايا العصبية. على سبيل المثال ، في دماغ مرضى الزهايمر ، يقلل فرط فسفرة بروتين تاو من استقرار شبكة الأنابيب الدقيقة ، مما يسبب مخالفات عصبية6. وبالتالي ، فإن فحص شبكات الأنابيب الدقيقة سيساهم في فهم النمو العصبي والتسبب في الأمراض العصبية.
الوصلة العصبية العضلية (NMJ) هي المشبك المحيطي المتشكل بين طرف محور عصبي للخلايا العصبية الحركية والألياف العضلية ، وهو نظام نموذجي ممتاز وقوي لدراسة البنية والوظائف المشبكية7. Futsch هو بروتين في ذبابة الفاكهة متماثل مع البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة MAP1B الموجود في الثدييات8. يتم التعبير عنه فقط في الخلايا العصبية ويلعب دورا في تطوير الأزرار المشبكية ل NMJ 8,9. في النوع البري ، يتم تصور الحزم الخيطية التي تعمل على طول مركز عمليات NMJ عن طريق تلطيخ المناعة باستخدام مضاد Futsch. عند الوصول إلى نهاية NMJ ، تتمتع هذه الحزمة إما بالقدرة على تكوين حلقة تتكون من الأنابيب الدقيقة أو فقدان هيكلها الخيطي ، مما يؤدي إلى ظهور منتشر ومنقط10. ترتبط حلقات الأنابيب الدقيقة بمخاريط النمو المتوقفة مؤقتا ، مما يشير إلى أن مجموعة الأنابيب الدقيقة مستقرة11. لذلك ، يمكننا بشكل غير مباشر تحديد تطور الأنابيب الدقيقة المستقرة في NMJ عن طريق تلطيخ Futsch. يسمح الحجم الكبير لخلايا العضلات في يرقة ذبابة الفاكهة بتصور واضح لشبكة الأنابيب الدقيقة. يمكن العثور على العوامل التي تؤثر على استقرار شبكة الأنابيب الدقيقة من خلال تحليل كثافة وشكل الأنابيب الدقيقة. في الوقت نفسه ، يمكن التحقق من حالة شبكة الأنابيب الدقيقة لخلايا العضلات بنتيجة NMJ للحصول على استنتاجات أكثر شمولا.
تم استخدام العديد من البروتوكولات للتحقيق في شبكة وديناميكيات الأنابيب الدقيقة. ومع ذلك ، فقد ركزت هذه الأبحاث في كثير من الأحيان على الدراسات في المختبر 12،13،14،15،16. بدلا من ذلك ، استخدمت بعض التجارب في الجسم الحي المجهر الإلكتروني للكشف عن الهيكل الخلوي17. وفقا للارتباط المحدد للأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية أو الأصباغ الكيميائية بالبروتينات أو الحمض النووي ، تسمح الطرق المعروضة هنا باكتشاف شبكات الأنابيب الدقيقة في NMJ على مستوى الخلايا العصبية الفردية في الجسم الحي ، مع النتائج التي تؤكدها الملاحظات في خلايا العضلات. هذا البروتوكول بسيط ومستقر وقابل للتكرار عند دمجه مع الأدوات الجينية القوية المتوفرة في ذبابة الفاكهة الميلانية ، مما يتيح مجموعة متنوعة من فحوصات النمط الظاهري والفحوصات الجينية لدور البروتينات التنظيمية لشبكة الأنابيب الدقيقة في الجهاز العصبي في الجسم الحي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor Plus 405 phalloidin</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A30104</td>
			<td>dilute 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0128M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FV10-ASW confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>dilute 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser confocal microscope LSM 710</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Scissors</td>
			<td>66vision</td>
			<td>54138B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Futsch antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank&#160;&#160;</td>
			<td>22C10</td>
			<td>dilute 1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-&#945;-tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5168</td>
			<td>dilute 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Wako</td>
			<td>168-20955</td>
			<td>Final concentration: 4% in PB Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Minutien Pins</td>
			<td>Entomoravia</td>
			<td></td>
			<td>0.1mm Diam</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope SMZ161</td>
			<td>Motic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereoscopic fluorescence microscope BX41</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red-conjugated goat anti-HRP</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td></td>
			<td>dilute 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TO-PRO(R) 3 iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td>dilute 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer decoloring shaker TS-8</td>
			<td>Kylin-Bell lab instruments</td>
			<td>E0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>BioFroxx</td>
			<td>1139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers&#160;</td>
			<td>dumont</td>
			<td>500342</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using drosophila larval neuromuscular junction and muscle cells to visualize microtubule network

شبكة الأنابيب الدقيقة هي عنصر أساسي في الجهاز العصبي. ترتبط الطفرات في العديد من البروتينات التنظيمية للأنابيب الدقيقة باضطرابات النمو العصبي والأمراض العصبية ، مثل بروتين تاو المرتبط بالأنابيب الدقيقة للأمراض التنكسية العصبية ، وبروتين قطع الأنابيب الدقيقة Spastin و Katanin 60 يسبب الشلل النصفي التشنجي الوراثي وتشوهات النمو العصبي ، على التوالي. يعد الكشف عن شبكات الأنابيب الدقيقة في الخلايا العصبية مفيدا لتوضيح التسبب في الاضطرابات العصبية. ومع ذلك ، فإن صغر حجم الخلايا العصبية والترتيب الكثيف لحزم الأنابيب الدقيقة المحورية يجعل تصور شبكات الأنابيب الدقيقة أمرا صعبا. في هذه الدراسة ، وصفنا طريقة لتشريح الوصلة العصبية العضلية اليرقية وخلايا العضلات ، وكذلك التلوين المناعي لبروتين α-tubulin والبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة Futsch لتصور شبكات الأنابيب الدقيقة في ذبابة الفاكهة الميلانية. يسمح لنا التقاطع العصبي العضلي بمراقبة كل من الأنابيب الدقيقة قبل وبعد المشبكي ، ويسمح الحجم الكبير لخلايا العضلات في يرقة ذبابة الفاكهة بتصور واضح لشبكة الأنابيب الدقيقة. هنا ، من خلال تحور والإفراط في التعبير عن Katanin 60 في ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، ثم فحص شبكات الأنابيب الدقيقة في الوصلة العصبية العضلية وخلايا العضلات ، نكشف بدقة عن الدور التنظيمي ل Katanin 60 في النمو العصبي. لذلك ، جنبا إلى جنب مع الأدوات الوراثية القوية لذبابة الفاكهة ، يسهل هذا البروتوكول إلى حد كبير الفحص الجيني وتحليل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة لدور البروتينات التنظيمية لشبكة الأنابيب الدقيقة في الجهاز العصبي.

Microtubules (MTs), as one of the structural components of the cytoskeleton, play an important role in diverse biological processes, including cell division, cell growth and motility, intracellular transport, and the maintenance of cell shape. Microtubule dynamics and function are modulated by interactions with other proteins, such as MAP1, MAP2, Tau, Katanin, and Kinesin1,2,3,4,5.
In neurons, microtubules are essential for the development and maintenance of axons and dendrites. Abnormalities in microtubules lead to dysfunction and even the death of neurons. For instance, in the brain of Alzheimer&#39;s patients, Tau protein hyperphosphorylation reduces the stability of the microtubule network, causing neurological irregularities6. Thus, examining microtubule networks will contribute to a comprehension of neurodevelopment and the pathogenesis of neurological diseases.
The neuromuscular junction (NMJ) is the peripheral synapse formed between a motor neuron axon terminal and a muscle fiber, which is an excellent and powerful model system for studying synaptic structure and functions7. Futsch is a protein in Drosophila that is homologous to the microtubule-binding protein MAP1B found in mammals8. It is expressed only in neurons and plays a role in the development of the NMJ&#39;s synaptic buttons8,9. In wild-type, filamentous bundles that run along the center of NMJ processes are visualized by immunostaining with anti-Futsch. When reaching NMJ&#39;s end, this bundle has the ability to either form a loop consisting of microtubules or to lose its filamentous structure, resulting in a diffuse and punctate appearance10. Microtubule loops are associated with paused growth cones, which suggests the microtubule array is stable11. Therefore, we can indirectly determine the stable microtubule development in NMJ by Futsch staining. The large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. The factors affecting the stability of the microtubule network can be found by analyzing the density and shape of microtubules. Simultaneously, the microtubule network status of muscle cells can be cross-verified with the result of NMJ to obtain more comprehensive conclusions.
Many protocols have been employed for investigating the network and dynamics of microtubules. However, these researches have often focused on in vitro studies12,13,14,15,16. Alternatively, some in vivo experiments have employed electron microscopy to detect the cytoskeleton17. According to the specific binding of fluorescently labeled antibodies or chemical dyes to proteins or DNA, the methods presented here allow the detection of microtubule networks in NMJ at the level of individual neurons in vivo, with results corroborated by observations in muscle cells. This protocol is simple, stable, and repeatable when combined with the powerful genetic tools available in Drosophila melanogaster, enabling a diverse range of phenotypic examinations and genetic screenings for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system in vivo.

تسليط الضوء على المؤلف: فهم شبكة الأنابيب الدقيقة في تقاطعات ذبابة الفاكهة العصبية العضلية 

استخدام ذبابة الفاكهة اليرقات العصبية العضلية والخلايا العضلية لتصور شبكة الأنابيب الدقيقة

Currently, microtubule dynamics are observed indirectly through microtubule-binding proteins such as EB1. Since alphabeta tubulin heterodimers are abundant in the cytoplasm, fold directly, neighboring tubulin heterodimers are lacking the dynamics of microtubule networks in vivo. Our protocol visualizes microtubules in neuromuscular synapses and muscle cells.When combined with the powerful genetic tools available in Drosophila melanogaster, enabling a diverse range of phenotypic examinations and the genetic screening for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system in vivo. Our research focuses on the relationship between the cytoskeleton and the neurodevelopment, as well as its implications for neurological diseases. We hope to discover the mechanism of neurodevelopment and the parthenogenesis for neurological diseases by highlighting the effect of cytoskeletal regulatory proteins on neurons.

لقد أظهرنا إجراء خطوة بخطوة لتصور شبكة الأنابيب الدقيقة في كل من الوصلات العصبية العضلية (NMJs) وخلايا العضلات. بعد التشريح وفقا للرسم التخطيطي (الشكل 1A-E) ، يتم إجراء تلطيخ مناعي ، ويتم بعد ذلك ملاحظة الصور وتجميعها تحت مجهر ليزر متحد البؤر أو مجهر مضان مجسم (الشكل 1F <...

Watch this Scientific Journal Video about Understanding Microtubule Network in Drosophila Neuromuscular Junctions at JoVE.com

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتصور شبكات الأنابيب الدقيقة في الوصلات العصبية العضلية وخلايا العضلات. إلى جانب الأدوات الوراثية القوية لذبابة الفاكهة ، يسهل هذا البروتوكول إلى حد كبير الفحص الجيني وتحليل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة لدور البروتينات التنظيمية لشبكة الأنابيب الدقيقة في الجهاز العصبي.

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with ...

حاليا ، يتم ملاحظة ديناميكيات الأنابيب الدقيقة بشكل غير مباشر من خلال البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة مثل EB1. نظرا لأن تغاير الأبجدية توبولين وفير في السيتوبلازم ، يتم طيه مباشرة ، فإن متغاير التوبولين المجاور يفتقر إلى ديناميكيات شبكات الأنابيب الدقيقة في الجسم الحي. يصور بروتوكولنا الأنابيب الدقيقة في نقاط الاشتباك العصبي العضلي وخلايا العضلات.عندما يقترن بالأدوات الوراثية القوية المتوفرة في ذبابة الفاكهة الميلانية ، مما يتيح مجموعة متنوعة من فحوصات النمط الظاهري والفحص الجيني لدور البروتينات التنظيمية لشبكة الأنابيب الدقيقة في الجهاز العصبي في الجسم الحي. يركز بحثنا على العلاقة بين الهيكل الخلوي والنمو العصبي ، وكذلك آثاره على الأمراض العصبية. نأمل في اكتشاف آلية النمو العصبي والتوالد العذري للأمراض العصبية من خلال تسليط الضوء على تأثير البروتينات التنظيمية الهيكلية الخلوية على الخلايا العصبية.

using-drosophila-larval-neuromuscular-junction-muscle-cells-to

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using Drosophila Larval Neuromuscular Junction and Muscle Cells to Visualize Microtubule Network

1.4K Views.  Hubei University. حاليا ، يتم ملاحظة ديناميكيات الأنابيب الدقيقة بشكل غير مباشر من خلال البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة مثل EB1. نظرا لأن تغاير الأبجدية توبولين وفير في السيتوبلازم ، يتم طيه مباشرة ، فإن متغاير التوبولين المجاور يفتقر إلى ديناميكيات شبكات الأنابيب الدقيقة في الجسم ال...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: فهم شبكة الأنابيب الدقيقة في تقاطعات ذبابة الفاكهة العصبية العضلية 

The microtubule network is an essential component of the nervous system. Mutations in many microtubules regulatory proteins are associated with neurodevelopmental disorders and neurological diseases, such as microtubule-associated protein Tau to neurodegenerative diseases, microtubule severing protein Spastin and Katanin 60 cause hereditary spastic paraplegia and neurodevelopmental abnormalities, respectively. Detection of microtubule networks in neurons is advantageous for elucidating the pathogenesis of neurological disorders. However, the small size of neurons and the dense arrangement of axonal microtubule bundles make visualizing the microtubule networks challenging. In this study, we describe a method for dissection of the larval neuromuscular junction and muscle cells, as well as immunostaining of &#945;-tubulin and microtubule-associated protein Futsch to visualize microtubule networks in Drosophila melanogaster. The neuromuscular junction permits us to observe both pre-and post-synaptic microtubules, and the large size of muscle cells in Drosophila larva allows for clear visualization of the microtubule network. Here, by mutating and overexpressing Katanin 60 in Drosophila melanogaster,&#160;and then examining the microtubule networks in the neuromuscular junction and muscle cells, we&#160;accurately reveal the regulatory role of Katanin 60 in neurodevelopment. Therefore, combined with the powerful genetic tools of Drosophila&#160;melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Here, we present a detailed protocol to visualize the microtubule networks in neuromuscular junctions and muscle cells. Combined with the powerful genetic tools of Drosophila melanogaster, this protocol greatly facilitates genetic screening and microtubule-dynamics analysis for the role of microtubule network regulatory proteins in the nervous system.

Drosophila Larval Dissection and Fixation for Microtubule Visualization

Begin by picking out a wandering Drosophila third instar larva using long blunt forceps. Wash the larva with hemolymph-like saline, then dry it with a wipe. Next, position the larva dorsally or ventrally on a dissection dish under the stereo microscope.Depending on the tissue to be observed, opt for dorsal or ventral dissection. Pin the larva's mouth hooks and tail to maintain extended positioning. Next, add a drop of the hemolymph-like saline to prevent the larva from drying.Using dissection scissors, make a small transverse incision close to the posterior end without severing it completely. Proceed to cut along the ventral midline, moving toward the anterior end. Now insert four insect pins each into the corners of the larva.Make necessary adjustments to the insect pins to maximize the stretching of the larva. Use forceps to gently remove the internal organs while avoiding harm to the muscles. To fix the larva, immerse the carcasses in 100 L of 4%paraformaldehyde, while still affixed to the dissecting dish.After this, dismount the pins. Then transfer the sample into a 2 mL microcentrifuge tube filled with 0.2%PBST. Place the tube on a shaker for 10 minutes at 15 RPM.

ذبابة الفاكهة تشريح اليرقات وتثبيتها لتصور الأنابيب الدقيقة

Immunohistochemistry of Drosophila Larva for Microtubule Visualization

Remove the PBST and immerse the paraformaldehyde-fixed drosophila larval carcasses in a blocking agent for 40 minutes at room temperature. Replace the blocking agent with 200 microliters of the primary antibody diluted with 0.2%PBST. Leave the larvae to incubate at four degrees Celsius overnight.The next day, wash the larvae with 0.2%PBST for 10 minutes. Next, remove the PBST from the tube and add 200 microliters of diluted secondary antibody. Incubate it at ambient temperature for 1.5 hours in the dark.Introduce a nuclear dye such as TO-PRO R 3 iodide into the incubating tube for 30 minutes while staining the microtubules in the dark. Finally, rinse off the secondary antibody and the nuclear dye with 0.2%PBST for 10 minutes.

الكيمياء الهيستولوجية المناعية ليرقة ذبابة الفاكهة لتصور الأنابيب الدقيقة

Mounting and Image Acquisition of Drosophila Larval Microtubules

Begin by placing the antibody labeled drosophila larval carcasses in 0.2%PBST on a glass slide. Adjusted under the stereo microscope, ensuring that the inner surface of the larval carcass is facing up. Absorb the excess PBST solution using a wipe.Then delicately add a drop of Anti-Fade mounting medium. Next place a cover slip on the slide covering the dissected larvae slowly and gently, avoiding bubble formation. Secure the cover slip in place by applying fingernail polish around its edges.Store the slide in a dark location to minimize fluorescent attenuation. For image acquisition, use the laser scanning confocal microscope with the 63x Oil immersion objective. Then adjust the wavelength and laser power to fit the requirements of the experiment best.To identify the neuromuscular junctions and capture images of muscle four in segment A three, select a 488 nanometer laser to activate alpha tubulin or Futsch, and 546 nanometers to activate the HRP imaging track. Modify the parameters to achieve a frame size of 1, 024 by 1, 024 pixels, a digital zoom of 1.0, and an imaging interval of 0.8 micrometers. To visualize microtubules in the muscle, capture images of muscle two in the segments A three to A five as it has fewer tracheal branches.Choose a 488 nanometer laser for activating alpha tubulin and a 633 nanometer laser for activating the T3605 imaging track. Adjust the imaging parameters to a frame size of 1, 024 by 1, 024 pixels, a digital zoom of 2.0, and an imaging interval of 0.4 micrometers. Both pre-and post-synaptic microtubule organizations of the neuromuscular junction were labeled with anti-alpha tubulin.Futsch staining reflected the abundance of stable microtubules in the pre-synaptic neurons. Decreased signal intensity of anti-Futsch was observed when microtubules severing protein Katanin 60 was overexpressed in the presynaptic neurons. The staining intensity of the axon trunk was stronger than that of the branches.Katanin 60 mutations resulted in increased microtubule loops. Overexpression of Katanin 60 caused short microtubule fragments within the terminal buttons. Alpha tubulin staining demonstrated a clear network of microtubules around the nucleus.Muscle cells had a significantly increased perinuclear microtubular intensity and exhibited stronger bundles in the Katanin 60 mutant. Overexpression resulted in fragmentation of the microtubule fibers.