يود المؤلفون الاعتراف بجامعة أوتيربين لزمالات البحث الطالب الجامعي والطلاب جوائز صندوق البحوث جفك و SGK؛ وهبت النصب التذكاري الأستاذ جيلبرت هاء ميلز أوتيربين جائزة برنامج التفرغ وقسم علم الأحياء وعلم الأرض كلية البحوث والمنح الدراسية تمنح جائزة لمجلس الطعون المشترك. ومنح جفك و SGK بيرت وجين القرن هبت طالب صندوق البحوث في مجال العلوم. الكتاب يود أيضا أن نعترف بامتنان جامعة دوكين تمول "البحوث الجامعية برنامج زمالات" جفك و SGK. طلاب البحوث الجامعية السابقة جونياتا، ريان جونسون ودريبر ليندسي ساهمت الصور مجهرية للأرقام 2 و 3، على التوالي.

1-إعداد الصكوك ووسائط الثقافة والحلول وأطباق بيتري
<ol><li>اﻷوتوكﻻف المسواك في كوب 50 مل مغطاة برقائق الألومنيوم لإبقاء العقيمة.</li>
	<li>تعقيم جميع البضائع الجافة التي سيتم استخدامها (نصائح، والعصي، والأواني الزجاجية، إلخ) في اﻷوتوكﻻف. ملاحظة: تنبيه! اتبع جميع توجيهات السلامة لنموذج اﻷوتوكﻻف المستخدمة. أجهزة اﻷوتوكﻻف خطرا للتفجيرات، وحروق من البخار والاتصال مع الأسطح الساخنة والمواد ووسائل الإعلام. لسلامة اﻷوتوكﻻف، قم بعرض "الاستخدام السليم لأجهزة اﻷوتوكﻻف"34.</li>
	<li>
إعداد MS أجار (دقيق فول الصويا المانيتول (SFM))14 -تنمو الثقافات.
	<ol>
<li>إضافة 5 غ من دقيق الصويا و 5 غ من أجار إلى قارورة 1 لتر.</li>
		<li>حل 5 غ المانيتول في 250 مل ماء الصنبور والاستغناء عن في قارورة تحتوي على دقيق الصويا واجار.</li>
		<li>إضافة التوصيل الرغوة وإحباط لفتح قارورة والاوتوكلاف في 121 درجة مئوية، 15 رطل/بوصة مربعة لمدة 30 دقيقة على الأقل. تنبيه: تتلخص هذه الوسيلة بسهولة. استخدام قارورة التي يمكن أن تعقد على الأقل أربع مرات الحجم الفعلي لمرض التصلب العصبي المتعدد أجار يجري يعقم. يمكن استخدام طنجرة ضغط قياسي بدلاً من اﻷوتوكﻻف مع اعتبارات السلامة مماثلة. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام فرن الميكروويف تعقيم وسائط الإعلام والمواد إذا لم يكن الوصول إلى اﻷوتوكﻻف ممكن35،36. مدرسي المدارس الثانوية قد ترغب أيضا في التعاون مع الكليات المحلية أو الجامعات الوصول إلى إمدادات يعقم.</li>
		<li>وسائط باردة حتى مريحة بما يكفي للتعامل. كن حذراً لا بارد لفترة طويلة جداً لأن أجار يتصلب في درجة حرارة أقل من 50 درجة مئوية.</li>
		<li>صب أجار مرض التصلب العصبي المتعدد من قارورة في أطباق بتري معقمة حتى أسفل كل طبق بيتري تقريبا نصف كاملة (حوالي 25 مل من وسائل الإعلام كل طبق بيتري). واسمحوا أن يصلب قبل استخدام لوحات أجار. تخزين لوحات أجار في كيس من بلاستيك في درجة حرارة الغرفة حتى المطلوبة. ملاحظة: لوحات أجار قد أيضا تكون مخزنة في ثلاجة، خاصة إذا كان هناك حاجة للمضادات الحيوية في وسائل الإعلام.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-خط متسلسلة على لوحات للنشر
<ol><li>سلالات متسلسلة متواصلة على لوحات أجار MS للمستعمرات واحدة باستخدام أسلوب قياسي، مثل رباعي خط الأسلوب كما هو موضح في ساندرز، 201237. ملاحظة: كما يمكن حلقة إينوكولاتينج أو المسواك العقيمة. اختياري: يشيع استخدام وسائل الإعلام الأخرى للأنواع متسلسلة ، مثل R2YE، والحد الأدنى من وسائل الإعلام14.</li>
	<li>احتضان لوحات في 30 درجة مئوية.</li>
	<li>ريستريك لوحات بانتقاء مستعمرة واحدة كل 4 – 6 أيام. كمستعمرات العمر يصبحون عرضه للطفرات العشوائية.</li>
</ol>3. إنشاء مخزون Mycelial والغليسيرول لتخزين البكتيرية
ملاحظة: قد إنشاء مخزون Mycelial لجميع سلالات متسلسلة ، بما في ذلك مبادرة الخوذ البيضاء وسلالات bld ، وطفرات الإنمائية الأخرى التي غير قادر على إكمال تبوغ.
<ol><li>مسرات المستعمرات 15 – 20 في 200 – 500 ميليلتر من الجلسرين 20% استخدام قضيب وتد خشبي عقيمة.</li>
	<li>نقل الملاط متعطنين المستعمرات إلى أنبوب ثقافة الثلاجة 1.5 مل، باستخدام ميكروبيبيتي أو ماصة نقل العقيمة. ملاحظة: يتم تغطية أساسيات استخدام ميكروبيبيتي في أماكن أخرى38.</li>
	<li>إضافة والغليسيرول 20% ما يكفي لجعل وحدة التخزين النهائي 1 مل وتخلط برفق. تخزين العينات في-80 درجة مئوية. ملاحظة: تنبيه! استخدام قفازات السلامة المبردة ومعطف مختبر لحماية الجلد من الاتصال مع البرد القارس. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام ثلاجة-20 درجة مئوية مع انخفاض محتمل في وقت التخزين طويل الأجل. تجنب الإفراط تجميد والغاء تمديد صلاحية.</li>
</ol>4-إنشاء مخزون بوغ والغليسيرول لسلالات قادرة على تبوغ
ملاحظة: مخزونات بوغ هي الأفضل للاستمرار على المدى الطويل ولكن فقط قابلة للتنفيذ لسلالات قادرة على إكمال تبوغ.
<ol><li>
نشر 100 ميليلتر المواد متعطنين (من الخطوة 3.1) على صفيحة أجار للحصول على حشيش المتلاقية النمو37. ملاحظة: يظهر انتشار الطلاء في ساندرز37 (تعديل: الدوار غير مطلوب.). اللوحة يمكن أن تحول يد واحدة أثناء استخدام اليد الأخرى للتحرك الناشرة في لطيف ذهابا وإيابا الحركة عبر وسائل الإعلام أجار.<ol>
<li>بيبيت 100 ميليلتر من متعطنين الميسليوم إلى مركز صفيحة أجار مرض التصلب العصبي المتعدد.</li>
		<li>تعقيم الزجاج أو المعدن نشر أداة جزئيا غمر في الإيثانول 70% وتمرير الناشرة مرة واحدة ببطء من خلال لهب موقد بنسن لسرعة التبخر الإيثانول. تنبيه: الإيثانول من الاشتعال. لا تضع الناشرة المشتعلة في الإيثانول أو السماح بهبوط المشتعلة من الإيثانول إلى الوقوع في الطبق الإيثانول. بدلاً من ذلك، استخدم مسحه القطن معقمة المتاح لانتشار البكتيريا على اللوحة، التي لا تتطلب أي الإيثانول أو لهب.</li>
		<li>دورة أجار MS لوحة مع يد واحدة، بينما استخدام نسخة احتياطية والحركة المنصوص عليها لتطعيم اللوحة مع الناشرة العقيمة.</li>
		<li>احتضان لمدة 5-7 أيام عند 30 درجة مئوية حتى تصبح السلالة sporulated جيدا. ملاحظة: سوف تختلف أوقات الحضانة تبعاً للأنواع والسلالة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إضافة 2 مل من المحلول الملحي المعقم (0.8% كلوريد الصوديوم) إلى مركز المتلاقية حشيش متسلسلة الخلايا التي مرت بها تبوغ.</li>
	<li>حصاد جراثيم بلطف فرك سطح الميسليوم مع عقيمة تطعيم حلقة (أو برعم القطن)، ببطء التحرك نحو حافة العشب.</li>
	<li>بيبيت المالحة التي تحتوي على الجراثيم في أنبوب مخروطي 15 مل. دوامة قوة لاقتحام سلاسل سبور الخلايا الفردية.</li>
	<li>الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 2,500 تقريبا x ز.</li>
	<li>بيبيت المادة طافية وتجاهل. تفريق بيليه بوغ بالانفعالات دوامة قوية في كمية صغيرة من السائل المتبقي.</li>
	<li>ريسوسبيند الجراثيم في 1 مل الجلسرين 20% برسم الحل صعودا وهبوطاً مع ماصة.</li>
	<li>نقل المخزون بوغ والغليسيرول لأنبوب الثلاجة 1.5 مل. مخزن في-80 درجة مئوية. تحذير: استخدام قفازات السلامة المبردة ومعطف مختبر لحماية الجلد من الاتصال مع البرد القارس. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام ثلاجة-20 درجة مئوية مع تخفيض محتمل للبقاء في وقت التخزين طويل الأجل. تجنب الإفراط تجميد والغاء تمديد صلاحية.</li>
</ol>5-تؤدي الطفرات
<ol><li>تؤدي الطفرات استناداً إلى النتائج المرجوة المشار إليها في مقدمة واستعرضتها مؤخرا بالتز، 201639. ملاحظة: لن تحتاج بعض التجارب phenotyping الطفرات، مثل النية في التعرف على أنواع جديدة من البيئة. وتشمل أساليب الطفرات العشوائية استخدام الأشعة فوق البنفسجية، ينقول8،،من910،11،،من1213أو14من المواد الكيميائية. موقع الموجه الطفرات15،،من1617،،من1819،20 تقنيات يمكن استخدامها لخلق طفرات نقطة محددة، الحذف، أو أنواع أخرى من الطفرات.</li>
</ol>6-مقارنة وتسجيل المظهر المرئي
<ol><li>يحيط علما مورفولوجيا مستعمرة لكل متحولة بالمقارنة مع سلالة البرية من نوع الأصل بعد streaking جميع سلالات كما في الخطوة 2. قارن عزل جديدة للأنواع المدروسة جيدا، مثل كويليكولور س أو س. فينيزويلاي، عندما وصف أنواع متسلسلة جديدة. ملاحظة الخصائص (الشكل 1) مثل الشكل الأساسي، السطحية من مستعمرة (غامض، أصلع، التجاعيد، إلخ)، العتامة، والارتفاع وتصبغ (التمييز بين الخضري الميسليوم والميسليوم الجوية المتوسطة المحيطة بها).</li>
	<li>قم بتسمية أجار مرض التصلب العصبي المتعدد السلالات البرية من نوع ومتحولة لوحة والانتصارات في أنماط آسفين (الشكل 1). كن حذراً من أن يمس لا سلالة سلالة أخرى لتجنب التلوث المتبادل. ملاحظة التاريخ والوقت التي هي السنة اللهب أثناء الضغوط على اللوحة. احتضان اللوحات في 30 درجة مئوية.</li>
	<li>مكان نمت أطباق بيتري الملونة أو ورق أبيض مجانسة الخلفية. الكتابة على الورق اسم السلالة، والتاريخ ودرجة حرارة الحضانة، والوقت من أول لوحة streaking. تأخذ الرقمية صورة (ق) من اللوحة المعلومات الأخيرة مكتوب على خلفية الورقة بحيث يتم تصغير الارتباك. ملاحظة: الكتابة يمكن اقتصاص من الصورة في وقت لاحق إذا كان يمكن استخدامها لإعداد الشكل.</li>
</ol>7-إجراء الفحص المجهري مرحلة التباين
<ol><li>تعقيم ملاقط الغسيل في الإيثانول 70% وثم يمر لهب موقد بنسن تتبخر في الإيثانول. السماح لتبرد.</li>
	<li>تعقيم كوفيرسليبس بالغسيل في الإيثانول 70% ومن ثم السماح لهم الجافة في طبق بتري معقم.</li>
	<li>
إعداد رفع ساترة للنمو الجرثومي لفحصها.
	<ol>
<li>تلتقط ساترة عقيمة مع ملاقط معقمة ومكان ساترة على صفيحة أجار مرض التصلب العصبي المتعدد التي يكون فيها النمو البكتيرية كثيفة. اضغط على الجزء الخلفي ساترة بلطف مع ملاقط لضمان نقل كافية من الجراثيم البكتيرية وجوي الميسليوم.</li>
	</ol>
</li>
	<li>التقاط ساترة من اللوحة ووضعه حيث تواجه الجانب مع مواد الخلية نحو سطح شريحة المجهر، مع انخفاض 15 ميليلتر من والغليسيرول 50% أعدت في المياه للتركيب. تقليل فقاعات الهواء عن طريق وضع ساترة بزاوية 45° إلى الشريحة والسماح لها تقع على والغليسيرول 50%.</li>
	<li>(اختياري) الختم مع مسح الأظافر للمحافظة على الشريحة.</li>
	<li>
إجراء الفحص المجهري التباين المرحلة كما وصفها فروهليش40 في فترات زمنية مختلفة خلال دورات الحياة. ملاحظة: يسمح التصوير المتكرر لإجراء تحليل أكثر اكتمالا والقدرة على الكشف عن حالات التأخير في عملية التنمية. كرر الملاحظات التأكد من دقتها وإمكانية تكرار نتائج بشكل مستقل.<ol>
<li>ضع الشريحة المعدة في مرحلة مجهر وإضافة قطره زيت الغمر إلى مركز بكشف الغطاء. قم بتدوير المرحلة X 100 الهدف في مكان وتعيين البرج مكثف للإعداد المرحلة "مطابقة" الصحيح. وتركز الصورة باستخدام مقبض تسوية غرامة فقط بمجرد العدسة الهدف على اتصال النفط.</li>
		<li>دراسة عدة حقول النظر تمييز اختلافات ملحوظة واتساقا بين سلالات متحولة ونوع البرية، مثل القدرة على شكل جراثيم وبوغ الحجم والشكل والعدد الكلي للجراثيم (انظر الشكل 2). ملاحظة: تشمل البدائل للتباين مرحلة الفحص المجهري تدخل فرق التباين (DIC) مجهرية40 وتقنيات المصبوغة بسيطة لاستخدامه مع الحقل مشرق مجاهر41، مثل صبغة الكريستال البنفسجي.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8-إجراء الفحص المجهري الأسفار
<ol><li>تعقيم الملقط بالغسيل في الإيثانول 70% ومن ثم تشغيل عن طريق لهب موقد بنسن.</li>
	<li>تلتقط ساترة عقيمة مع ملاقط معقمة ومكان على صفيحة أجار MS حيث يتجلى النمو الجرثومي. لمس الجزء الخلفي من ساترة بلطف مع ملاقط لضمان نقل كافية من الجراثيم البكتيرية وخيوط الجوي.</li>
	<li>التقاط ساترة من اللوحة ووضعه حيث تواجه الجانب مع مواد الخلية، على البطاقات لسهولة التلاعب ساترة.</li>
	<li>الفيضانات في ساترة مع الميثانول المثلج (~ 300 ميليلتر ساترة2 20 x 20 مم) والسماح لها تماما من الهواء الجاف. تنبيه: من الميثانول مطفر. تجنب الاتصال المباشر مع الجلد.</li>
	<li>أغسل ساترة ثلاث مرات في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)42 قبل صرفها بلطف وإزالة الحل.</li>
	<li>إضافة 15 ميليلتر من 100 ميكروغرام/مل يوديد Propidium و/أو مترافق 10 ميكروغرام/مل القمح-جرثومة-أجلوتينين إلى fluorescein isothiocyanate (WGA-فيتك) قدم في الجلسرين 50% على شريحة مجهر مسمى. ملاحظة: يوديد Propidium بقع الحمض النووي الحمراء للكشف عن الكروموسومات الحمض النووي الموقع بينما فيتك وغ البقع الخلية جدار أخضر.</li>
	<li>عكس ساترة الوجه للأسفل على قطره من الفلورسنت وصمة عار على الشريحة الزجاجية. (اختيارياً) ختم مع طلاء الأظافر واضحة للحفاظ على الشريحة.  كما الصبغات حساسة للضوء، احتضان لمدة 15 دقيقة في غرفة مظلمة أو الخافتة.</li>
	<li>مراقبة الشرائح تحت عدسة هدف X 100 استخدام مرحلة التباين أو المجهر DIC مجهزة ابيفلوريسسينسي الإثارة مكعبات يوديد propidium (تعيين عامل التصفية 'تكساس الأحمر' أو ماكسيما الإثارة/الانبعاثات نانومتر 535/617) وفيتك (فيتك تصفية مجموعة أو 490/525 نانومتر ماكسيما الإثارة/الانبعاثات).</li>
	<li>ضع الشريحة على خشبة المسرح والتركيز باستخدام المقابض التكيف الخشنة وغرامة.</li>
	<li>مراقبة الأسفار كما هو موضح في مكان آخر من43.</li>
	<li>استخدام حزمة برامج تحليل صور حرة التي يمكن أن تساعد في التعرف على الجراثيم مع انخفاض كثافة fluorescence44.</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

نقدم هنا البروتوكولات لبداية الباحثين متسلسلة الشروع في إجراء دراسات بما في ذلك الخطوات اللازمة لنشر السلالات وإعداد الأرصدة للتخزين على المدى الطويل. ثم يصف لنا البروتوكولات لتوصيف المرئية والمجهرية من سلالات متسلسلة . بعض الخطوات الأولية النموذجية في طفرات إنمائية phenotyping: 1) الفحص البصري للمستعمرات متحولة مقارنة بنوع البرية المستعمرات في أجار المتوسطة؛ 2) مجهرية مرحلة التباين؛ و 3) الأسفار مجهرية من خيوط فطرية جوي سبوروجينيك. استناداً إلى النمط الظاهري المعروضة في هذه الخطوات الثلاث، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من التقنيات زيادة تمييز النمط الظاهري لسلالة معينة.
التجارب الأولية phenotyping تستخدم عادة لوصف الأنواع الجديدة، وتحديد طفرات فائدة، وجزئياً تميز طفرات وتبدأ تبين دور نموذجي لجين معين على النمط الظاهري للمسخ التي تم تحديدها أساس. الأساليب الموصوفة هنا سبق استخدامها في المختبرات تحديد وتوصيف مجموعة متنوعة واسعة من طفرات متسلسلة ، بما في ذلك الذين يعانون من عيوب في انقسام الخلية48،49، التدريس في الجامعات 50 , 51 , 52 , 53 , 54وتبوغ55،56، الميسليوم الجوي تشكيل57،58، إنتاج المضادات الحيوية59، والثاني رسول مما يشير إلى47والعزل الصبغي 60-هذه التقنيات هي الخطوات الأولى حيوية لتحديد النمط الظاهري طفرات بشكل عام والكشف عن كمية كبيرة من معلومات هامة عن الأدوار للجينات للفائدة. الأساليب التي يمكن أن تمتد بسهولة إلى الأنواع الأخرى من متسلسلة وقد استخدمت فعلا لوصف سلالات من غريس س. س. فنزويلا، الجرب س.والعديد من ستريبتوميسيتيس الأخرى. ومن المتوقع البروتوكولات الفيديو الموضحة هنا بمثابة مورد هام للباحثين الجديد دخول مجالات بحوث متسلسلة ، كما هو الحال في مجال اكتشاف الأدوية. ويشمل ذلك المعلمين الجديدة الذين يعملون على مكافحة الأزمة المقاومة للمضادات الحيوية، وتثقيف عدد لا يحصى من الباحثين الطلاب الجامعيين الجديد الانضمام إلى جهود crowdsourcing المبادرة العالمية الصغيرة.
يمكن تكييفها بسهولة للاستخدام الفصول الدراسية الكليات والمدارس الثانوية بالإضافة إلى مختبرات الأبحاث، بإدخال التعديلات المذكورة في الفيديو والنص باستخدام التقنيات الموضحة هنا. الطلاب في الوحدة نمطية مجهرية سنة أولى في كلية فنون الحرة صغيرة كانت قادرة على متتالية السلالات، والتقاط صور فوتوغرافية رقمية من السلالات التي تزرع في وسائل الإعلام أجار، وإجراء الفحص المجهري والمرحلة-على النقيض من الأسفار، التي توجت بتقديم مجموعة أرقام نصب منصة متعددة في نهاية الوحدة النمطية 3 أسابيع، يمثلون 15 ح العمل بالمعمل. حوالي 160 من طلاب السنة الأولى مسؤولة عن فينوتيبينج الأولى من 320 ينقول رواية طفرات. شارك طلاب البحوث الجامعية في المؤسسات الثلاث في فينوتيبينج الأولى من طفرات إضافية وتوصيف اللاحقة لكثير من السلالات. وتوضح البيانات الشاملة التي تم الحصول عليها في فترة قصيرة نسبيا من الزمن، قيمة البروتوكولات المذكورة هنا. تم تخزين مئات طفرات إضافية كمخزون mycelial والغليسيرول لتوصيف المستقبل.
في أعقاب التجارب الأولية الموضحة هنا، يجوز مجموعة متنوعة من الأساليب لتوسيع نوعية المعلومات المتصلة بسلالات فائدة. إذا كانت الطفرة غير معروف، وينبغي استخدام أسلوب التنميط لتحديد نوع و/أو موقع من الطفرة. على سبيل المثال، ينقول عشوائية الطفرات البرية من نوع الكروموسوم6،،من78،9،10،11،12،13 النتائج في المستعمرات التي ينبغي أن يخضع لها الأولية شاشات المظهرية مثل التي ورد وصفها أعلاه. ثم ينبغي أن تحدد موقع ينقول استخدام تقنية مثل معكوس بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (إيبكر)61. تحديد النمط الوراثي لطفرات المكتشفة حديثا خطوة هامة بعد توصيف الأولية.
وتشمل بعض أساليب متقدمة تستخدم عادة لتحليل phenotyping اللاحقة التي يمكن ذكرها في الفصول الدراسية أو استكشافها من خلال إجراء مزيد من البحوث البروتين الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) وضع علامات لتحديد أنماط الترجمة لبروتين الاهتمام، تحليل تعبير الجينات مثل الحقيقي الوقت PCR الكمي (qPCR) وأنماط التعبير الجيني العالمي البرية من نوع مقابل المسخ عبر "تسلسل الحمض النووي الريبي" (الرنا-seq). Phenotyping مهارات مطلوبة أيضا لتحليل التكامل الوراثية. في تجربة تكامل، هو عرض النسخة البرية من نوع من الجينات إلى سلالة تحور لتحديد ما إذا كان اليل المضافة حديثا يمكن أن تعوض عن فقدان الوظيفة اليل تحور. مقارنة النمط الظاهري سلالة تستكمل المسخ الأصلي والوالدين، لا بد من السلالة البرية من نوع.

ستريبتوميسيتيس بكتيريا التربة إيجابية والخيطية معروفة بقدرتها على إنتاج مجموعة متنوعة من نواتج الأيض الثانوية، بما في ذلك ما يزيد على ثلثي المضادات الحيوية المتاحة تجارياً، كذلك كما المضادة للورم، العقاقير المضادة فيروس نقص المناعة البشرية، ومكافحة الطفيليات 1. س. كويليكولور هو العضو الأكثر وراثيا تتسم2،جنس3 والأنواع المستخدمة في الأساليب الموصوفة هنا. وقد س. كويليكولور دورة الحياة معقدة التي تبدأ الإنبات بوغ مفرد، تتقدم إلى الميسليوم الخضري واسعة النطاق، والتفريع ينمو في المتوسط أجار. كما تمضي حياتها، تتشكل خيوط الجوي كسر التوتر السطحي من الميسليوم الركيزة، وأخيراً تنقسم إلى سلاسل طويلة من الخلايا التي يتم تحويلها في نهاية المطاف إلى أبواغ ناضجة، مصطبغة غراي. تشتت هذه الجراثيم شكلت حديثا يشكل بداية دورة الحياة المقبلة4.
بسبب نمط معقد من التمايز، كويليكولور س. يقدم نموذجا ممتازا لدراسة التطور الجرثومي. تاريخيا، الطفرات تؤدي إلى كتل اثنين المراحل الرئيسية للتنمية وتتمخض تعمل بصرية متميزة. يتم حظر طفرات (أصلع) bld لتشكيل الميسليوم الجوي وتؤدي إلى عدم وجود الميسليوم جوي غامض إضفاء مظهر مستعمرة "أصلع". تحول دون طفرات في تشكيل بوغ ونضوج يشار إليها كطفرات مبادرة الخوذ البيضاء (أبيض) نظراً لأنها تفشل عادة لإنتاج مستويات البرية من نوع من الصباغ سبور رمادي والميسليوم الجوي لا تزال بيضاء. يتم تثبيط طفرات أخرى مثيرة للاهتمام في إنتاج المضادات الحيوية، انقسام الخلية، والعزل الصبغي أو غيرها من العمليات الهامة54،.
وعلى الرغم من اكتشاف العديد من الجينات التنموية في الأنواع متسلسلة ، هناك العديد من أكثر يعتقد أنها موجودة استناداً إلى عدم تشبع شاشات المسخ. مختبراتنا مواصلة تحديد الجينات الإنمائية الجديدة باستخدام نظام ينقول المصغر بأننا قد شيدت. رواية سلالات متحولة معزولة في تجارب عشوائية الطفرات مع لدينا ينقول الخضوع للفحص المظهرية تحديد الدور المحتمل لكل اكتشاف الجينات الجديدة6،7. أساليب فينوتيبينج البكتيرية الموصوفة هنا ذات الصلة بطفرات متسلسلة معزول بواسطة ينقول الطفرات8،،من910،،من1112، 13 وغيرها من الأساليب العشوائية، مثل المواد الكيميائية والبنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الطفرات14، فضلا عن تشييد الموجه الطفرات مثل الحذف الجينات باستخدام ريكومبينيرينج15،16 أو تحرير التكنولوجيا17،،من1819 والطفرات20الجينوم كريسبر-Cas9 (تجمع بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب يكرر).
وعندما تصبح المقاومة للمضادات الحيوية بين مسببات الأمراض أكثر انتشارا، تصبح الحاجة إلى المضادات الحيوية الجديدة يزداد إلحاحا21،22. "المبادرة العالمية الصغيرة" (أو مؤسسة) هو العلم والتكنولوجيا، والهندسة والرياضيات (الجذعية) فعالية التعلم23 والبحوث الاستراتيجية24 لمكافحة المقاومة للمضادات الحيوية من خلال crowdsourcing من طلاب الجامعات، وأكثر مؤخرا من طلاب المدارس الثانوية. دعم دورات العمل ويتضمن تحديد جراثيم التربة الجديدة التي تنتج رواية المضادات الحيوية (http://www.smallworldinitiative.org). ويعتقد أن مصدرا رئيسيا للمضادات الحيوية غير المكتشفة سوف تستمر لتكون متسلسلة الأنواع الموجودة في مجموعة واسعة من التربة والمياه الموائل25،،من2627،28، ،من 2931. مؤخرا، اكتشف المختبر وعمل الآخرين وتتميز الإشارات الجينات في متسلسلة من الأنواع التي تنظم مورفولوجيا والتنمية، بما في ذلك إنتاج المضادات الحيوية7،32، 33. التغييرات في هذه الجينات يؤدي إلى تغيير في مقدار وتوقيت للمضادات الحيوية التي تنتجها. سيظل فينوتيبينج المهرة من الأنواع الجديدة وطفرات جديدة منتجة للمضادات الحيوية الهامة. جديد من المعلمين والطلاب أصبحت المساهمين الرئيسيين في مجال اكتشاف الأدوية، التدريب في فينوتيبينج البكتيرية أمر ضروري لنجاح هؤلاء الأفراد المبتدئين. وعلاوة على ذلك، هذه التجارب أصعب للمدرسة الثانوية الجذعية أو جامعة الميكروبيولوجيا مختبرات التعليم. وهي تمثل تظاهرة مبادئ الجينية الميكروبية الأساسية في مختبر تدريس الإعداد.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="543">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:197px;">50% Glycerol</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">G5516</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Immersion Oil (Type DF)</td>
			<td>Cragille&#160;</td>
			<td>16482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lens Paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11-995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Water</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>G-3250-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Toothpicks (flat)</td>
			<td>Target</td>
			<td>081-22-1957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Tips (10 ml)</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1240-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Tips (200 ml)</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1240-200Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Tips (1250 ml)</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1240-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Wooden Applicators 6&#39;&#39;</td>
			<td>Solon Care</td>
			<td>070809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton Swabs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Soy Flour&#160;</td>
			<td>Bob&#39;s Red Mill&#160;</td>
			<td>1516C164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol 100%</td>
			<td>VWR amresco life science&#160;</td>
			<td>0854-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.8% NaCl (Saline)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBB9000V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.2 mL freezer tube</td>
			<td>NEST</td>
			<td>606101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultra low (-80&#176;C) freezer</td>
			<td>SO-LOW</td>
			<td>U85-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cryo Safety Gloves</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>H13201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri dishes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5856-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover slips #1.5</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>64-0721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Slides</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>63-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>2540E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phase-Contrast Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>624504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bunsen Burner</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>706706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS (phosphate buffer saline)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">WGA-FITC</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29022-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Clear nail polish</td>
			<td>OPI</td>
			<td>22001009000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Free Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 mL beaker</td>
			<td>Pyrex USA</td>
			<td>1000-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 L beaker</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>721253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 L flask</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S63274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 mL flask</td>
			<td>Pyrex USA</td>
			<td>4980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 mL graduated cylinder</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>721788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">500 mL graduated cylinder&#160;</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>721792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stir Bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-271825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera for Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nitrile Examination Gloves (Med)</td>
			<td>Bio Excell</td>
			<td>71011002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>701077</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visual and microscopic evaluation of streptomyces developmental mutants

ستريبتوميسيتيس هي بكتيريا التربة الخيطية المنتمين للأسرة في اللغات أكتينوباكتيريا التي يتم العثور عليها في جميع أنحاء العالم، وتنتج مجموعة واسعة من المضادات الحيوية وغيرها من نواتج الأيض الثانوية. وهو كويليكولور متسلسلة نوع تتسم جيدا، غير ممرضة قابلة لمجموعة متنوعة من التحليلات في المختبر. استخدام phenotyping الأساليب الموصوفة هنا كويليكولور س. كطراز ستريبتومايسيت؛ الأساليب غير المنطبقة على جميع أعضاء هذا جنس كبيرة، فضلا عن بعض أكتينوميسيتيس ارتباطاً وثيقا. فينوتيبينج ضروري لوصف الأنواع الجديدة من متسلسلة محددة في البيئة، وأيضا خطوة أولى حيوية في وصف سلالات متحولة المعزولة حديثا من متسلسلة. إجادة اللغة فينوتيبينج مهم للباحثين الجديد العديد من الذين يدخلون ميدان بحوث متسلسلة ، الذي يتضمن دراسة التنمية البكتيرية وانقسام الخلية والعزل الصبغي ورسول الثاني يشير إلى. Crowdsourcing مؤخرا من اكتشاف المضادات الحيوية من خلال عزل جراثيم التربة الجديدة قد أدى ازدياد حاجة إلى التدريب في فينوتيبينج للمعلمين الجديدة في مجال بحوث متسلسلة وكلية أو مدرسة ثانوية الطلاب. ويصف هذه المخطوطة أساليب إكثار السلالة البكتيرية وتخزينها، وتوصيف من خلال الفحص المجهري والبصرية. بعد قراءة هذه المادة، الباحثين جديدة (مختبرات تعليم علم الأحياء المجهرية والعلماء مواطن) ينبغي أن تكون قادرة على التعامل مع الضغوط متسلسلة وتبدأ التجارب البصرية توصيف.

تجارب phenotyping الأولية اللازمة لوصف أنواع جديدة وسلالات ويمكن استخدامها كنهج المجاملة للسلالات وتجارب التهجين الحمض النووي الحمض النووي التي يتم استخدامها لوصف الأنواع الجديدة. طفرات متسلسلة الناتجة عن الطفرات العشوائية في أساليب مثل الكيميائية والأشعة فوق البنفسجية، أو يتم تحديد الطفرات ينقول عادة من خلال الشاشات المرئية المباشرة، وعلى لوحات أجار. ويتم فحص المستعمرات من متسلسلة للتغييرات في النمط الظاهري بالمقارنة مع سلالة البرية من نوع، والوالدين. على سبيل المثال، الميسليوم جوي ملونة أخف قد تشير إلى مستوى أقل من الصبغة الرمادية الناجمة عن عيب في تبوغ، أو الافتقار إلى مظهر غامض إرشادي لكتلة في تشكيل الميسليوم الجوي (الشكل 1). ستريبتوميسيتيس العديد من إنتاج المضادات الحيوية المصطبغة في الميسليوم الخضري أو أجار المحيطة بها. كويليكولور س. ينتج اثنين من المضادات الحيوية المصطبغة فضلا عن اثنين منها غير مصطبغة. أكتينورهودين مضاد حيوي مصطبغة الأزرق وهو أونديسيلبروديجيوسين المضادات الحيوية مصطبغة أحمر45. ثم يتم نشر السلالات التي مرت بشاشات مستعمرة البصرية الأولية من streaking للمستعمرات واحدة.
بعد تحديد هوية بصرية يحتمل أن تكون مثيرة للاهتمام طفرات، سلالات تخضع للفحص المجهري. المرحلة--تباين مجهرية مناسبة خاصة لدراسة طفرات متسلسلة لعيوب الإنمائية، باستخدام سلالة البرية من نوع كعنصر تحكم (الشكل 2). عادة إنتاج نوع البرية كويليكولور س. المستعمرات الميسليوم جوي قبل حوالي يومين نمو عند 30 درجة مئوية في أجار مرض التصلب العصبي المتعدد، وسلاسل طويلة من جراثيم قبل ثلاثة أيام نمو. وسوف تقدم دورة الحياة قليلاً أبطأ أو أسرع في أنواع أخرى من وسائل الإعلام. من الضروري أن يتم تحليلها طفرات ظروف النمو نفسه كنوع البرية عند استخلاص النتائج بشأن العيوب التنموية والتأخير. قد تنتج طفرات أصلع جراثيم بعد النمو المطولة في أجار وسائط الإعلام. فئة من طفرات يشار إلى طفرات الأبيض قد تتأخر أما لتشكيل بوغ، تشير إلى انخفاض في وفرة الجراثيم المنتجة، إنتاج جراثيم بعيوب الشكل و/أو الحجم، أو ببساطة إنتاج مستويات أدنى من الصباغ بوغ ناضجة، والرمادي46 . قد يتأخر طفرات أخرى التحقيق فيها حتى الآن أو تسارع في تطور دورة الحياة مثل طفرات المتأثرة لتراكم إشارات الجزيئات (مثلاً، GMP دي دوري47).
متابعة بسيطة لتقنية مجهرية الخفيفة الموصوفة أعلاه مجهرية الفلورية استخدام يوديد propidium وصمة عار الصبغية الحمض النووي نوكليويدس وجنين القمح فلوريسسينتلي المسمى أجلوتينين بوصمة عار جدار الخلية سيتا تبوغ. الجراثيم التي تفتقر إلى كروموسوم ستكون خالية من يوديد propidium الأحمر تلطيخ، بينما الجراثيم التي تحتوي على الحمض النووي أقل من المعتاد ويمكن تحديد إذا كان يبدو أنها قد انخفضت تلطيخ (الشكل 3). يمكن أن تستخدم أجلوتينين جرثومة القمح وصمة عار جدار الخلية ويمكن ملاحظة الاختلافات في جدار الخلية تلطيخ أنماط (أي، عيوب انقسام الخلية). في سلالة الرقم 4 البرية من النوع من أنواع المستخدمة مؤخرا كنموذج آخر من س. فينيزويلاي، ستريبتومايسيت بسبب سرعة دورة الحياة والقدرة على سبورولاتي في45من السائل، قد تم ملطخة إلى فيتك وغ توضيح صفيف مثل سلم سيبتا الشعبة التي ينظر إليها عادة وقت مبكر خلال تبوغ.
استراتيجيات phenotyping الأولى الموصوفة هنا ينبغي أن يسفر عن ما يلي: 1) تحديد سلالات متحولة من اهتمام لمزيد من الدراسة؛ 2) اكتساب المعارف حول المسخ المحددة حديثا والدور المحتمل للجينات التي قد تم تحور؛ 3) بوضع سلسلة لاحقة من الخطوات التجريبية التالية التي يمكن استخدامها لزيادة توضيح دور الجينات في السؤال. في حالة ستريبتومايسيت محددة حديثا من البيئة، الباحث سوف اكتساب المعرفة للأنواع الجديدة المحتملة مقارنة بالفعل تتميز الأنواع من متسلسلة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig1.jpg"> الشكل 1: صورة فوتوغرافية للوحة أجار الممثل يدل تعمل مستعمرة عيانية من س. كويليكولور. لوحة أجار يبين غامض، سلالة رمادية المظهر المرئي الميسليوم الجوي للبرية من نوع كويليكولور س. MT1110 (وزن) بالمقارنة مع طفرات الإدراج ينقول عشوائية مختلفة مع تعمل التنموية. أما تفتقر إلى طفرات الميسليوم جوي [أصلع (bld)] أو الميسليوم جوية مع انخفاض بوغ تصبغ [الأبيض (whi)]. طفرات ينقول تم إنشاؤها باستخدام Tn5 مصغرة للإدراج الطفرات6،7. السلالات كانت تزرع في أجار مرض التصلب العصبي المتعدد لمدة 5 أيام في 30 درجة مئوية. طبق بيتري قطر 100 ملم.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig2.jpg"> الشكل 2: ميكروجرافس التباين مرحلة عرض ممثل الجوية خيوط للمسخ س. كويليكولور الأبيض سلالات ينقول العشوائية التي تحتوي على الإدراج الطفرات. (أ) تظهر هي ممثلة البري نوع خيوط جوي التي شهدت انقسامات الخلية متزامن، متباعدة بانتظام، المنتجة بالتساوي على شكل وحجم الجراثيم (MT1110). (ب–و) وتظهر اللوحات المتبقية تعمل مجهرية مختلفة إلى حد كبير من طفرات الأبيض المختلفة التي كانت معزولة عن طريق الطفرات ينقول عشوائي. تظهر لوحة ب خيوط جوية التي مرت لا تبوغ، ولكن بدلاً من ذلك قد أنتجت المناطق المنتفخة داخل الشعيرة. تشير الأسهم طويلة في ج ود، وواو إلى جراثيم طبيعي الكبيرة التي تتميز بها طفرات MIC42 و MIC43 و TH49. يشير السهم القصير في لوحة د إلى مثال من حجرة بوغ تفكيك. تظهر لوحة ه المقصورات أصغر مقيدة جزئيا التي نموذجية من سلاسل سبور تنتجها المسخ TH10. السلالات كانت تزرع في أجار مرض التصلب العصبي المتعدد لمدة 5 أيام في 30 درجة مئوية. طفرات لا علاقة لها بما هو مبين في الشكل 1. بوغ نوع البرية هو حوالي 1.1 ميكرون على محور طويل. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2.jpg"> الشكل 3: ميكروجرافس الممثل عرض كروموسوم متحولة كويليكولور س. تعمل التفرقة. (أ) بالرسم التخطيطي التمثيل يظهر مظهر المصبوغة البرية من نوع، ومتباعدة بشكل منتظم نموذجي لسلسلة من الجراثيم (كل بوغ تحتوي على الحمض النووي الكروموسومات) مقارنة بنمط المصبوغة المتقطع للمسخ الذي يعرض الكروموسوم عيب التفرقة. (ب) تبين كل زوج من الألواح بوغ نفس السلسلة لاحظ التباين التدخل التفاضلية (DIC) الصورة على اليسار وتظهر صورة fluorescence الملطخة يوديد propidium على الحق. تتم مقارنة النمط الظاهري البرية من نوع (، ب) هما طفرات الإدراج ينقول عشوائية (جو دال و هاء، واو). تشير الأسهم إلى جراثيم تخلو من الحمض النووي. السلالات كانت تزرع في أجار مرض التصلب العصبي المتعدد لمدة 5 أيام في 30 درجة مئوية. طفرات سيظهر لا علاقة لها بتلك التي في الشكل 1 و الشكل 2. مقياس بار = 1 ميكرومتر. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3.jpg"> الشكل 4: صورة مجهرية Fluorescence فنزويلا س. البرية من نوع السلالة ملطخة وغ فيتك. (A) بمخطط خيوط الجوي يظهر السلس مع لا المسافات البادئة، وأي علامات مرئية من تبوغ استخدام الفحص المجهري مرحلة التباين بالمقارنة مع صفيف مثل سلم لتلطيخ جدار الخلية التي تشير إلى مرحلة مبكرة من تبوغ بدأت في هذه الشعيرة نفس استخدام وغ فيتك تحت مجهر الأسفار. (ب) ميكروجرافس من البرية من نوع س. فينيزويلاي. () خيوط الجوي السلس موجودة بين سلاسل من الجراثيم. (ب) داخل الميسليوم يظهر في لوحة أ، أحد خيوط الجوي في مرحلة مبكرة من التنمية تمتلك مجموعة مثل سلم من ترسب جدار الخلية. تشير الأسهم إلى تشكيل متباعدة بانتظام عبر الجدران ملطخة فيتك وغ أن تطوير شكل متزامن ضمن خيوط جوي واحد كما أنه يخضع تبوغ المرتبطة تنمويا. وقد نمت السلالة على أجار MYM MYM (التوسيم، واستخراج الشرق Y، واستخراج البديل م) عن ح 38 في 30 درجة مئوية. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants at JoVE.com

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

التقييم المرئية والمجهرية من طفرات إنمائية متسلسلة

هنا نقدم البروتوكولات للمبتدئ الباحثين لبدء فينوتيبينج لجنس البكتيرية الهامة عقاقيري متسلسلة.

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

visual-microscopic-evaluation-streptomyces-developmental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

17.6K Views.  Otterbein University. هنا نقدم البروتوكولات للمبتدئ الباحثين لبدء فينوتيبينج لجنس البكتيرية الهامة عقاقيري متسلسلة.

Video: Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the flexibility of a VA approach in the analysis of biological datasets. Examples of these datasets in immunology include flow cytometry, Luminex data, and genotyping (e.g., single nucleotide polymorphism) data. Contrary to the traditional information visualization approach, VA restores the analysis power in the hands of analyst by allowing the analyst to engage in real-time data exploration process. We selected the VA software called Tableau after evaluating several VA tools. Two types of analysis tasks analysis within and between datasets were demonstrated in the video presentation using an approach called paired analysis. Paired analysis, as defined in VA, is an analysis approach in which a VA tool expert works side-by-side with a domain expert during the analysis. The domain expert is the one who understands the significance of the data, and asks the questions that the collected data might address. The tool expert then creates visualizations to help find patterns in the data that might answer these questions. The short lag-time between the hypothesis generation and the rapid visual display of the data is the main advantage of a VA approach.

Visual analytics (VA) is a new approach of analyzing data interactively. In this video, we discuss the data overload problem brought on by high-throughput biological experiments, and propose VA as a solution to such problem. The video demonstrates analysis within and between immunological datasets using a VA tool called Tableau.

تيسير تحليل البيانات مناعية مع التقنيات التحليلية البصرية

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

شاشة الوراثية لعزل التوكسوبلازما جوندياي المسوخ الخروج المضيف الخلية

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

A الفحص المرئي لمراقبة T6SS بوساطة المسابقة الجرثومي

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

عالية الإنتاجية الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR الفحص لتحديد ملامح التعبير من أنواع الأول والثالث الانترفيرون الأنواع الفرعية

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; المسوخ ينقول

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

تقييم الدالة حويصلة خارج الخلية أثناء الإصابة بالملاريا

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and sectioning of intact microbial colony biofilms using perfused paraffin wax. To adapt this method for use on colony biofilms, we developed techniques for maintaining each sample on its growth substrate and laminating it with an agar overlayer, and added lysine to the fixative solution. These optimizations improve sample retention and preservation of micromorphological features. Samples prepared in this manner are amenable to thin sectioning and imaging by light, fluorescence, and transmission electron microscopy. We have applied this technique to colony biofilms of Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, and Vibrio cholerae. The high level of detail visible in samples generated by this method, combined with reporter strain engineering or the use of specific dyes, can provide exciting insights into the physiology and development of microbial communities.

We describe fixation, paraffin embedding, and thin sectioning techniques for microbial colony biofilms. In prepared samples, biofilm substructure and reporter expression patterns can be visualized by microscopy.

تضمين البارافين وتمزيقها رقيقة من الأغشية الحيوية الميكروبية مستعمرة للتحليل المجهري

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

النسخ المتماثل لمطلوب، "مكتبة نونريدوندانت" من سلالة الزّنجاريّة Pseudomonas PA14 ينقول طفرات الإدراج

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

الاستخدام التكميلي للتقنيات المجهرية والقراءة الفلورية في دراسة تفاعلات Cryptococcus-Amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a vaccine, VACV has been developed as a vector for therapeutic vaccines and as an oncolytic virus. These applications take advantage of VACV&#8217;s easily manipulated genome and broad host range as an outstanding platform to generate recombinant viruses with a variety of therapeutic applications. Several methods have been developed to generate recombinant VACV, including marker selection methods and transient dominant selection. Here, we present a refinement of a host range selection method coupled with visual identification of recombinant viruses. Our method takes advantage of selective pressure generated by the host antiviral protein kinase R (PKR) coupled with a fluorescent fusion gene expressing mCherry-tagged E3L, one of two VACV PKR antagonists. The cassette, including the gene of interest and the mCherry-E3L fusion is flanked by sequences derived from the VACV genome. Between the gene of interest and mCherry-E3L is a smaller region that is identical to the first ~150 nucleotides of the 3&#8217; arm, to promote homologous recombination and loss of the mCherry-E3L gene after selection. We demonstrate that this method permits efficient, seamless generation of rVACV in a variety of cell types without requiring drug selection or extensive screening for mutant viruses.

This is a method to generate &#8220;scarless&#8221; recombinant vaccinia viruses using host-range selection and visual identification of recombinant viruses.