يود المؤلفون الاعتراف بجامعة أوتيربين لزمالات البحث الطالب الجامعي والطلاب جوائز صندوق البحوث جفك و SGK؛ وهبت النصب التذكاري الأستاذ جيلبرت هاء ميلز أوتيربين جائزة برنامج التفرغ وقسم علم الأحياء وعلم الأرض كلية البحوث والمنح الدراسية تمنح جائزة لمجلس الطعون المشترك. ومنح جفك و SGK بيرت وجين القرن هبت طالب صندوق البحوث في مجال العلوم. الكتاب يود أيضا أن نعترف بامتنان جامعة دوكين تمول "البحوث الجامعية برنامج زمالات" جفك و SGK. طلاب البحوث الجامعية السابقة جونياتا، ريان جونسون ودريبر ليندسي ساهمت الصور مجهرية للأرقام 2 و 3، على التوالي.

1-إعداد الصكوك ووسائط الثقافة والحلول وأطباق بيتري
<ol><li>اﻷوتوكﻻف المسواك في كوب 50 مل مغطاة برقائق الألومنيوم لإبقاء العقيمة.</li>
	<li>تعقيم جميع البضائع الجافة التي سيتم استخدامها (نصائح، والعصي، والأواني الزجاجية، إلخ) في اﻷوتوكﻻف. ملاحظة: تنبيه! اتبع جميع توجيهات السلامة لنموذج اﻷوتوكﻻف المستخدمة. أجهزة اﻷوتوكﻻف خطرا للتفجيرات، وحروق من البخار والاتصال مع الأسطح الساخنة والمواد ووسائل الإعلام. لسلامة اﻷوتوكﻻف، قم بعرض "الاستخدام السليم لأجهزة اﻷوتوكﻻف"34.</li>
	<li>
إعداد MS أجار (دقيق فول الصويا المانيتول (SFM))14 -تنمو الثقافات.
	<ol>
<li>إضافة 5 غ من دقيق الصويا و 5 غ من أجار إلى قارورة 1 لتر.</li>
		<li>حل 5 غ المانيتول في 250 مل ماء الصنبور والاستغناء عن في قارورة تحتوي على دقيق الصويا واجار.</li>
		<li>إضافة التوصيل الرغوة وإحباط لفتح قارورة والاوتوكلاف في 121 درجة مئوية، 15 رطل/بوصة مربعة لمدة 30 دقيقة على الأقل. تنبيه: تتلخص هذه الوسيلة بسهولة. استخدام قارورة التي يمكن أن تعقد على الأقل أربع مرات الحجم الفعلي لمرض التصلب العصبي المتعدد أجار يجري يعقم. يمكن استخدام طنجرة ضغط قياسي بدلاً من اﻷوتوكﻻف مع اعتبارات السلامة مماثلة. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام فرن الميكروويف تعقيم وسائط الإعلام والمواد إذا لم يكن الوصول إلى اﻷوتوكﻻف ممكن35،36. مدرسي المدارس الثانوية قد ترغب أيضا في التعاون مع الكليات المحلية أو الجامعات الوصول إلى إمدادات يعقم.</li>
		<li>وسائط باردة حتى مريحة بما يكفي للتعامل. كن حذراً لا بارد لفترة طويلة جداً لأن أجار يتصلب في درجة حرارة أقل من 50 درجة مئوية.</li>
		<li>صب أجار مرض التصلب العصبي المتعدد من قارورة في أطباق بتري معقمة حتى أسفل كل طبق بيتري تقريبا نصف كاملة (حوالي 25 مل من وسائل الإعلام كل طبق بيتري). واسمحوا أن يصلب قبل استخدام لوحات أجار. تخزين لوحات أجار في كيس من بلاستيك في درجة حرارة الغرفة حتى المطلوبة. ملاحظة: لوحات أجار قد أيضا تكون مخزنة في ثلاجة، خاصة إذا كان هناك حاجة للمضادات الحيوية في وسائل الإعلام.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-خط متسلسلة على لوحات للنشر
<ol><li>سلالات متسلسلة متواصلة على لوحات أجار MS للمستعمرات واحدة باستخدام أسلوب قياسي، مثل رباعي خط الأسلوب كما هو موضح في ساندرز، 201237. ملاحظة: كما يمكن حلقة إينوكولاتينج أو المسواك العقيمة. اختياري: يشيع استخدام وسائل الإعلام الأخرى للأنواع متسلسلة ، مثل R2YE، والحد الأدنى من وسائل الإعلام14.</li>
	<li>احتضان لوحات في 30 درجة مئوية.</li>
	<li>ريستريك لوحات بانتقاء مستعمرة واحدة كل 4 – 6 أيام. كمستعمرات العمر يصبحون عرضه للطفرات العشوائية.</li>
</ol>3. إنشاء مخزون Mycelial والغليسيرول لتخزين البكتيرية
ملاحظة: قد إنشاء مخزون Mycelial لجميع سلالات متسلسلة ، بما في ذلك مبادرة الخوذ البيضاء وسلالات bld ، وطفرات الإنمائية الأخرى التي غير قادر على إكمال تبوغ.
<ol><li>مسرات المستعمرات 15 – 20 في 200 – 500 ميليلتر من الجلسرين 20% استخدام قضيب وتد خشبي عقيمة.</li>
	<li>نقل الملاط متعطنين المستعمرات إلى أنبوب ثقافة الثلاجة 1.5 مل، باستخدام ميكروبيبيتي أو ماصة نقل العقيمة. ملاحظة: يتم تغطية أساسيات استخدام ميكروبيبيتي في أماكن أخرى38.</li>
	<li>إضافة والغليسيرول 20% ما يكفي لجعل وحدة التخزين النهائي 1 مل وتخلط برفق. تخزين العينات في-80 درجة مئوية. ملاحظة: تنبيه! استخدام قفازات السلامة المبردة ومعطف مختبر لحماية الجلد من الاتصال مع البرد القارس. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام ثلاجة-20 درجة مئوية مع انخفاض محتمل في وقت التخزين طويل الأجل. تجنب الإفراط تجميد والغاء تمديد صلاحية.</li>
</ol>4-إنشاء مخزون بوغ والغليسيرول لسلالات قادرة على تبوغ
ملاحظة: مخزونات بوغ هي الأفضل للاستمرار على المدى الطويل ولكن فقط قابلة للتنفيذ لسلالات قادرة على إكمال تبوغ.
<ol><li>
نشر 100 ميليلتر المواد متعطنين (من الخطوة 3.1) على صفيحة أجار للحصول على حشيش المتلاقية النمو37. ملاحظة: يظهر انتشار الطلاء في ساندرز37 (تعديل: الدوار غير مطلوب.). اللوحة يمكن أن تحول يد واحدة أثناء استخدام اليد الأخرى للتحرك الناشرة في لطيف ذهابا وإيابا الحركة عبر وسائل الإعلام أجار.<ol>
<li>بيبيت 100 ميليلتر من متعطنين الميسليوم إلى مركز صفيحة أجار مرض التصلب العصبي المتعدد.</li>
		<li>تعقيم الزجاج أو المعدن نشر أداة جزئيا غمر في الإيثانول 70% وتمرير الناشرة مرة واحدة ببطء من خلال لهب موقد بنسن لسرعة التبخر الإيثانول. تنبيه: الإيثانول من الاشتعال. لا تضع الناشرة المشتعلة في الإيثانول أو السماح بهبوط المشتعلة من الإيثانول إلى الوقوع في الطبق الإيثانول. بدلاً من ذلك، استخدم مسحه القطن معقمة المتاح لانتشار البكتيريا على اللوحة، التي لا تتطلب أي الإيثانول أو لهب.</li>
		<li>دورة أجار MS لوحة مع يد واحدة، بينما استخدام نسخة احتياطية والحركة المنصوص عليها لتطعيم اللوحة مع الناشرة العقيمة.</li>
		<li>احتضان لمدة 5-7 أيام عند 30 درجة مئوية حتى تصبح السلالة sporulated جيدا. ملاحظة: سوف تختلف أوقات الحضانة تبعاً للأنواع والسلالة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إضافة 2 مل من المحلول الملحي المعقم (0.8% كلوريد الصوديوم) إلى مركز المتلاقية حشيش متسلسلة الخلايا التي مرت بها تبوغ.</li>
	<li>حصاد جراثيم بلطف فرك سطح الميسليوم مع عقيمة تطعيم حلقة (أو برعم القطن)، ببطء التحرك نحو حافة العشب.</li>
	<li>بيبيت المالحة التي تحتوي على الجراثيم في أنبوب مخروطي 15 مل. دوامة قوة لاقتحام سلاسل سبور الخلايا الفردية.</li>
	<li>الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق في 2,500 تقريبا x ز.</li>
	<li>بيبيت المادة طافية وتجاهل. تفريق بيليه بوغ بالانفعالات دوامة قوية في كمية صغيرة من السائل المتبقي.</li>
	<li>ريسوسبيند الجراثيم في 1 مل الجلسرين 20% برسم الحل صعودا وهبوطاً مع ماصة.</li>
	<li>نقل المخزون بوغ والغليسيرول لأنبوب الثلاجة 1.5 مل. مخزن في-80 درجة مئوية. تحذير: استخدام قفازات السلامة المبردة ومعطف مختبر لحماية الجلد من الاتصال مع البرد القارس. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام ثلاجة-20 درجة مئوية مع تخفيض محتمل للبقاء في وقت التخزين طويل الأجل. تجنب الإفراط تجميد والغاء تمديد صلاحية.</li>
</ol>5-تؤدي الطفرات
<ol><li>تؤدي الطفرات استناداً إلى النتائج المرجوة المشار إليها في مقدمة واستعرضتها مؤخرا بالتز، 201639. ملاحظة: لن تحتاج بعض التجارب phenotyping الطفرات، مثل النية في التعرف على أنواع جديدة من البيئة. وتشمل أساليب الطفرات العشوائية استخدام الأشعة فوق البنفسجية، ينقول8،،من910،11،،من1213أو14من المواد الكيميائية. موقع الموجه الطفرات15،،من1617،،من1819،20 تقنيات يمكن استخدامها لخلق طفرات نقطة محددة، الحذف، أو أنواع أخرى من الطفرات.</li>
</ol>6-مقارنة وتسجيل المظهر المرئي
<ol><li>يحيط علما مورفولوجيا مستعمرة لكل متحولة بالمقارنة مع سلالة البرية من نوع الأصل بعد streaking جميع سلالات كما في الخطوة 2. قارن عزل جديدة للأنواع المدروسة جيدا، مثل كويليكولور س أو س. فينيزويلاي، عندما وصف أنواع متسلسلة جديدة. ملاحظة الخصائص (الشكل 1) مثل الشكل الأساسي، السطحية من مستعمرة (غامض، أصلع، التجاعيد، إلخ)، العتامة، والارتفاع وتصبغ (التمييز بين الخضري الميسليوم والميسليوم الجوية المتوسطة المحيطة بها).</li>
	<li>قم بتسمية أجار مرض التصلب العصبي المتعدد السلالات البرية من نوع ومتحولة لوحة والانتصارات في أنماط آسفين (الشكل 1). كن حذراً من أن يمس لا سلالة سلالة أخرى لتجنب التلوث المتبادل. ملاحظة التاريخ والوقت التي هي السنة اللهب أثناء الضغوط على اللوحة. احتضان اللوحات في 30 درجة مئوية.</li>
	<li>مكان نمت أطباق بيتري الملونة أو ورق أبيض مجانسة الخلفية. الكتابة على الورق اسم السلالة، والتاريخ ودرجة حرارة الحضانة، والوقت من أول لوحة streaking. تأخذ الرقمية صورة (ق) من اللوحة المعلومات الأخيرة مكتوب على خلفية الورقة بحيث يتم تصغير الارتباك. ملاحظة: الكتابة يمكن اقتصاص من الصورة في وقت لاحق إذا كان يمكن استخدامها لإعداد الشكل.</li>
</ol>7-إجراء الفحص المجهري مرحلة التباين
<ol><li>تعقيم ملاقط الغسيل في الإيثانول 70% وثم يمر لهب موقد بنسن تتبخر في الإيثانول. السماح لتبرد.</li>
	<li>تعقيم كوفيرسليبس بالغسيل في الإيثانول 70% ومن ثم السماح لهم الجافة في طبق بتري معقم.</li>
	<li>
إعداد رفع ساترة للنمو الجرثومي لفحصها.
	<ol>
<li>تلتقط ساترة عقيمة مع ملاقط معقمة ومكان ساترة على صفيحة أجار مرض التصلب العصبي المتعدد التي يكون فيها النمو البكتيرية كثيفة. اضغط على الجزء الخلفي ساترة بلطف مع ملاقط لضمان نقل كافية من الجراثيم البكتيرية وجوي الميسليوم.</li>
	</ol>
</li>
	<li>التقاط ساترة من اللوحة ووضعه حيث تواجه الجانب مع مواد الخلية نحو سطح شريحة المجهر، مع انخفاض 15 ميليلتر من والغليسيرول 50% أعدت في المياه للتركيب. تقليل فقاعات الهواء عن طريق وضع ساترة بزاوية 45° إلى الشريحة والسماح لها تقع على والغليسيرول 50%.</li>
	<li>(اختياري) الختم مع مسح الأظافر للمحافظة على الشريحة.</li>
	<li>
إجراء الفحص المجهري التباين المرحلة كما وصفها فروهليش40 في فترات زمنية مختلفة خلال دورات الحياة. ملاحظة: يسمح التصوير المتكرر لإجراء تحليل أكثر اكتمالا والقدرة على الكشف عن حالات التأخير في عملية التنمية. كرر الملاحظات التأكد من دقتها وإمكانية تكرار نتائج بشكل مستقل.<ol>
<li>ضع الشريحة المعدة في مرحلة مجهر وإضافة قطره زيت الغمر إلى مركز بكشف الغطاء. قم بتدوير المرحلة X 100 الهدف في مكان وتعيين البرج مكثف للإعداد المرحلة "مطابقة" الصحيح. وتركز الصورة باستخدام مقبض تسوية غرامة فقط بمجرد العدسة الهدف على اتصال النفط.</li>
		<li>دراسة عدة حقول النظر تمييز اختلافات ملحوظة واتساقا بين سلالات متحولة ونوع البرية، مثل القدرة على شكل جراثيم وبوغ الحجم والشكل والعدد الكلي للجراثيم (انظر الشكل 2). ملاحظة: تشمل البدائل للتباين مرحلة الفحص المجهري تدخل فرق التباين (DIC) مجهرية40 وتقنيات المصبوغة بسيطة لاستخدامه مع الحقل مشرق مجاهر41، مثل صبغة الكريستال البنفسجي.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8-إجراء الفحص المجهري الأسفار
<ol><li>تعقيم الملقط بالغسيل في الإيثانول 70% ومن ثم تشغيل عن طريق لهب موقد بنسن.</li>
	<li>تلتقط ساترة عقيمة مع ملاقط معقمة ومكان على صفيحة أجار MS حيث يتجلى النمو الجرثومي. لمس الجزء الخلفي من ساترة بلطف مع ملاقط لضمان نقل كافية من الجراثيم البكتيرية وخيوط الجوي.</li>
	<li>التقاط ساترة من اللوحة ووضعه حيث تواجه الجانب مع مواد الخلية، على البطاقات لسهولة التلاعب ساترة.</li>
	<li>الفيضانات في ساترة مع الميثانول المثلج (~ 300 ميليلتر ساترة2 20 x 20 مم) والسماح لها تماما من الهواء الجاف. تنبيه: من الميثانول مطفر. تجنب الاتصال المباشر مع الجلد.</li>
	<li>أغسل ساترة ثلاث مرات في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)42 قبل صرفها بلطف وإزالة الحل.</li>
	<li>إضافة 15 ميليلتر من 100 ميكروغرام/مل يوديد Propidium و/أو مترافق 10 ميكروغرام/مل القمح-جرثومة-أجلوتينين إلى fluorescein isothiocyanate (WGA-فيتك) قدم في الجلسرين 50% على شريحة مجهر مسمى. ملاحظة: يوديد Propidium بقع الحمض النووي الحمراء للكشف عن الكروموسومات الحمض النووي الموقع بينما فيتك وغ البقع الخلية جدار أخضر.</li>
	<li>عكس ساترة الوجه للأسفل على قطره من الفلورسنت وصمة عار على الشريحة الزجاجية. (اختيارياً) ختم مع طلاء الأظافر واضحة للحفاظ على الشريحة.  كما الصبغات حساسة للضوء، احتضان لمدة 15 دقيقة في غرفة مظلمة أو الخافتة.</li>
	<li>مراقبة الشرائح تحت عدسة هدف X 100 استخدام مرحلة التباين أو المجهر DIC مجهزة ابيفلوريسسينسي الإثارة مكعبات يوديد propidium (تعيين عامل التصفية 'تكساس الأحمر' أو ماكسيما الإثارة/الانبعاثات نانومتر 535/617) وفيتك (فيتك تصفية مجموعة أو 490/525 نانومتر ماكسيما الإثارة/الانبعاثات).</li>
	<li>ضع الشريحة على خشبة المسرح والتركيز باستخدام المقابض التكيف الخشنة وغرامة.</li>
	<li>مراقبة الأسفار كما هو موضح في مكان آخر من43.</li>
	<li>استخدام حزمة برامج تحليل صور حرة التي يمكن أن تساعد في التعرف على الجراثيم مع انخفاض كثافة fluorescence44.</li>
</ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

نقدم هنا البروتوكولات لبداية الباحثين متسلسلة الشروع في إجراء دراسات بما في ذلك الخطوات اللازمة لنشر السلالات وإعداد الأرصدة للتخزين على المدى الطويل. ثم يصف لنا البروتوكولات لتوصيف المرئية والمجهرية من سلالات متسلسلة . بعض الخطوات الأولية النموذجية في طفرات إنمائية phenotyping: 1) الفحص البصري للمستعمرات متحولة مقارنة بنوع البرية المستعمرات في أجار المتوسطة؛ 2) مجهرية مرحلة التباين؛ و 3) الأسفار مجهرية من خيوط فطرية جوي سبوروجينيك. استناداً إلى النمط الظاهري المعروضة في هذه الخطوات الثلاث، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من التقنيات زيادة تمييز النمط الظاهري لسلالة معينة.
التجارب الأولية phenotyping تستخدم عادة لوصف الأنواع الجديدة، وتحديد طفرات فائدة، وجزئياً تميز طفرات وتبدأ تبين دور نموذجي لجين معين على النمط الظاهري للمسخ التي تم تحديدها أساس. الأساليب الموصوفة هنا سبق استخدامها في المختبرات تحديد وتوصيف مجموعة متنوعة واسعة من طفرات متسلسلة ، بما في ذلك الذين يعانون من عيوب في انقسام الخلية48،49، التدريس في الجامعات 50 , 51 , 52 , 53 , 54وتبوغ55،56، الميسليوم الجوي تشكيل57،58، إنتاج المضادات الحيوية59، والثاني رسول مما يشير إلى47والعزل الصبغي 60-هذه التقنيات هي الخطوات الأولى حيوية لتحديد النمط الظاهري طفرات بشكل عام والكشف عن كمية كبيرة من معلومات هامة عن الأدوار للجينات للفائدة. الأساليب التي يمكن أن تمتد بسهولة إلى الأنواع الأخرى من متسلسلة وقد استخدمت فعلا لوصف سلالات من غريس س. س. فنزويلا، الجرب س.والعديد من ستريبتوميسيتيس الأخرى. ومن المتوقع البروتوكولات الفيديو الموضحة هنا بمثابة مورد هام للباحثين الجديد دخول مجالات بحوث متسلسلة ، كما هو الحال في مجال اكتشاف الأدوية. ويشمل ذلك المعلمين الجديدة الذين يعملون على مكافحة الأزمة المقاومة للمضادات الحيوية، وتثقيف عدد لا يحصى من الباحثين الطلاب الجامعيين الجديد الانضمام إلى جهود crowdsourcing المبادرة العالمية الصغيرة.
يمكن تكييفها بسهولة للاستخدام الفصول الدراسية الكليات والمدارس الثانوية بالإضافة إلى مختبرات الأبحاث، بإدخال التعديلات المذكورة في الفيديو والنص باستخدام التقنيات الموضحة هنا. الطلاب في الوحدة نمطية مجهرية سنة أولى في كلية فنون الحرة صغيرة كانت قادرة على متتالية السلالات، والتقاط صور فوتوغرافية رقمية من السلالات التي تزرع في وسائل الإعلام أجار، وإجراء الفحص المجهري والمرحلة-على النقيض من الأسفار، التي توجت بتقديم مجموعة أرقام نصب منصة متعددة في نهاية الوحدة النمطية 3 أسابيع، يمثلون 15 ح العمل بالمعمل. حوالي 160 من طلاب السنة الأولى مسؤولة عن فينوتيبينج الأولى من 320 ينقول رواية طفرات. شارك طلاب البحوث الجامعية في المؤسسات الثلاث في فينوتيبينج الأولى من طفرات إضافية وتوصيف اللاحقة لكثير من السلالات. وتوضح البيانات الشاملة التي تم الحصول عليها في فترة قصيرة نسبيا من الزمن، قيمة البروتوكولات المذكورة هنا. تم تخزين مئات طفرات إضافية كمخزون mycelial والغليسيرول لتوصيف المستقبل.
في أعقاب التجارب الأولية الموضحة هنا، يجوز مجموعة متنوعة من الأساليب لتوسيع نوعية المعلومات المتصلة بسلالات فائدة. إذا كانت الطفرة غير معروف، وينبغي استخدام أسلوب التنميط لتحديد نوع و/أو موقع من الطفرة. على سبيل المثال، ينقول عشوائية الطفرات البرية من نوع الكروموسوم6،،من78،9،10،11،12،13 النتائج في المستعمرات التي ينبغي أن يخضع لها الأولية شاشات المظهرية مثل التي ورد وصفها أعلاه. ثم ينبغي أن تحدد موقع ينقول استخدام تقنية مثل معكوس بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (إيبكر)61. تحديد النمط الوراثي لطفرات المكتشفة حديثا خطوة هامة بعد توصيف الأولية.
وتشمل بعض أساليب متقدمة تستخدم عادة لتحليل phenotyping اللاحقة التي يمكن ذكرها في الفصول الدراسية أو استكشافها من خلال إجراء مزيد من البحوث البروتين الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) وضع علامات لتحديد أنماط الترجمة لبروتين الاهتمام، تحليل تعبير الجينات مثل الحقيقي الوقت PCR الكمي (qPCR) وأنماط التعبير الجيني العالمي البرية من نوع مقابل المسخ عبر "تسلسل الحمض النووي الريبي" (الرنا-seq). Phenotyping مهارات مطلوبة أيضا لتحليل التكامل الوراثية. في تجربة تكامل، هو عرض النسخة البرية من نوع من الجينات إلى سلالة تحور لتحديد ما إذا كان اليل المضافة حديثا يمكن أن تعوض عن فقدان الوظيفة اليل تحور. مقارنة النمط الظاهري سلالة تستكمل المسخ الأصلي والوالدين، لا بد من السلالة البرية من نوع.

ستريبتوميسيتيس بكتيريا التربة إيجابية والخيطية معروفة بقدرتها على إنتاج مجموعة متنوعة من نواتج الأيض الثانوية، بما في ذلك ما يزيد على ثلثي المضادات الحيوية المتاحة تجارياً، كذلك كما المضادة للورم، العقاقير المضادة فيروس نقص المناعة البشرية، ومكافحة الطفيليات 1. س. كويليكولور هو العضو الأكثر وراثيا تتسم2،جنس3 والأنواع المستخدمة في الأساليب الموصوفة هنا. وقد س. كويليكولور دورة الحياة معقدة التي تبدأ الإنبات بوغ مفرد، تتقدم إلى الميسليوم الخضري واسعة النطاق، والتفريع ينمو في المتوسط أجار. كما تمضي حياتها، تتشكل خيوط الجوي كسر التوتر السطحي من الميسليوم الركيزة، وأخيراً تنقسم إلى سلاسل طويلة من الخلايا التي يتم تحويلها في نهاية المطاف إلى أبواغ ناضجة، مصطبغة غراي. تشتت هذه الجراثيم شكلت حديثا يشكل بداية دورة الحياة المقبلة4.
بسبب نمط معقد من التمايز، كويليكولور س. يقدم نموذجا ممتازا لدراسة التطور الجرثومي. تاريخيا، الطفرات تؤدي إلى كتل اثنين المراحل الرئيسية للتنمية وتتمخض تعمل بصرية متميزة. يتم حظر طفرات (أصلع) bld لتشكيل الميسليوم الجوي وتؤدي إلى عدم وجود الميسليوم جوي غامض إضفاء مظهر مستعمرة "أصلع". تحول دون طفرات في تشكيل بوغ ونضوج يشار إليها كطفرات مبادرة الخوذ البيضاء (أبيض) نظراً لأنها تفشل عادة لإنتاج مستويات البرية من نوع من الصباغ سبور رمادي والميسليوم الجوي لا تزال بيضاء. يتم تثبيط طفرات أخرى مثيرة للاهتمام في إنتاج المضادات الحيوية، انقسام الخلية، والعزل الصبغي أو غيرها من العمليات الهامة54،.
وعلى الرغم من اكتشاف العديد من الجينات التنموية في الأنواع متسلسلة ، هناك العديد من أكثر يعتقد أنها موجودة استناداً إلى عدم تشبع شاشات المسخ. مختبراتنا مواصلة تحديد الجينات الإنمائية الجديدة باستخدام نظام ينقول المصغر بأننا قد شيدت. رواية سلالات متحولة معزولة في تجارب عشوائية الطفرات مع لدينا ينقول الخضوع للفحص المظهرية تحديد الدور المحتمل لكل اكتشاف الجينات الجديدة6،7. أساليب فينوتيبينج البكتيرية الموصوفة هنا ذات الصلة بطفرات متسلسلة معزول بواسطة ينقول الطفرات8،،من910،،من1112، 13 وغيرها من الأساليب العشوائية، مثل المواد الكيميائية والبنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الطفرات14، فضلا عن تشييد الموجه الطفرات مثل الحذف الجينات باستخدام ريكومبينيرينج15،16 أو تحرير التكنولوجيا17،،من1819 والطفرات20الجينوم كريسبر-Cas9 (تجمع بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة المتناوب يكرر).
وعندما تصبح المقاومة للمضادات الحيوية بين مسببات الأمراض أكثر انتشارا، تصبح الحاجة إلى المضادات الحيوية الجديدة يزداد إلحاحا21،22. "المبادرة العالمية الصغيرة" (أو مؤسسة) هو العلم والتكنولوجيا، والهندسة والرياضيات (الجذعية) فعالية التعلم23 والبحوث الاستراتيجية24 لمكافحة المقاومة للمضادات الحيوية من خلال crowdsourcing من طلاب الجامعات، وأكثر مؤخرا من طلاب المدارس الثانوية. دعم دورات العمل ويتضمن تحديد جراثيم التربة الجديدة التي تنتج رواية المضادات الحيوية (http://www.smallworldinitiative.org). ويعتقد أن مصدرا رئيسيا للمضادات الحيوية غير المكتشفة سوف تستمر لتكون متسلسلة الأنواع الموجودة في مجموعة واسعة من التربة والمياه الموائل25،،من2627،28، ،من 2931. مؤخرا، اكتشف المختبر وعمل الآخرين وتتميز الإشارات الجينات في متسلسلة من الأنواع التي تنظم مورفولوجيا والتنمية، بما في ذلك إنتاج المضادات الحيوية7،32، 33. التغييرات في هذه الجينات يؤدي إلى تغيير في مقدار وتوقيت للمضادات الحيوية التي تنتجها. سيظل فينوتيبينج المهرة من الأنواع الجديدة وطفرات جديدة منتجة للمضادات الحيوية الهامة. جديد من المعلمين والطلاب أصبحت المساهمين الرئيسيين في مجال اكتشاف الأدوية، التدريب في فينوتيبينج البكتيرية أمر ضروري لنجاح هؤلاء الأفراد المبتدئين. وعلاوة على ذلك، هذه التجارب أصعب للمدرسة الثانوية الجذعية أو جامعة الميكروبيولوجيا مختبرات التعليم. وهي تمثل تظاهرة مبادئ الجينية الميكروبية الأساسية في مختبر تدريس الإعداد.

<table><tbody><tr><td>50% Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil (Type DF)</td><td>Cragille&amp;nbsp;</td><td>16482</td><td></td></tr><tr><td>Lens Paper</td><td>Fisherbrand</td><td>11-995</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Water</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-1L</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Toothpicks (flat)</td><td>Target</td><td>081-22-1957</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (10 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (200 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-200Y</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (1,250 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-1250</td><td></td></tr><tr><td>Wooden Applicators 6&#039;&#039;</td><td>Solon Care</td><td>070809</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swabs</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>Soy Flour&amp;nbsp;</td><td>Bob&#039;s Red Mill&amp;nbsp;</td><td>1516C164</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol 100%</td><td>VWR amresco life science&amp;nbsp;</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>0.8% NaCl (Saline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9000V</td><td></td></tr><tr><td>1.2 mL freezer tube</td><td>NEST</td><td>606101</td><td></td></tr><tr><td>Ultra low (-80 &amp;deg;C) freezer</td><td>SO-LOW</td><td>U85-18</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Safety Gloves</td><td>Bel-Art</td><td>H13201</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips #1.5</td><td>Thomas Scientific</td><td>64-0721</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Carolina</td><td>63-2010</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Tuttnauer</td><td>2540E</td><td></td></tr><tr><td>Phase-Contrast Microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>BX40</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Carolina Biological</td><td>624504</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>Carolina Biological</td><td>706706</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffer saline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>Biotium</td><td>29022-1</td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td>OPI</td><td>22001009000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Free Software</td><td></td></tr><tr><td>100 mL beaker</td><td>Pyrex USA</td><td>1000-T</td><td></td></tr><tr><td>1 L beaker</td><td>Carolina Biological</td><td>721253</td><td></td></tr><tr><td>1 L flask</td><td>Fisherbrand</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>250 mL flask</td><td>Pyrex USA</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>100 mL graduated cylinder</td><td>Carolina Biological</td><td>721788</td><td></td></tr><tr><td>500 mL graduated cylinder&amp;nbsp;</td><td>Carolina Biological</td><td>721792</td><td></td></tr><tr><td>Stir Bar</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-271825</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Camera for Microscope</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>Nitrile Examination Gloves (Med)</td><td>Bio Excell</td><td>71011002</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Carolina Biological</td><td>701077</td><td></td></tr></tbody></table>

visual and microscopic evaluation of streptomyces developmental mutants

ستريبتوميسيتيس هي بكتيريا التربة الخيطية المنتمين للأسرة في اللغات أكتينوباكتيريا التي يتم العثور عليها في جميع أنحاء العالم، وتنتج مجموعة واسعة من المضادات الحيوية وغيرها من نواتج الأيض الثانوية. وهو كويليكولور متسلسلة نوع تتسم جيدا، غير ممرضة قابلة لمجموعة متنوعة من التحليلات في المختبر. استخدام phenotyping الأساليب الموصوفة هنا كويليكولور س. كطراز ستريبتومايسيت؛ الأساليب غير المنطبقة على جميع أعضاء هذا جنس كبيرة، فضلا عن بعض أكتينوميسيتيس ارتباطاً وثيقا. فينوتيبينج ضروري لوصف الأنواع الجديدة من متسلسلة محددة في البيئة، وأيضا خطوة أولى حيوية في وصف سلالات متحولة المعزولة حديثا من متسلسلة. إجادة اللغة فينوتيبينج مهم للباحثين الجديد العديد من الذين يدخلون ميدان بحوث متسلسلة ، الذي يتضمن دراسة التنمية البكتيرية وانقسام الخلية والعزل الصبغي ورسول الثاني يشير إلى. Crowdsourcing مؤخرا من اكتشاف المضادات الحيوية من خلال عزل جراثيم التربة الجديدة قد أدى ازدياد حاجة إلى التدريب في فينوتيبينج للمعلمين الجديدة في مجال بحوث متسلسلة وكلية أو مدرسة ثانوية الطلاب. ويصف هذه المخطوطة أساليب إكثار السلالة البكتيرية وتخزينها، وتوصيف من خلال الفحص المجهري والبصرية. بعد قراءة هذه المادة، الباحثين جديدة (مختبرات تعليم علم الأحياء المجهرية والعلماء مواطن) ينبغي أن تكون قادرة على التعامل مع الضغوط متسلسلة وتبدأ التجارب البصرية توصيف.

تجارب phenotyping الأولية اللازمة لوصف أنواع جديدة وسلالات ويمكن استخدامها كنهج المجاملة للسلالات وتجارب التهجين الحمض النووي الحمض النووي التي يتم استخدامها لوصف الأنواع الجديدة. طفرات متسلسلة الناتجة عن الطفرات العشوائية في أساليب مثل الكيميائية والأشعة فوق البنفسجية، أو يتم تحديد الطفرات ينقول عادة من خلال الشاشات المرئية المباشرة، وعلى لوحات أجار. ويتم فحص المستعمرات من متسلسلة للتغييرات في النمط الظاهري بالمقارنة مع سلالة البرية من نوع، والوالدين. على سبيل المثال، الميسليوم جوي ملونة أخف قد تشير إلى مستوى أقل من الصبغة الرمادية الناجمة عن عيب في تبوغ، أو الافتقار إلى مظهر غامض إرشادي لكتلة في تشكيل الميسليوم الجوي (الشكل 1). ستريبتوميسيتيس العديد من إنتاج المضادات الحيوية المصطبغة في الميسليوم الخضري أو أجار المحيطة بها. كويليكولور س. ينتج اثنين من المضادات الحيوية المصطبغة فضلا عن اثنين منها غير مصطبغة. أكتينورهودين مضاد حيوي مصطبغة الأزرق وهو أونديسيلبروديجيوسين المضادات الحيوية مصطبغة أحمر45. ثم يتم نشر السلالات التي مرت بشاشات مستعمرة البصرية الأولية من streaking للمستعمرات واحدة.
بعد تحديد هوية بصرية يحتمل أن تكون مثيرة للاهتمام طفرات، سلالات تخضع للفحص المجهري. المرحلة--تباين مجهرية مناسبة خاصة لدراسة طفرات متسلسلة لعيوب الإنمائية، باستخدام سلالة البرية من نوع كعنصر تحكم (الشكل 2). عادة إنتاج نوع البرية كويليكولور س. المستعمرات الميسليوم جوي قبل حوالي يومين نمو عند 30 درجة مئوية في أجار مرض التصلب العصبي المتعدد، وسلاسل طويلة من جراثيم قبل ثلاثة أيام نمو. وسوف تقدم دورة الحياة قليلاً أبطأ أو أسرع في أنواع أخرى من وسائل الإعلام. من الضروري أن يتم تحليلها طفرات ظروف النمو نفسه كنوع البرية عند استخلاص النتائج بشأن العيوب التنموية والتأخير. قد تنتج طفرات أصلع جراثيم بعد النمو المطولة في أجار وسائط الإعلام. فئة من طفرات يشار إلى طفرات الأبيض قد تتأخر أما لتشكيل بوغ، تشير إلى انخفاض في وفرة الجراثيم المنتجة، إنتاج جراثيم بعيوب الشكل و/أو الحجم، أو ببساطة إنتاج مستويات أدنى من الصباغ بوغ ناضجة، والرمادي46 . قد يتأخر طفرات أخرى التحقيق فيها حتى الآن أو تسارع في تطور دورة الحياة مثل طفرات المتأثرة لتراكم إشارات الجزيئات (مثلاً، GMP دي دوري47).
متابعة بسيطة لتقنية مجهرية الخفيفة الموصوفة أعلاه مجهرية الفلورية استخدام يوديد propidium وصمة عار الصبغية الحمض النووي نوكليويدس وجنين القمح فلوريسسينتلي المسمى أجلوتينين بوصمة عار جدار الخلية سيتا تبوغ. الجراثيم التي تفتقر إلى كروموسوم ستكون خالية من يوديد propidium الأحمر تلطيخ، بينما الجراثيم التي تحتوي على الحمض النووي أقل من المعتاد ويمكن تحديد إذا كان يبدو أنها قد انخفضت تلطيخ (الشكل 3). يمكن أن تستخدم أجلوتينين جرثومة القمح وصمة عار جدار الخلية ويمكن ملاحظة الاختلافات في جدار الخلية تلطيخ أنماط (أي، عيوب انقسام الخلية). في سلالة الرقم 4 البرية من النوع من أنواع المستخدمة مؤخرا كنموذج آخر من س. فينيزويلاي، ستريبتومايسيت بسبب سرعة دورة الحياة والقدرة على سبورولاتي في45من السائل، قد تم ملطخة إلى فيتك وغ توضيح صفيف مثل سلم سيبتا الشعبة التي ينظر إليها عادة وقت مبكر خلال تبوغ.
استراتيجيات phenotyping الأولى الموصوفة هنا ينبغي أن يسفر عن ما يلي: 1) تحديد سلالات متحولة من اهتمام لمزيد من الدراسة؛ 2) اكتساب المعارف حول المسخ المحددة حديثا والدور المحتمل للجينات التي قد تم تحور؛ 3) بوضع سلسلة لاحقة من الخطوات التجريبية التالية التي يمكن استخدامها لزيادة توضيح دور الجينات في السؤال. في حالة ستريبتومايسيت محددة حديثا من البيئة، الباحث سوف اكتساب المعرفة للأنواع الجديدة المحتملة مقارنة بالفعل تتميز الأنواع من متسلسلة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig1.jpg"> الشكل 1: صورة فوتوغرافية للوحة أجار الممثل يدل تعمل مستعمرة عيانية من س. كويليكولور. لوحة أجار يبين غامض، سلالة رمادية المظهر المرئي الميسليوم الجوي للبرية من نوع كويليكولور س. MT1110 (وزن) بالمقارنة مع طفرات الإدراج ينقول عشوائية مختلفة مع تعمل التنموية. أما تفتقر إلى طفرات الميسليوم جوي [أصلع (bld)] أو الميسليوم جوية مع انخفاض بوغ تصبغ [الأبيض (whi)]. طفرات ينقول تم إنشاؤها باستخدام Tn5 مصغرة للإدراج الطفرات6،7. السلالات كانت تزرع في أجار مرض التصلب العصبي المتعدد لمدة 5 أيام في 30 درجة مئوية. طبق بيتري قطر 100 ملم.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig2.jpg"> الشكل 2: ميكروجرافس التباين مرحلة عرض ممثل الجوية خيوط للمسخ س. كويليكولور الأبيض سلالات ينقول العشوائية التي تحتوي على الإدراج الطفرات. (أ) تظهر هي ممثلة البري نوع خيوط جوي التي شهدت انقسامات الخلية متزامن، متباعدة بانتظام، المنتجة بالتساوي على شكل وحجم الجراثيم (MT1110). (ب–و) وتظهر اللوحات المتبقية تعمل مجهرية مختلفة إلى حد كبير من طفرات الأبيض المختلفة التي كانت معزولة عن طريق الطفرات ينقول عشوائي. تظهر لوحة ب خيوط جوية التي مرت لا تبوغ، ولكن بدلاً من ذلك قد أنتجت المناطق المنتفخة داخل الشعيرة. تشير الأسهم طويلة في ج ود، وواو إلى جراثيم طبيعي الكبيرة التي تتميز بها طفرات MIC42 و MIC43 و TH49. يشير السهم القصير في لوحة د إلى مثال من حجرة بوغ تفكيك. تظهر لوحة ه المقصورات أصغر مقيدة جزئيا التي نموذجية من سلاسل سبور تنتجها المسخ TH10. السلالات كانت تزرع في أجار مرض التصلب العصبي المتعدد لمدة 5 أيام في 30 درجة مئوية. طفرات لا علاقة لها بما هو مبين في الشكل 1. بوغ نوع البرية هو حوالي 1.1 ميكرون على محور طويل. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2.jpg"> الشكل 3: ميكروجرافس الممثل عرض كروموسوم متحولة كويليكولور س. تعمل التفرقة. (أ) بالرسم التخطيطي التمثيل يظهر مظهر المصبوغة البرية من نوع، ومتباعدة بشكل منتظم نموذجي لسلسلة من الجراثيم (كل بوغ تحتوي على الحمض النووي الكروموسومات) مقارنة بنمط المصبوغة المتقطع للمسخ الذي يعرض الكروموسوم عيب التفرقة. (ب) تبين كل زوج من الألواح بوغ نفس السلسلة لاحظ التباين التدخل التفاضلية (DIC) الصورة على اليسار وتظهر صورة fluorescence الملطخة يوديد propidium على الحق. تتم مقارنة النمط الظاهري البرية من نوع (، ب) هما طفرات الإدراج ينقول عشوائية (جو دال و هاء، واو). تشير الأسهم إلى جراثيم تخلو من الحمض النووي. السلالات كانت تزرع في أجار مرض التصلب العصبي المتعدد لمدة 5 أيام في 30 درجة مئوية. طفرات سيظهر لا علاقة لها بتلك التي في الشكل 1 و الشكل 2. مقياس بار = 1 ميكرومتر. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3.jpg"> الشكل 4: صورة مجهرية Fluorescence فنزويلا س. البرية من نوع السلالة ملطخة وغ فيتك. (A) بمخطط خيوط الجوي يظهر السلس مع لا المسافات البادئة، وأي علامات مرئية من تبوغ استخدام الفحص المجهري مرحلة التباين بالمقارنة مع صفيف مثل سلم لتلطيخ جدار الخلية التي تشير إلى مرحلة مبكرة من تبوغ بدأت في هذه الشعيرة نفس استخدام وغ فيتك تحت مجهر الأسفار. (ب) ميكروجرافس من البرية من نوع س. فينيزويلاي. () خيوط الجوي السلس موجودة بين سلاسل من الجراثيم. (ب) داخل الميسليوم يظهر في لوحة أ، أحد خيوط الجوي في مرحلة مبكرة من التنمية تمتلك مجموعة مثل سلم من ترسب جدار الخلية. تشير الأسهم إلى تشكيل متباعدة بانتظام عبر الجدران ملطخة فيتك وغ أن تطوير شكل متزامن ضمن خيوط جوي واحد كما أنه يخضع تبوغ المرتبطة تنمويا. وقد نمت السلالة على أجار MYM MYM (التوسيم، واستخراج الشرق Y، واستخراج البديل م) عن ح 38 في 30 درجة مئوية. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants at JoVE.com

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

التقييم المرئية والمجهرية من طفرات إنمائية متسلسلة

هنا نقدم البروتوكولات للمبتدئ الباحثين لبدء فينوتيبينج لجنس البكتيرية الهامة عقاقيري متسلسلة.

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

visual-microscopic-evaluation-streptomyces-developmental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

17.8K Views.  Otterbein University. هنا نقدم البروتوكولات للمبتدئ الباحثين لبدء فينوتيبينج لجنس البكتيرية الهامة عقاقيري متسلسلة.

Video: Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

التلاعب الجيني للمسببات الأمراض النباتية<em&gt; السوادية الذروية</em&gt; لدراسة علم الأحياء الفطرية النباتية وميكروب التفاعلات

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Genetics

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the abundances of key metabolites to which regulatory factors respond, adjusting cellular metabolism. In recent years, a number of proteins and RNA have emerged as important regulators of virulence gene expression. For example, the CodY protein responds to levels of branched-chain amino acids and GTP and is widely conserved in low G+C Gram-positive bacteria. As a global regulator in Staphylococcus aureus, CodY controls the expression of dozens of virulence and metabolic genes. We hypothesize that S. aureus uses CodY, in part, to alter its metabolic state in an effort to adapt to nutrient-limiting conditions potentially encountered in the host environment. This manuscript describes a method for extracting and analyzing metabolites from S. aureus using liquid chromatography coupled with mass spectrometry, a protocol that was developed to test this hypothesis. The method also highlights best practices that will ensure rigor and reproducibility, such as maintaining biological steady state and constant aeration without the use of continuous chemostat cultures. Relative to the USA200 methicillin-susceptible S. aureus isolate UAMS-1 parental strain, the isogenic codY mutant exhibited significant increases in amino acids derived from aspartate (e.g., threonine and isoleucine) and decreases in their precursors (e.g., aspartate and O-acetylhomoserine). These findings correlate well with transcriptional data obtained with RNA-seq analysis: genes in these pathways were up-regulated between 10- and 800-fold in the codY null mutant. Coupling global analyses of the transcriptome and the metabolome can reveal how bacteria alter their metabolism when faced with environmental or nutritional stress, providing potential insight into the physiological changes associated with nutrient depletion experienced during infection. Such discoveries may pave the way for the development of novel anti-infectives and therapeutics.

Here we describe a protocol for the extraction of metabolites from Staphylococcus aureus and their subsequent analysis via liquid chromatography and mass spectrometry.

النهج القائم على الطيف، جنبا إلى جنب السائل اللوني الكتلة لتحليل المستقلب من<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Biochemistry

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

شاشة القامع عميق--التسلسل-ساعد، عفوية في "انشطار الخميرة" شيزوساكتشاروميسيس بومبي

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

أسلوب الإنتاجية العالية عالميا لدراسة مورفولوجية عضية في البيرة س.

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Biology

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

دراسة "عنصر مؤكسد الإجهاد الناجم عن العقديّات المجموعة ميتس" في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Developmental Biology

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

تحليل للوضع النمط الظاهري المورفولوجية كدالة للتركيز البروتين في الخميرة الناشيء.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

مضان الوقت الفاصل بين التصوير من كامل<em&gt; S. venezuelae</em&gt; دورة الحياة عن طريق جهاز ميكروفلويديك

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

حذوفات الجينات في الجينوم على نطاق<em&gt; العقدية الدم</em&gt; من جانب PCR إنتاجية عالية

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. The non-replicative elementary body (EB) initiates infection of the host. Once inside, the EB differentiates into the reticulate body (RB). The RB then undergoes multiple rounds of replication, before differentiating back to the infectious EB form. This cycle is essential for chlamydial survival as failure to switch between cell types prevents either host invasion or replication.
Limitations in genetic techniques due to the obligate intracellular nature of Chlamydia have hampered identification of the molecular mechanisms involved in the cell-type development. We designed a novel dual promoter-reporter plasmid system that, in conjunction with live-cell microscopy, allows for the visualization of cell type switching in real time. To identify genes involved in the regulation of cell-type development, the live-cell promoter-reporter system was leveraged for the development of a forward genetic approach by combining chemical mutagenesis of the dual reporter strain, imaging and tracking of Chlamydia with altered developmental kinetics, followed by clonal isolation of mutants. This forward genetic workflow is a flexible tool that can be modified for directed interrogation into a wide range of genetic pathways.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

This protocol utilizes fluorescent promoter-reporters, live-cell microscopy, and individual inclusion extraction in a directed forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants of Chlamydia trachomatis.

العيش الخلية إلى الأمام النهج الجيني لتحديد وعزل المسوخ التنموية في الكلاميديا trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic changes are regulated by a complex signaling network controlled in response to environmental stimuli. These regulatory components have been highly studied, but almost all studies use a variety of in vitro stimuli to trigger filamentation. To determine how morphogenesis is regulated during the pathogenesis process, we developed an in vivo microscopy system to obtain high spatial resolution images of organisms undergoing hyphal formation within the mammalian host. The protocol presented here describes the use of this system to screen small collections of C. albicans mutant strains, allowing us to identify key regulators of morphogenesis as it occurs at the site of infection. Representative results are presented, demonstrating that some regulators of morphogenesis, such as the transcriptional regulator Efg1, have consistent phenotypes in vitro and in vivo, whereas other regulators, such as adenyl cyclase (Cyr1), have significantly different phenotypes in vivo compared to in vitro.

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

This manuscript describes a method for screening moderately sized Candida albicans mutant libraries for morphogenesis phenotypes during active infection in a mammalian host using non-invasive confocal microscopy.

استخدام التصوير في الجسم الحي للكشف عن الأنماط الظاهرية للتشكل في سلالات المبيضات البيض الطافرة أثناء العدوى النشطة في مضيف الثدييات

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

التقييم المرئية والمجهرية من طفرات إنمائية متسلسلة

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

التلاعب الجيني للمسببات الأمراض النباتية

النهج القائم على الطيف، جنبا إلى جنب السائل اللوني الكتلة لتحليل المستقلب من