המחברים רוצה להכיר Otterbein אוניברסיטת מענקי מחקר של סטודנטים לתואר ראשון, תלמיד מחקר קרן פרסים GVK, SGK; האנדרטה פרופסור גילברט אי מילס Otterbein ניחן פרס תוכנית שבתון, המחלקה לביולוגיה, מדעי כדור הארץ סגל מחקר ולמדנות ניחן פרס מכה. ברט וקרן ג'יין קרן ניחן תלמיד מחקר במדעי הוענק GVK ו- SGK. המחברים גם רוצה להכיר בהכרת תודה שדוקיין האוניברסיטה במימון מלגות תוכנית מחקר לתואר ראשון עבור GVK ו- SGK. תלמידי מחקר לתואר ראשון לשעבר Juniata קולג ', ריאן ג'ונסון ודרייפר לינדסי תרם את התמונות במיקרוסקופ על דמויות 2 ו- 3, בהתאמה.

1. מכינים כלי נגינה, תרבות המדיה, פתרונות, צלחות פטרי
<ol><li>אוטוקלב קיסמים בתוך 50 מ ל מכוסה ברדיד אלומיניום, כדי לשמור על סטריליות.</li>
	<li>לעקר כל אבזרי זה יהיה בשימוש החיטוי (טיפים, מקלות, כלי זכוכית, וכו '). הערה: זהירות! בצע את ההוראות כל בטיחות עבור דגם אוטוקלב בשימוש. אוטוקלאבים להוות סיכון פיצוצים, כוויות אדים, מגע עם משטחים חמים, חומרים, מדיה. אוטוקלב בטיחות, להציג "שימוש נאות של אוטוקלאבים"34.</li>
	<li>
הכינו MS אגר (מניטול סויה קמח (SFM))14 לגדול תרבויות.
	<ol>
<li>להוסיף 5 g של קמח סויה, 5 g של אגר בקבוק 1 ליטר.</li>
		<li>להמיס 5 גר' מניטול ב 250 מ של מי ברז, לוותר על תוך הבקבוק המכילות את קמח הסויה ואת אגר.</li>
		<li>להוסיף את קצף תקע ו רדיד אלומיניום לפתיחה של הבקבוק, החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס, 15 psi במשך לפחות 30 דקות. התראה: בינוני שחין בקלות. השתמש בקבוקון שיכול להכיל לפחות ארבע פעמים נפח בפועל של MS אגר להיות בלוק. סיר לחץ סטנדרטי יכול לשמש במקום החיטוי עם שיקולי בטיחות דומה. לחלופין, ניתן להשתמש תנור מיקרוגל לחטא מדיה וחומרים אם גישה החיטוי אינו אפשרי35,36. מורים בתיכון ייתכן שתרצה גם לשתף פעולה עם מקומיים מכללות או אוניברסיטאות לגשת אספקה בלוק.</li>
		<li>מדיה מגניב עד נוח מספיק כדי להתמודד. להיזהר לא לצנן את זה במשך זמן רב מדי, כי אגר עפור בטמפרטורה שמתחת 50 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>שופכים את MS אגר מ הבקבוק לתוך צלחות פטרי סטריליות עד בתחתית כל צלחת פטרי הוא בערך חצי מלא (כ 25 מ"ל של מדיה לכל צלחת פטרי). אפשר לגבש לפני השימוש פלטות אגר. חנות פלטות אגר בשקית ניילון בטמפרטורת החדר עד שהוא נדרש. הערה: פלטות אגר גם ניתן לאחסן במקרר, במיוחד אם אנטיביוטיקה יש צורך בכלי התקשורת.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. רצף Streptomyces על גבי לוחות עבור הפצת
<ol><li>זני Streptomyces פס על גבי פלטות אגר MS למושבות יחיד באמצעות שיטה סטנדרטית, כגון המשולש צובעות שיטה כפי שמוצג סנדרס, 201237. הערה: ללולאה לחסן או קיסמים סטרילי עשוי לשמש. אופציונלי: מדיה אחרים משמשים עבור מינים Streptomyces , כגון R2YE ותקשורתי מזערי14.</li>
	<li>דגירה הצלחות ב- 30 ° C.</li>
	<li>Restreak הצלחות על-ידי בחירת שמושבה בודדת כל 4-6 ימים. כמו מושבות גיל שהם הופכים נוטה מוטציה אקראית.</li>
</ol>3. ליצור את מניות Mycelial גליצרול לאחסון חיידקי
הערה: Mycelial מניות יהיה ליצור עבור כל זני Streptomyces , כולל בעת שנסע בנין זנים, ואת מוטאנטים התפתחותיים אחרים, כי הם אפשרות להשלים הנבגה.
<ol><li>Macerate 15-20 מושבות ב 200-500 µL של גליצרול 20% שימוש של המוליך פינים מעץ סטרילי.</li>
	<li>להעביר את slurry של המושבות התמוסס 1.5 mL מקפיא תרבות צינור, באמצעות micropipette או פיפטה העברה סטרילי. הערה: היסודות של שימוש micropipette מכוסים במקום38.</li>
	<li>להוסיף גליצרול 20% מספיק כדי להפוך את עוצמת הקול הסופי 1 מ"ל ומערבבים בעדינות. מאגר דגימות ב-80 מעלות צלזיוס. הערה: זהירות! כפפות בטיחות קריוגני שימוש, חלוק מעבדה כדי להגן על העור מפני מגע עם קור עז. לחלופין, ניתן להשתמש מקפיא-20 ° C עם פוטנציאל הפחתה בזמן אחסון לטווח ארוך. הימנע מוגזמת הקפאה והפשרה של להרחיב את יכולת הקיום.</li>
</ol>4. ליצור גליצרול נבג מניות עבור זנים מסוגל הנבגה
הערה: נבג מניות עדיפים הכדאיות לטווח ארוך אבל רק ריאלי עבור זנים המסוגלים השלמת הנבגה.
<ol><li>
מורחים µL 100 התמוסס חומר (מתוך שלב 3.1) על צלחת אגר להשיג דשא confluent של צמיחה37. הערה: התפשטות ציפוי מוצג סנדרס37 (שינוי: מסתובב אינה נדרשת.). הלוח ניתן להפעיל ביד אחת תוך שימוש ביד האחרת כדי להזיז את מפזר באופן עדין הלוך תנועה על פני התקשורת אגר.<ol>
<li>Pipet 100 µL של תפטיר התמוסס למרכז צלחת אגר MS.</li>
		<li>לחטא של זכוכית או מתכת הפצת הכלי על ידי חלקית השוקע 70% אתנול ולהעביר את מפזר פעם לאט דרך להבה מבער בונזן לזרז האידוי של האתנול. התראה: אתנול הוא דליק. אין למקם את מפזר בוערים אתנול או לאפשר על ירידה הבוערים של אתנול ליפול לתוך המנה אתנול. לחלופין, השתמש ספוגית כותנה סטרילי חד פעמיות כדי להפיץ את החיידקים בצלחת, אשר דורשת אתנול או להבה.</li>
		<li>התור אגר MS צלחת עם יד אחת, תוך שימוש גב ותנועה הלאה כדי לחסן את הצלחת עם מפזר סטרילי.</li>
		<li>תקופת דגירה של 5 – 7 ימים ב- 30 ° C עד המתח sporulated היטב. הערה: הדגירה פעמים ישתנה בהתאם המין ואת המתח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף 2 מ ל תמיסת סטרילית (0.8% NaCl) למרכז של מדשאה confluent של תאים Streptomyces עבר הנבגה.</li>
	<li>הקציר נבגים על ידי שפשוף בעדינות את פני השטח של תפטיר עם סטרילי מזריקים לולאה (או במקלון צמר גפן), לאט לאט נע לכיוון הקצה של הדשא.</li>
	<li>Pipet מלוחים המכילים נבגים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. מערבולת נמרצות כדי לפרוץ נבג שרשראות תאים בודדים.</li>
	<li>צנטריפוגה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב x כ 2500 גרם.</li>
	<li>Pipet תגובת שיקוע, להשליך. לפזר בגדר נבג על ידי מערבולת נמרצת עצבנות סכום קטן של הנוזל הנותר.</li>
	<li>Resuspend הנבגים ב 1 מ"ל של גליצרול 20% על ידי ציור הפתרון למעלה ולמטה עם פיפטה.</li>
	<li>העברת המניות נבג גליצרול צינור מקפיא 1.5 mL. חנות ב-80 מעלות צלזיוס. התראה: שימוש כפפות בטיחות קריוגני, חלוק מעבדה כדי להגן על העור מפני מגע עם קור עז. לחלופין, ניתן להשתמש מקפיא-20 ° C עם פוטנציאל הפחתה של הכדאיות בזמן אחסון לטווח ארוך. הימנע מוגזמת הקפאה והפשרה של להרחיב את יכולת הקיום.</li>
</ol>5. ביצוע מוטגנזה מכוונת
<ol><li>לבצע מוטגנזה מכוונת בהתבסס על התוצאה הרצויה כמו המופנה מבוא ונבדקים לאחרונה על ידי Baltz, 201639. הערה: ניסויים phenotyping לא יחייבו את מוטגנזה מכוונת, כגון כוונה לזהות מינים חדשים מן הסביבה. שיטות מוטגנזה מכוונת אקראי כוללות השימוש של transposon8,9,10,11,12,13, קרינת UV, או כימיקלים14. האתר מכוון מוטגנזה מכוונת15,16,17,18,19,20 טכניקות יכול לשמש ליצירת מוטציות נקודה ספציפית, מחיקות, או סוגים אחרים של מוטציות.</li>
</ol>6. להשוות ולהקליט את המראה החזותי
<ol><li>שימו לב המושבה מורפולוגיה עבור כל מוטציה לעומת המתח פראי-סוג האב אחרי שהתרוצץ כל זנים כמו שלב 2. להשוות את בידוד חדשים לזה של זן למד היטב, כגון ס' coelicolor או S. venezuelae, בעת אפיון של זנים חדשים של Streptomyces . הערה המאפיינים (איור 1) כגון הצורה הבסיסית, משטח המושבה (מטושטש, קירח, מקומט, וכו), אטימות, העלאת ופיגמנטציה (להבדיל בין תפטיר וגטטיבי, תפטיר אווירי, ו/או בינוני שמסביב).</li>
	<li>תווית של אגר MS זנים פראי-סוג של מוטציה צלחת, פס בדפוסי טריז (איור 1). להיזהר כי זן לא נוגע עוד מאמץ כדי למנוע זיהום לחצות. הערה את התאריך והשעה שבהם זנים הם קווצות שער לצלחת. דגירה הצלחות ב- 30 ° C.</li>
	<li>המקום גדל פטרי בצבע או נייר לבן כדי homogenize את הרקע. לכתוב על נייר שם זן, תאריך, בטמפרטורת דגירה, זמן בצלחת הראשונה ומבטא. קח תמונות דיגיטליות של הצלחת עם המידע האחרון נכתב על רקע נייר כך בלבול הוא ממוזער. הערה: הכתיבה יכול להיחתך מן התצלום במועד מאוחר יותר אם זה שישמש עבור איור הכנה.</li>
</ol>7. ביצוע שלב-ניגודיות מיקרוסקופ
<ol><li>לעקר את תגליתו על ידי שטיפה 70% אתנול, ואז עובר להבה מבער בונזן מתמוססות האתנול. לאפשר להתקרר.</li>
	<li>לחטא coverslips על ידי שטיפה אתנול 70% ומאפשר להם להתייבש בצלחת פטרי סטריליות אז.</li>
	<li>
להכין טרמפ coverslip של הגידול חיידקי להיבדק.
	<ol>
<li>להרים coverslip עקר עם פינצטה סטרילי ולמקם את coverslip על צלחת אגר MS איפה צפופה התפתחות חיידקים. לחץ על גב coverslip בעדינות עם פינצטה כדי להבטיח העברת מספיק נבגים של חיידקים, תפטיר אווירי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאסוף את coverslip מהצלחת ולמקם אותו כך הצד עם החומר תא פונה לכיוון פני השטח של שקופית מיקרוסקופ, עם טיפת 15 µL גליצרול 50% במים מוכנים הרכבה. להפחית את בועות אוויר על-ידי הצבת את coverslip בזווית של 45° לשקופית ולתת לו ליפול על גבי גליצרול 50%.</li>
	<li>(אופציונלי) חותם עם נקי לק לשימור של השקופית.</li>
	<li>
ביצוע שלב-ניגודיות מיקרוסקופ כפי שתואר על ידי פרוליך40 במרווחי זמן שונים במהלך מחזורי החיים. הערה: הדמיה חוזרות מאפשר ניתוח מלא יותר את היכולת לזהות את עיכוב בהתפתחות. באופן עצמאי חזור על התצפיות כדי להבטיח דיוק הפארמצבטית.<ol>
<li>למקם את השקופית מוכנים על הבמה מיקרוסקופ, להוסיף טיפה של שמן טבילה למרכז של תגית כיסוי. לסובב את שלב X 100 מטרת למקם ולהגדיר צריח מעבה את הרקע המתאים שלב "תואמים". למקד את התמונה באמצעות רק הידית התאמת משובח פעם העדשה אובייקטיבית הוא במגע עם השמן.</li>
		<li>בחן מספר שדות ראייה להבחין ההבדלים ניכרת ועקבית בין זנים מוטציה לסוג הפראי, כגון היכולת טופס נבגים, נבג ו צורה בגודל המספר הכולל של נבגים (ראה איור 2). הערה: חלופות במיקרוסקופ ניגוד שלב כוללים התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC) מיקרוסקופיה40 , טכניקות צביעת פשוטה עבור שימוש עם שדה בהיר מיקרוסקופים41, כגון צביעת קריסטל ויולט.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. ביצוע מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית
<ol><li>לעקר את תגליתו על ידי שטיפה אתנול 70% ולאחר מכן הפעלה דרך להבה מבער בונזן.</li>
	<li>להרים coverslip עקר עם פינצטה סטרילי והמקום על צלחת אגר MS שבו ניכרת התפתחות חיידקים. לגעת בגב coverslip בעדינות עם הפינצטה כדי להבטיח העברת מספיק נבגים של חיידקים, חוטים אווירי.</li>
	<li>לאסוף את coverslip מהצלחת ולמקם אותו כך הצד עם החומר תא פונה למעלה, על כרטיסים על מנת להקל על מניפולציה של coverslip.</li>
	<li>להציף את coverslip עם מתנול כקרח (~ 300 µL עבור coverslip2 20 x 20 מ מ) ולתת לו לחלוטין אוויר יבש. זהירות: מתנול היא מוטגן. יש להימנע ממגע ישיר עם העור.</li>
	<li>לשטוף את coverslip שלוש פעמים פוספט Buffered מלוחים (PBS)42 על ידי בעדינות dispensing והסרה של הפתרון.</li>
	<li>להוסיף 15 µL של 100 μg/ml יודיד Propidium ו/או μg/מ"ל נבט-חיטה-Agglutinin מצומדת כדי fluorescein isothiocyanate (WGA-FITC) שבוצעו ב- 50% גליצרול שקופית שכותרתו מיקרוסקופ. הערה: Propidium יודיד כתמי DNA אדום כדי לזהות בהכפלת ה-DNA מיקום בזמן WGA-FITC כתמי קיר התא הירוק.</li>
	<li>היפוך coverslip עם הפנים כלפי מטה על גבי הירידה של הכתם פלורסנט בשקופית זכוכית. (אופציונלי) חותם עם לק ברורים לשימור של שקופית.  כמו הצבעים הם רגישים לאור, תקופת דגירה של 15 דקות בחדר החשוך או בתאורה עמומה.</li>
	<li>לצפות בשקופיות תחת עדשת 100 X המטרה באמצעות ניגוד שלב או מיקרוסקופ DIC מצויד epifluorescence עירור קוביות propidium יודיד (להגדיר מסנן 'טקסס אדום' או maxima עירור/פליטת 535/617 nm), FITC (FITC לסנן nm לקבוע או 490/525 maxima עירור/פליטה).</li>
	<li>במקום השקופית על הבמה ונוחות שימוש את ידיות התאמת בסדר וגסים.</li>
	<li>להתבונן על ידי קרינה פלואורסצנטית כפי שמוצג במקום43.</li>
	<li>השתמש חבילת תוכנה של תמונה חופשית ניתוח שיכול לעזור בזיהוי נבגים עם פלורסצנטיות נמוך העוצמה44.</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור מתחילים Streptomyces החוקרים ליזום מחקרים על-ידי הכללת השלבים הדרושים כדי להפיץ זנים ולהכין מניות לאחסון לטווח ארוך. לאחר מכן נתאר את הפרוטוקולים עבור אפיון ויזואלי, מיקרוסקופיים של זנים Streptomyces . כמה צעדים הראשונית טיפוסי phenotyping התפתחותית המוטציות הן: 1) בדיקה חזותית של המושבות מוטציה בהשוואה פראי סוג המושבות של אגר בינוני; 2) מיקרוסקופ שלב חדות; ו 3) זריחה מיקרוסקופיה של sporogenic hyphae אווירית. בהתבסס על פנוטיפ מוצגים שלושה שלבים אלה, במגוון טכניקות עשוי להיות מועסק להבחין נוספת של פנוטיפ למתח מסוים.
Phenotyping הראשונית ניסויים משמשים כדי לאפיין מינים חדשים, לזהות מוטציות של עניין, חלקית לאפיין מוטציות, ולהתחיל להבחין את התפקיד טיפוסי של גן מסוים על סמך על פנוטיפ של מזוהה מוטציה. כבר בשימוש בשיטות המתוארות כאן באוניברסיטה מלמד מעבדות כדי לזהות ולאפיין מגוון רחב של מוטציות Streptomyces , כולל אלה בעלי פגמים בחלוקת התא48,49, 50 , 51 , 52 , 53 , 54הנבגה55,56, תפטיר אווירי היווצרות57,58, ייצור לאנטיביוטיקה59, השליח השני איתות47, כרומוזום סגרגציה 60. שיטות אלה צעדים חיוניים לקביעת של פנוטיפ של מוטציות באופן כללי ולחשוף את כמות גדולה של מידע חשוב אודות התפקידים של הגנים של עניין. השיטות בקלות יורחב כדי מינים אחרים של Streptomyces , כבר השתמשו כדי לתאר את זני תזונתם העיקרי ס, ס venezuelae, גרדת סו streptomycetes רבים אחרים. הפרוטוקולים וידאו המתוארים כאן צפויים לשמש משאב חשוב עבור חוקרים חדשים נכנסים תחומי מחקר Streptomyces , כמו למשל בתחום גילוי תרופות. זה כולל את המדריכים החדשים אשר עובדים כדי להתמודד עם המשבר עמידות לאנטיביוטיקה ולחנך את מספרי אינספור של חוקרים הסטודנטים לתואר ראשון חדשים מצטרפים המאמצים מיקור המונים של היוזמה עולם קטן.
מהטכניקות שתוארו כאן ניתן בקלות להתאים לשימוש בכיתה במכללה ובתיכון בנוסף מעבדות מחקר, באמצעות השינויים המתוארים וידאו, טקסט. סטודנטים במודול מיקרוסקופ השנה הראשונה במכללה קטנה שבע האמנויות החופשיות הצליחו צובעות זנים, לקחת תמונות דיגיטליות של זנים גדל על אגר מדיה, ולבצע מיקרוסקופ שלב-ניגודיות, זריחה, אשר הגיע לשיאו הגשת תיק של דמויות רב ספון בקצה של המודול 3 בשבוע, המייצג h 15 של עבודה בבית-lab. כ 160 לתלמידי השנה הראשונה היו אחראים phenotyping הראשונית של מוטציות transposon הרומן 320. תלמידי מחקר לתואר ראשון במוסדות שלושה השתתפו את phenotyping הראשוני של מוטציות נוספות ואפיון עוקבות של הזנים רבים. הנתונים מקיף שהושג תוך תקופה קצרה יחסית של זמן, ממחישים את הערך של הפרוטוקולים המתוארים כאן. מאות מוטציות נוספות אוחסנו גליצרול מניות mycelial של אפיון בעתיד.
בעקבות הניסויים הראשוניים המתוארים כאן, מגוון שיטות עשוי להיות מועסק כדי להאריך את האיכות של מידע המתייחס זנים מעניינים. אם המוטציה אינם ידועים, שיטה genotyping צריך להיות מועסק כדי לקבוע את סוג ו/או מיקום המוטציה. לדוגמה, transposon אקראיים מוטגנזה מכוונת פראי-סוג כרומוזום6,7,8,9,10,11,12,13 תוצאות במושבות צריך עוברים הראשונית פנוטיפי במסכים כגון מהמתואר לעיל. אז המיקום של transposon צריכה להיות מזוהה באמצעות טכניקה כגון פולימראז הופכי תגובת שרשרת (iPCR)61. קביעת של גנוטיפ של מוטציות שהתגלתה היא צעד חשוב בעקבות משלב האפיון הראשוני.
כמה שיטות מתקדמות נפוץ לניתוח phenotyping הבאים עשויים להיות הזכיר בכיתה או חקר באמצעות מחקרי המשך כוללים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תיוג כדי לקבוע תבניות לוקליזציה עבור החלבון של עניין, ג'ין ביטוי ניתוחים כגון נדל בפעם ה-PCR כמותי (qPCR) ודפוסי ביטוי גנים הכללית של פראי-סוג לעומת מוטציה באמצעות ה-RNA רצף (RNA-seq). Phenotyping מיומנויות נדרשות גם לניתוח קומפלמנטציה גנטי. בניסוי קומפלמנטציה, העותק פראי-סוג של גנים מוחדרים זן שעבר שינוי כדי לקבוע אם אלל שנוספו לאחרונה יכול לפצות על האובדן-של-הפונקציה של אלל מוטציה. השוואת של פנוטיפ של המתח המלווים לזה של המוטציה המקורי והן את ההורים, פראי-סוג מאמץ נדרש.

Streptomycetes הם חיידקים גראם חיוביים, filamentous קרקע ידועה וביכולתם לייצר מגוון של מטבוליטים משניים, כולל שני שלישים של אנטיביוטיקה זמין מסחרית, כמו גם כמה אנטי הגידול, תרופות נגד איידס, ואני נגד טפילים 1. ס coelicolor הוא החבר מאופיין ביותר גנטית של סוג2,3 , והוא המין בשימוש בשיטות המתוארות כאן. ס coelicolor יש מחזור חיים מורכב מתחיל עם הנביטה של נבג יחיד, ומתחזקים נרחב, מסעף תפטיר צמח שגדל לתוך המדיום אגר. כל מחזור החיים של התמורה, חוטים אווירי נוצרות לשבור את מתח הפנים של תפטיר המצע, סוף סוף מחולקים שרשראות ארוכות של תאים מומרים בסופו של דבר נבגים בוגרת, גריי-פיגמנט. פיזור של נבגים שהוקם אלה מהווה את תחילת מחזור החיים הבא4.
בגלל שלה דפוס מורכבות של בידול, ס coelicolor משמש מודל מצוין עבור חקר התפתחות חיידקים. מבחינה היסטורית, מוטציות כתוצאה בבלוקים עבור שני שלבים עיקריים של פיתוח ומפיקים פנוטיפים חזותיים ברורים. המוטציות (קירח) בנין נחסמות על היווצרות תפטיר אווירי ולהוביל חוסר תפטיר אוויר מעורפל להקניית מראה המושבה "קירח". מוטציות עכבות במבנה נבג, ההבשלה מכונים מוטציות הל (לבן) כי הם בדרך כלל נכשלים לייצר רמות פראי-סוג של הפיגמנט נבג אפור תפטיר אוויר נשאר לבן. מוטאנטים מעניינים אחרים הם והשרירי לאנטיביוטיקה ייצור, חלוקת התא, סגרגציה כרומוזום או תהליכים חשובים אחרים,4,5.
למרות גילוי גנים התפתחותיים רבים במינים Streptomyces , ישנם רבים יותר האמינו להתקיים בהתבסס על חוסר הרוויה של מסכי מוטציה. מעבדות שלנו להמשיך לזהות גנים התפתחותיים חדשים באמצעות מערכת transposon מיני ואנחנו יש נבנה. הרומן זנים מוטציה מבודד בניסויים מוטגנזה מכוונת אקראי עם transposon שלנו עוברים סינון פנוטיפי כדי לזהות את תפקיד אפשרי של כל חדש ג'ין גילה6,7. שיטות phenotyping חיידקי המתוארים כאן הרלוונטיים מוטציות Streptomyces מבודדים-transposon מוטגנזה מכוונת8,9,10,11,12, 13 ו אקראית בשיטות אחרות, כגון כימי, אולטרה סגול (UV) מוטגנזה מכוונת14, כמו גם בנייה בבימויו של מוטציות כגון מחיקות הגן באמצעות15,recombineering16 או CRISPR-Cas9 (מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר) הגנום עריכה טכנולוגיה17,18,19 ו מוטציות נקודה20.
עמידות לאנטיביוטיקה בקרב פתוגנים הופך נפוץ יותר ויותר, הצורך אנטיביוטיקה חדשה הופך יותר ויותר דחוף21,22. "היוזמה עולם קטן" (או מושכל) הוא יעיל המדע, טכנולוגיה, הנדסה, מתמטיקה (גזע) למידה23 ומחקר אסטרטגיה24 כדי להילחם עמידות לאנטיביוטיקה דרך מיקור המונים של סטודנטים, ועוד לאחרונה תלמידי תיכון. תמיכה קורסים עבודתו כוללת זיהוי חיידקים אדמה חדשה לייצר אנטיביוטיקה הרומן (http://www.smallworldinitiative.org). הוא האמין כי המקור העיקרי של אנטיביוטיקה שעדיין לא התגלו ימשיכו להיות Streptomyces מינים נמצאו במגוון רחב של אדמה ומים בתי גידול25,26,27,28, 29,31. לאחרונה, המעבדה שלנו עבודתם של אחרים גילו והם יהיו מאופיין איתות גנים במינים Streptomyces המסדירים מורפולוגיה ופיתוח, לרבות ייצור לאנטיביוטיקה7,32. 33. שינויים בביטוי הגנים האלה לגרום שינוי הכמות ואת העיתוי של אנטיביוטיקה המיוצר. Phenotyping מיומן של מינים חדשים, המוטנטים מייצרי אנטיביוטיקה החדשים ימשיכו להיות חשוב. כמו מדריכים חדשים ותלמידים שלהם להיות התורמים העיקריים בתחום של גילוי תרופות, הכשרה phenotyping חיידקי הוא הכרחי עבור ההצלחה של אנשים אלה המתחיל. יתר על כן, הניסויים האלה הם צייתן בתיכון גזע או אוניברסיטת מיקרוביולוגיה החינוך מעבדות. הם מייצגים הפגנה של עקרונות יסוד גנטי מיקרוביאלי מעבדת הוראה הגדרת.

<table><tbody><tr><td>50% Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil (Type DF)</td><td>Cragille&amp;nbsp;</td><td>16482</td><td></td></tr><tr><td>Lens Paper</td><td>Fisherbrand</td><td>11-995</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Water</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-1L</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Toothpicks (flat)</td><td>Target</td><td>081-22-1957</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (10 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (200 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-200Y</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (1,250 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-1250</td><td></td></tr><tr><td>Wooden Applicators 6&#039;&#039;</td><td>Solon Care</td><td>070809</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swabs</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>Soy Flour&amp;nbsp;</td><td>Bob&#039;s Red Mill&amp;nbsp;</td><td>1516C164</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol 100%</td><td>VWR amresco life science&amp;nbsp;</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>0.8% NaCl (Saline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9000V</td><td></td></tr><tr><td>1.2 mL freezer tube</td><td>NEST</td><td>606101</td><td></td></tr><tr><td>Ultra low (-80 &amp;deg;C) freezer</td><td>SO-LOW</td><td>U85-18</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Safety Gloves</td><td>Bel-Art</td><td>H13201</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips #1.5</td><td>Thomas Scientific</td><td>64-0721</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Carolina</td><td>63-2010</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Tuttnauer</td><td>2540E</td><td></td></tr><tr><td>Phase-Contrast Microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>BX40</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Carolina Biological</td><td>624504</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>Carolina Biological</td><td>706706</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffer saline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>Biotium</td><td>29022-1</td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td>OPI</td><td>22001009000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Free Software</td><td></td></tr><tr><td>100 mL beaker</td><td>Pyrex USA</td><td>1000-T</td><td></td></tr><tr><td>1 L beaker</td><td>Carolina Biological</td><td>721253</td><td></td></tr><tr><td>1 L flask</td><td>Fisherbrand</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>250 mL flask</td><td>Pyrex USA</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>100 mL graduated cylinder</td><td>Carolina Biological</td><td>721788</td><td></td></tr><tr><td>500 mL graduated cylinder&amp;nbsp;</td><td>Carolina Biological</td><td>721792</td><td></td></tr><tr><td>Stir Bar</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-271825</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Camera for Microscope</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>Nitrile Examination Gloves (Med)</td><td>Bio Excell</td><td>71011002</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Carolina Biological</td><td>701077</td><td></td></tr></tbody></table>

visual and microscopic evaluation of streptomyces developmental mutants

Streptomycetes הם חיידקים אדמה filamentous השייכת שלקרוא Actinobacteria פזורים ברחבי העולם, לייצר מגוון רחב של אנטיביוטיקה, מטבוליטים משניים אחרים. Streptomyces coelicolor הוא מין מאופיין היטב, פתוגניים שאינם זה לבצע מגוון רחב של ניתוחים במעבדה. Phenotyping בשיטות המתוארות כאן להשתמש ס coelicolor כמו streptomycete דגם; עם זאת, השיטות ישימות כל בני הסוג גדולים, כמו גם כמה actinomycetes הקשורים קשר הדוק. Phenotyping יש צורך לאפיין מינים חדשים של Streptomyces זיהה בסביבה, זה גם צעד ראשון חיוני באפיון לאחרונה מבודד מוטציה זנים של Streptomyces. מיומנות ב phenotyping חשוב עבור החוקרים חדשים רבים אשר נכנסים לשדה המחקר Streptomyces , כולל המחקר של התפתחות חיידקים, חלוקת התא, כרומוזום סגרגציה השליח השני איתות. מיקור המונים האחרונות של גילוי לאנטיביוטיקה תוך בידודו של חיידקים אדמה חדשה הביאה צורך בהכשרה phenotyping למדריכים החדשים בשטח המחקר Streptomyces , מכללה או תיכון שלהם מוגבר סטודנטים. כתב יד זה מתאר שיטות הפצת זן חיידקי, אחסון של אפיון באמצעות בדיקה חזותית, מיקרוסקופיים. לאחר קריאת מאמר זה, חוקרים חדשים (מעבדות מיקרוביולוגיה החינוך ומדענים אזרח) אמור להיות מסוגל לתמרן זנים Streptomyces ולהתחיל אפיון ויזואלי ניסויים.

Phenotyping הראשונית ניסויים נחוצים עבור אפיון מינים חדשים, זנים, יכול לשמש בגישה חינם פילוגנטיקה, DNA-DNA הכלאה ניסויים המשמשות לטיפול באפיון של זנים חדשים. Streptomyces מוטציות הנובעות מוטגנזה מכוונת אקראית בשיטות כגון כימיקלים, UV, או transposon מוטגנזה מכוונת מזוהים בדרך כלל דרך מסכי ישירה, חזותי על פלטות אגר. מושבות של Streptomyces נבדקים לשינויים בפנוטיפ לעומת המתח פראי-סוג, הורים. לדוגמה, תפטיר אווירי בצבע בהיר מצביעים על רמה נמוכה יותר של פיגמנט האפור הנגרם על ידי פגם הנבגה, או חוסר מראה מטושטש מעידה על חסימה במבנה תפטיר אווירי (איור 1). Streptomycetes רבים לייצר אנטיביוטיקה פיגמנט תפטיר וגטטיבי או אגר שמסביב. ס coelicolor מייצרת שני סוגי אנטיביוטיקה פיגמנט, כמו גם שני אלה ללא פיגמנט. Actinorhodin הוא אנטיביוטיקה-פיגמנט כחול והוא undecylprodigiosin45-פיגמנט אדום לאנטיביוטיקה. זנים שעברו ראשוני המושבה החזותית מסכי מופצים ואז על ידי ומבטא עבור מושבות יחיד.
בעקבות זיהוי חזותי של פוטנציאל מעניין מוטציות, זנים הם נתון בבדיקה מיקרוסקופית. שלב-ניגודיות מיקרוסקופ מתאימה במיוחד לבחינת Streptomyces מוטציות פגמים התפתחותית, באמצעות הלחץ פראי-סוג כפקד (איור 2). מושבות ס coelicolor פראי סוג בדרך כלל לייצר של תפטיר מהאוויר על ידי כיומיים של צמיחה ב 30 מעלות צלזיוס על אגר MS, שרשראות ארוכות של נבגים על ידי שלושה ימים של צמיחה. מחזור חיי יתפתחו מעט איטי או מהיר יותר על סוגי מדיה אחרים. זה הכרחי כי המוטציות לנתח בתנאים צמיחה אותו כסוג פראי בעת הסקת מסקנות על ליקויים התפתחותיים, עיכובים. מוטציות קירח עשויה לייצר נבגי לאחר צמיחה ממושכת במדיה אגר. מחלקה של מוטציות המכונה מוטציות לבן עשוי להתעכב גם על היווצרות נבג, להראות ירידה השפע של נבגים המיוצר, נבגים תוצרת עם פגמים צורה ו/או גודל, או פשוט לייצר רמות נמוכות יותר של פיגמנט ספורה בוגרת, אפור46 . מוטאנטים אחרים נחקרו עד כה מתעכבת או מואצת בהתקדמות מחזור החיים כגון המוטציות יושפע עבור ההצטברות של מולקולות (למשל, מחזורית-di-GMP47) איתות.
המשך פשוט הטכניקה מיקרוסקופ אור שתוארו לעיל היא מיקרוסקופ פלורסצנטיות באמצעות propidium יודיד הכתם בהכפלת ה-DNA nucleoids, agglutinin fluorescently שכותרתו נבט חיטה כתם בדופן התא הנבגה septa. נבגים חסר כרומוזום יהיה חסר יודיד propidium אדום מכתים, בעוד נבגים המכילים את הדנ א פחות מכפי הרגיל ניתן לזהות אם הם מופיעים כדי ירדו מכתים (איור 3). נבט חיטה agglutinin עשוי לשמש כדי להכתים את דופן התא, ייבחנו הבדלים דופן התא מכתים דפוסים (כלומר, חלוקת התא פגמים). בזן איור 4 הפראי-סוג של ס' venezuelae, זן לאחרונה משמשת כמודל עוד streptomycete בשל מחזור החיים מהיר יותר היכולת sporulate ב נוזלי45, יש נוטף WGA-FITC להבהיר המערך דמוי סולם של החטיבה septa שהם ראו בדרך כלל מוקדם במהלך הנבגה.
האסטרטגיות phenotyping הראשונית המתוארים כאן יביא הפעולות הבאות: 1) זיהוי זנים mutant הריבית ללימוד נוסף; 2) רכשה את הידע החשבונאי שזוהה ועל התפקיד הפוטנציאלי של גן זה יש כבר מוטציה; 3) ניסוח של סדרת השלבים הבאים ניסיוני יכול לשמש כדי להבהיר עוד יותר את התפקיד של הגן המדובר עוקבות. במקרה של streptomycete שזוהה מן הסביבה, החוקר יקבל ידע של מינים חדשים פוטנציאליים בהשוואה כבר מאופיין מינים של Streptomyces.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig1.jpg"> איור 1: תצלום של צלחת אגר נציג הוכחת המושבה מאקרוסקופית פנוטיפים של S. coelicolor. צלחת אגר מראה מעורפל, אפור המראה החזותי של תפטיר אווירי עבור פראי-סוג coelicolor ס זן MT1110 (WT) בהשוואה transposon אקראיים שונים ההכנסה מוטציות עם פנוטיפים התפתחותית. מוטציות חסרים גם של תפטיר אווירי [קירח (בנין)] או של תפטיר אווירי עם פיגמנטציה נבג מופחתת [לבן (א)]. מוטציות transposon נוצרו באמצעות מיני-Tn5 עבור הכניסה מוטגנזה מכוונת6,7. הזנים היו מבוגרים על MS אגר במשך 5 ימים ב- 30 ° C. צלחת פטרי קוטר 100 מ מ.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig2.jpg"> איור 2: שלב-ניגודיות micrographs מציג נציג אווירי בשביל המוטציה S. coelicolor לבן זנים המכילים transposon אקראיים ההכנסה מוטציות. (א) מוצג הוא פילמנט אווירי נציג פראי סוג עבר חלוקות תאים סינכרונית, המרווחות באופן קבוע, ייצור אחיד בצורת, בגודל נבגים (MT1110). (B–F) הלוחות הנותרים מראים על הפנוטיפים מיקרוסקופיים שונה לחלוטין של מוטציות לבן שונים שהיו מבודדים באמצעות מוטגנזה מכוונת transposon אקראיים. פאנל B מראה של פילמנט אווירי לא עבר הנבגה, אך במקום זאת הפיק בולטות שטחים בתוך חוט הלהט. חיצים ארוכים ב- C, Dו- F מציינים נבגים גדולה באופן חריג האופייניים של מוטציות MIC42, MIC43 ו- TH49. החץ קצר בחלונית D מציין דוגמה תא נבג lysed. פאנל E מראה התאים קטנים יותר בחלקו מכווץ האופייניים של הרשתות נבג המיוצר על ידי מוטציה TH10. הזנים היו מבוגרים על MS אגר במשך 5 ימים ב- 30 ° C. המוטציות אינן קשורות לאלו המוצגות באיור1. נבג פראי סוג הוא כ 1.1 מיקרומטר על ציר זמן. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2.jpg"> איור 3: נציג micrographs מראה coelicolor ס מוטציה כרומוזום פנוטיפים סגרגציה. (א) A תרשים ייצוג מראה פראי-סוג, המרווחות באופן קבוע צביעת במראה הטיפוסי של שרשרת של נבגים (כל נבג מכיל DNA כרומוזומלית) לעומת התבנית מכתימים לסירוגין עבור מוטנט המציג כרומוזום סגרגציה פגם. (B) לכל זוג פאנלים מראה הנבג באותה שרשרת שנצפה על ידי ניגודיות התערבות דיפרנציאלית (DIC) התמונה משמאל תמונת פלורסצנטיות שהוכתמו יודיד propidium מוצגת בצד הימין. פנוטיפ פראי-סוג (a, b) לעומת שתי מוטציות ההכנסה transposon אקראיים (c, d ו- e, f). חיצים מציינים נבגים ללא ה-DNA. הזנים היו מבוגרים על MS אגר במשך 5 ימים ב- 30 ° C. המוטציות המוצגות אינן קשורות לאלו איור 1 ו- 2 איור. סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3.jpg"> איור 4: זריחה micrograph של זן פראי-סוג venezuelae ס מוכתם WGA-FITC. (א) A תרשים של פילמנט אווירי מופיעה חלקה עם אין כניסות ויש סימנים נראים לעין הנבגה באמצעות מיקרוסקופ שלב-ניגודיות בהשוואה המערך דמוי סולם של צביעת קיר התא, זה מצביע על שלב מוקדם הנבגה החלה את הלהט אותו באמצעות WGA-FITC תחת מיקרוסקופ זריחה. Micrographs (B) של פראי-סוג venezuelae ס. חוטים אווירי חלקה () נמצאים בין שרשראות של נבגים. (b) במרחק תפטיר שמוצג בחלונית, אחד נימה אווירי בשלב מוקדם בהתפתחות הנו מערך דמוי סולם של דופן התא התצהיר. חיצים מציינים היווצרות המרווחות באופן קבוע של צלב-קירות מוכתמת WGA-FITC המתפתחים באופן סינכרוני בתוך פילמנט אווירי יחיד כמו זה עובר הנבגה הקשורים נכה. המתח היה גדל על MYM MYM (altoseמ', תמצית מזרח Y, תמצית alt מ') אגר במשך 38 h ב- 30 ° C. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants at JoVE.com

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

הערכות חזותי מיקרוסקופיים של מוטציות התפתחותית Streptomyces

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור המתחיל החוקרים ליזום phenotyping עבור סוג חיידקים חשובים פרמקולוגית של Streptomyces.

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

visual-microscopic-evaluation-streptomyces-developmental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

17.6K Views.  Otterbein University. כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור המתחיל החוקרים ליזום phenotyping עבור סוג חיידקים חשובים פרמקולוגית של Streptomyces.

Video: Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Genetics

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

תא הדמיה חיה של Bacillus subtilis ו Streptococcus pneumoniae באמצעות מיקרוסקופית אוטומטי זמן לשגות

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

לימוד לחץ חימצוני נגרם על-ידי Streptococci קבוצה מיטיס ב Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Developmental Biology

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Biology

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

זמן לשגות הדמיה הקרינה של השלם<em&gt; S. venezuelae</em&gt; מחזור החיים באמצעות מכשיר microfluidic

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a plethora of mutant strains and technical tricks have been developed to allow sophisticated questions to be asked and answered in a reasonable amount of time. Fundamental insight into the interplay of components of all known major signaling pathways has been obtained in forward and reverse genetic Drosophila studies. The fly eye has proven to be exceptionally well suited for mutational analysis, since, under laboratory conditions, flies can survive without functional eyes. Furthermore, the surface of the insect eye is composed of some 800 individual unit eyes (facets or ommatidia) that form a regular, smooth surface when looked at under a dissecting microscope. Thus, it is easy to see whether a mutation might affect eye development or growth by externally looking for the loss of the smooth surface ('rough eye' phenotype; Fig. 1) or overall eye size, respectively (for examples of screens based on external eye morphology see e.g.1). Subsequent detailed analyses of eye phenotypes require fixation, plastic embedding and thin-sectioning of adult eyes.
The Drosophila eye develops from the so-called eye imaginal disc, a bag of epithelial cells that proliferate and differentiate during larval and pupal stages (for review see e.g. 2). Each ommatidium consists of 20 cells, including eight photoreceptors (PR or R-cells; Fig. 2), four lens-secreting cone cells, pigment cells ('hexagon' around R-cell cluster) and a bristle. The photoreceptors of each ommatidium, most easily identified by their light sensitive organelles, the rhabdomeres, are organized in a trapezoid made up of the six "outer" (R1-6) and two "inner" photoreceptors (R7/8; R8 [Fig. 2] is underneath R7 and thus only seen in sections from deeper areas of the eye). The trapezoid of each facet is precisely aligned with those of its neighbors and the overall anteroposterior and dorsoventral axes of the eye (Fig. 3A). In particular, the ommatidia of the dorsal and ventral (black and red arrows, respectively) halves of the eye are mirror images of each other and correspond to two chiral forms established during planar cell polarity signaling (for review see e.g. 3).
The method to generate semi-thin eye sections (such as those presented in Fig. 3) described here is slightly modified from the one originally described by Tomlinson and Ready4. It allows the morphological analysis of all cells except for the transparent cone cells. In addition, the pigment of R-cells (blue arrowheads in Fig. 2 and 3) can be used as a cell-autonomous marker for the genotype of a R-cell, thus genetic requirements of genes in a subset of R-cells can readily be determined5,6.

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

A standard approach to prepare adult Drosophila eyes for semi-thin sectioning and light microscopic analysis is presented here. The protocol can be used for gross morphological analysis of eye defects, or with the indicated adjustments can be used to determine genetic requirements of genes in specific cell types of the eye (e.g. clonal analysis of photoreceptors) or for electron microscopic analysis.

הכנת למבוגרים תסיסנית עיניים עבור חתך דק ניתוח מיקרוסקופי

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

ויזואליזציה של Germinosomes, את הקרום הפנימי בנבגים Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Bioengineering

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. The non-replicative elementary body (EB) initiates infection of the host. Once inside, the EB differentiates into the reticulate body (RB). The RB then undergoes multiple rounds of replication, before differentiating back to the infectious EB form. This cycle is essential for chlamydial survival as failure to switch between cell types prevents either host invasion or replication.
Limitations in genetic techniques due to the obligate intracellular nature of Chlamydia have hampered identification of the molecular mechanisms involved in the cell-type development. We designed a novel dual promoter-reporter plasmid system that, in conjunction with live-cell microscopy, allows for the visualization of cell type switching in real time. To identify genes involved in the regulation of cell-type development, the live-cell promoter-reporter system was leveraged for the development of a forward genetic approach by combining chemical mutagenesis of the dual reporter strain, imaging and tracking of Chlamydia with altered developmental kinetics, followed by clonal isolation of mutants. This forward genetic workflow is a flexible tool that can be modified for directed interrogation into a wide range of genetic pathways.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

This protocol utilizes fluorescent promoter-reporters, live-cell microscopy, and individual inclusion extraction in a directed forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants of Chlamydia trachomatis.

גישה גנטית חיה-תא קדימה לזהות ולבודד מוטנטים התפתחותיים ב trachomatis כלמידיה

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic changes are regulated by a complex signaling network controlled in response to environmental stimuli. These regulatory components have been highly studied, but almost all studies use a variety of in vitro stimuli to trigger filamentation. To determine how morphogenesis is regulated during the pathogenesis process, we developed an in vivo microscopy system to obtain high spatial resolution images of organisms undergoing hyphal formation within the mammalian host. The protocol presented here describes the use of this system to screen small collections of C. albicans mutant strains, allowing us to identify key regulators of morphogenesis as it occurs at the site of infection. Representative results are presented, demonstrating that some regulators of morphogenesis, such as the transcriptional regulator Efg1, have consistent phenotypes in vitro and in vivo, whereas other regulators, such as adenyl cyclase (Cyr1), have significantly different phenotypes in vivo compared to in vitro.

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

This manuscript describes a method for screening moderately sized Candida albicans mutant libraries for morphogenesis phenotypes during active infection in a mammalian host using non-invasive confocal microscopy.

שימוש בהדמיית in vivo לבדיקת פנוטיפים של מורפוגנזה בזנים מוטנטיים של קנדידה אלביקנס במהלך זיהום פעיל בפונדקאי של יונקים

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching mycoheterotrophic plants (i.e., plants that obtain carbon from fungi), remarkable aspects of their structural adaptations, the patterns of tissue colonization by fungi, and the morphoanatomy of subterranean organs can enlighten their developmental strategies and their relationships with hyphae, the source of nutrients. Another important role of symbiotic fungi is related to the germination of orchid seeds; all Orchidaceae species are mycoheterotrophic during germination and seedling stage (initial mycoheterotrophy), even the ones that photosynthesize in adult stages. Due to the lack of nutritional reserves in orchid seeds, fungal symbionts are essential to provide substrates and enable germination. Analyzing germination stages by structural perspectives can also answer important questions regarding the fungi interaction with the seeds. Different imaging techniques can be applied to unveil fungi endophytes in plant tissues, as are proposed in this article. Freehand and thin sections of plant organs can be stained and then observed using light microscopy. A fluorochrome conjugated to wheat germ agglutinin can be applied to the fungi and co-incubated with Calcofluor White to highlight plant cell walls in confocal microscopy. In addition, the methodologies of scanning and transmission electron microscopy are detailed for mycoheterotrophic orchids, and the possibilities of applying such protocols in related plants is explored. Symbiotic germination of orchid seeds (i.e., in the presence of mycorrhizal fungi) is described in the protocol in detail, along with possibilities of preparing the structures obtained from different stages of germination for analyses with light, confocal, and electron microscopy.

This protocol aims to provide detailed procedures for collecting, fixing, and maintaining mycoheterotrophic plant samples, applying different microscopy techniques such as scanning and transmission electron microscopy, light, confocal, and fluorescence microscopy to study fungal colonization in plants tissues and seeds germinated with mycorrhizal fungi.

טכניקות מיקרוסקופיה לפענוח התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים מיקוהטרוטרופיים ונביטה סימביוטית של זרעים

Structural botany is an indispensable perspective to fully understand the ecology, physiology, development, and evolution of plants. When researching ...

הערכות חזותי מיקרוסקופיים של מוטציות התפתחותית Streptomyces

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח