המחברים רוצה להכיר Otterbein אוניברסיטת מענקי מחקר של סטודנטים לתואר ראשון, תלמיד מחקר קרן פרסים GVK, SGK; האנדרטה פרופסור גילברט אי מילס Otterbein ניחן פרס תוכנית שבתון, המחלקה לביולוגיה, מדעי כדור הארץ סגל מחקר ולמדנות ניחן פרס מכה. ברט וקרן ג'יין קרן ניחן תלמיד מחקר במדעי הוענק GVK ו- SGK. המחברים גם רוצה להכיר בהכרת תודה שדוקיין האוניברסיטה במימון מלגות תוכנית מחקר לתואר ראשון עבור GVK ו- SGK. תלמידי מחקר לתואר ראשון לשעבר Juniata קולג ', ריאן ג'ונסון ודרייפר לינדסי תרם את התמונות במיקרוסקופ על דמויות 2 ו- 3, בהתאמה.

1. מכינים כלי נגינה, תרבות המדיה, פתרונות, צלחות פטרי
<ol><li>אוטוקלב קיסמים בתוך 50 מ ל מכוסה ברדיד אלומיניום, כדי לשמור על סטריליות.</li>
	<li>לעקר כל אבזרי זה יהיה בשימוש החיטוי (טיפים, מקלות, כלי זכוכית, וכו '). הערה: זהירות! בצע את ההוראות כל בטיחות עבור דגם אוטוקלב בשימוש. אוטוקלאבים להוות סיכון פיצוצים, כוויות אדים, מגע עם משטחים חמים, חומרים, מדיה. אוטוקלב בטיחות, להציג "שימוש נאות של אוטוקלאבים"34.</li>
	<li>
הכינו MS אגר (מניטול סויה קמח (SFM))14 לגדול תרבויות.
	<ol>
<li>להוסיף 5 g של קמח סויה, 5 g של אגר בקבוק 1 ליטר.</li>
		<li>להמיס 5 גר' מניטול ב 250 מ של מי ברז, לוותר על תוך הבקבוק המכילות את קמח הסויה ואת אגר.</li>
		<li>להוסיף את קצף תקע ו רדיד אלומיניום לפתיחה של הבקבוק, החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס, 15 psi במשך לפחות 30 דקות. התראה: בינוני שחין בקלות. השתמש בקבוקון שיכול להכיל לפחות ארבע פעמים נפח בפועל של MS אגר להיות בלוק. סיר לחץ סטנדרטי יכול לשמש במקום החיטוי עם שיקולי בטיחות דומה. לחלופין, ניתן להשתמש תנור מיקרוגל לחטא מדיה וחומרים אם גישה החיטוי אינו אפשרי35,36. מורים בתיכון ייתכן שתרצה גם לשתף פעולה עם מקומיים מכללות או אוניברסיטאות לגשת אספקה בלוק.</li>
		<li>מדיה מגניב עד נוח מספיק כדי להתמודד. להיזהר לא לצנן את זה במשך זמן רב מדי, כי אגר עפור בטמפרטורה שמתחת 50 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>שופכים את MS אגר מ הבקבוק לתוך צלחות פטרי סטריליות עד בתחתית כל צלחת פטרי הוא בערך חצי מלא (כ 25 מ"ל של מדיה לכל צלחת פטרי). אפשר לגבש לפני השימוש פלטות אגר. חנות פלטות אגר בשקית ניילון בטמפרטורת החדר עד שהוא נדרש. הערה: פלטות אגר גם ניתן לאחסן במקרר, במיוחד אם אנטיביוטיקה יש צורך בכלי התקשורת.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. רצף Streptomyces על גבי לוחות עבור הפצת
<ol><li>זני Streptomyces פס על גבי פלטות אגר MS למושבות יחיד באמצעות שיטה סטנדרטית, כגון המשולש צובעות שיטה כפי שמוצג סנדרס, 201237. הערה: ללולאה לחסן או קיסמים סטרילי עשוי לשמש. אופציונלי: מדיה אחרים משמשים עבור מינים Streptomyces , כגון R2YE ותקשורתי מזערי14.</li>
	<li>דגירה הצלחות ב- 30 ° C.</li>
	<li>Restreak הצלחות על-ידי בחירת שמושבה בודדת כל 4-6 ימים. כמו מושבות גיל שהם הופכים נוטה מוטציה אקראית.</li>
</ol>3. ליצור את מניות Mycelial גליצרול לאחסון חיידקי
הערה: Mycelial מניות יהיה ליצור עבור כל זני Streptomyces , כולל בעת שנסע בנין זנים, ואת מוטאנטים התפתחותיים אחרים, כי הם אפשרות להשלים הנבגה.
<ol><li>Macerate 15-20 מושבות ב 200-500 µL של גליצרול 20% שימוש של המוליך פינים מעץ סטרילי.</li>
	<li>להעביר את slurry של המושבות התמוסס 1.5 mL מקפיא תרבות צינור, באמצעות micropipette או פיפטה העברה סטרילי. הערה: היסודות של שימוש micropipette מכוסים במקום38.</li>
	<li>להוסיף גליצרול 20% מספיק כדי להפוך את עוצמת הקול הסופי 1 מ"ל ומערבבים בעדינות. מאגר דגימות ב-80 מעלות צלזיוס. הערה: זהירות! כפפות בטיחות קריוגני שימוש, חלוק מעבדה כדי להגן על העור מפני מגע עם קור עז. לחלופין, ניתן להשתמש מקפיא-20 ° C עם פוטנציאל הפחתה בזמן אחסון לטווח ארוך. הימנע מוגזמת הקפאה והפשרה של להרחיב את יכולת הקיום.</li>
</ol>4. ליצור גליצרול נבג מניות עבור זנים מסוגל הנבגה
הערה: נבג מניות עדיפים הכדאיות לטווח ארוך אבל רק ריאלי עבור זנים המסוגלים השלמת הנבגה.
<ol><li>
מורחים µL 100 התמוסס חומר (מתוך שלב 3.1) על צלחת אגר להשיג דשא confluent של צמיחה37. הערה: התפשטות ציפוי מוצג סנדרס37 (שינוי: מסתובב אינה נדרשת.). הלוח ניתן להפעיל ביד אחת תוך שימוש ביד האחרת כדי להזיז את מפזר באופן עדין הלוך תנועה על פני התקשורת אגר.<ol>
<li>Pipet 100 µL של תפטיר התמוסס למרכז צלחת אגר MS.</li>
		<li>לחטא של זכוכית או מתכת הפצת הכלי על ידי חלקית השוקע 70% אתנול ולהעביר את מפזר פעם לאט דרך להבה מבער בונזן לזרז האידוי של האתנול. התראה: אתנול הוא דליק. אין למקם את מפזר בוערים אתנול או לאפשר על ירידה הבוערים של אתנול ליפול לתוך המנה אתנול. לחלופין, השתמש ספוגית כותנה סטרילי חד פעמיות כדי להפיץ את החיידקים בצלחת, אשר דורשת אתנול או להבה.</li>
		<li>התור אגר MS צלחת עם יד אחת, תוך שימוש גב ותנועה הלאה כדי לחסן את הצלחת עם מפזר סטרילי.</li>
		<li>תקופת דגירה של 5 – 7 ימים ב- 30 ° C עד המתח sporulated היטב. הערה: הדגירה פעמים ישתנה בהתאם המין ואת המתח.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף 2 מ ל תמיסת סטרילית (0.8% NaCl) למרכז של מדשאה confluent של תאים Streptomyces עבר הנבגה.</li>
	<li>הקציר נבגים על ידי שפשוף בעדינות את פני השטח של תפטיר עם סטרילי מזריקים לולאה (או במקלון צמר גפן), לאט לאט נע לכיוון הקצה של הדשא.</li>
	<li>Pipet מלוחים המכילים נבגים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. מערבולת נמרצות כדי לפרוץ נבג שרשראות תאים בודדים.</li>
	<li>צנטריפוגה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות ב x כ 2500 גרם.</li>
	<li>Pipet תגובת שיקוע, להשליך. לפזר בגדר נבג על ידי מערבולת נמרצת עצבנות סכום קטן של הנוזל הנותר.</li>
	<li>Resuspend הנבגים ב 1 מ"ל של גליצרול 20% על ידי ציור הפתרון למעלה ולמטה עם פיפטה.</li>
	<li>העברת המניות נבג גליצרול צינור מקפיא 1.5 mL. חנות ב-80 מעלות צלזיוס. התראה: שימוש כפפות בטיחות קריוגני, חלוק מעבדה כדי להגן על העור מפני מגע עם קור עז. לחלופין, ניתן להשתמש מקפיא-20 ° C עם פוטנציאל הפחתה של הכדאיות בזמן אחסון לטווח ארוך. הימנע מוגזמת הקפאה והפשרה של להרחיב את יכולת הקיום.</li>
</ol>5. ביצוע מוטגנזה מכוונת
<ol><li>לבצע מוטגנזה מכוונת בהתבסס על התוצאה הרצויה כמו המופנה מבוא ונבדקים לאחרונה על ידי Baltz, 201639. הערה: ניסויים phenotyping לא יחייבו את מוטגנזה מכוונת, כגון כוונה לזהות מינים חדשים מן הסביבה. שיטות מוטגנזה מכוונת אקראי כוללות השימוש של transposon8,9,10,11,12,13, קרינת UV, או כימיקלים14. האתר מכוון מוטגנזה מכוונת15,16,17,18,19,20 טכניקות יכול לשמש ליצירת מוטציות נקודה ספציפית, מחיקות, או סוגים אחרים של מוטציות.</li>
</ol>6. להשוות ולהקליט את המראה החזותי
<ol><li>שימו לב המושבה מורפולוגיה עבור כל מוטציה לעומת המתח פראי-סוג האב אחרי שהתרוצץ כל זנים כמו שלב 2. להשוות את בידוד חדשים לזה של זן למד היטב, כגון ס' coelicolor או S. venezuelae, בעת אפיון של זנים חדשים של Streptomyces . הערה המאפיינים (איור 1) כגון הצורה הבסיסית, משטח המושבה (מטושטש, קירח, מקומט, וכו), אטימות, העלאת ופיגמנטציה (להבדיל בין תפטיר וגטטיבי, תפטיר אווירי, ו/או בינוני שמסביב).</li>
	<li>תווית של אגר MS זנים פראי-סוג של מוטציה צלחת, פס בדפוסי טריז (איור 1). להיזהר כי זן לא נוגע עוד מאמץ כדי למנוע זיהום לחצות. הערה את התאריך והשעה שבהם זנים הם קווצות שער לצלחת. דגירה הצלחות ב- 30 ° C.</li>
	<li>המקום גדל פטרי בצבע או נייר לבן כדי homogenize את הרקע. לכתוב על נייר שם זן, תאריך, בטמפרטורת דגירה, זמן בצלחת הראשונה ומבטא. קח תמונות דיגיטליות של הצלחת עם המידע האחרון נכתב על רקע נייר כך בלבול הוא ממוזער. הערה: הכתיבה יכול להיחתך מן התצלום במועד מאוחר יותר אם זה שישמש עבור איור הכנה.</li>
</ol>7. ביצוע שלב-ניגודיות מיקרוסקופ
<ol><li>לעקר את תגליתו על ידי שטיפה 70% אתנול, ואז עובר להבה מבער בונזן מתמוססות האתנול. לאפשר להתקרר.</li>
	<li>לחטא coverslips על ידי שטיפה אתנול 70% ומאפשר להם להתייבש בצלחת פטרי סטריליות אז.</li>
	<li>
להכין טרמפ coverslip של הגידול חיידקי להיבדק.
	<ol>
<li>להרים coverslip עקר עם פינצטה סטרילי ולמקם את coverslip על צלחת אגר MS איפה צפופה התפתחות חיידקים. לחץ על גב coverslip בעדינות עם פינצטה כדי להבטיח העברת מספיק נבגים של חיידקים, תפטיר אווירי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאסוף את coverslip מהצלחת ולמקם אותו כך הצד עם החומר תא פונה לכיוון פני השטח של שקופית מיקרוסקופ, עם טיפת 15 µL גליצרול 50% במים מוכנים הרכבה. להפחית את בועות אוויר על-ידי הצבת את coverslip בזווית של 45° לשקופית ולתת לו ליפול על גבי גליצרול 50%.</li>
	<li>(אופציונלי) חותם עם נקי לק לשימור של השקופית.</li>
	<li>
ביצוע שלב-ניגודיות מיקרוסקופ כפי שתואר על ידי פרוליך40 במרווחי זמן שונים במהלך מחזורי החיים. הערה: הדמיה חוזרות מאפשר ניתוח מלא יותר את היכולת לזהות את עיכוב בהתפתחות. באופן עצמאי חזור על התצפיות כדי להבטיח דיוק הפארמצבטית.<ol>
<li>למקם את השקופית מוכנים על הבמה מיקרוסקופ, להוסיף טיפה של שמן טבילה למרכז של תגית כיסוי. לסובב את שלב X 100 מטרת למקם ולהגדיר צריח מעבה את הרקע המתאים שלב "תואמים". למקד את התמונה באמצעות רק הידית התאמת משובח פעם העדשה אובייקטיבית הוא במגע עם השמן.</li>
		<li>בחן מספר שדות ראייה להבחין ההבדלים ניכרת ועקבית בין זנים מוטציה לסוג הפראי, כגון היכולת טופס נבגים, נבג ו צורה בגודל המספר הכולל של נבגים (ראה איור 2). הערה: חלופות במיקרוסקופ ניגוד שלב כוללים התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC) מיקרוסקופיה40 , טכניקות צביעת פשוטה עבור שימוש עם שדה בהיר מיקרוסקופים41, כגון צביעת קריסטל ויולט.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. ביצוע מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית
<ol><li>לעקר את תגליתו על ידי שטיפה אתנול 70% ולאחר מכן הפעלה דרך להבה מבער בונזן.</li>
	<li>להרים coverslip עקר עם פינצטה סטרילי והמקום על צלחת אגר MS שבו ניכרת התפתחות חיידקים. לגעת בגב coverslip בעדינות עם הפינצטה כדי להבטיח העברת מספיק נבגים של חיידקים, חוטים אווירי.</li>
	<li>לאסוף את coverslip מהצלחת ולמקם אותו כך הצד עם החומר תא פונה למעלה, על כרטיסים על מנת להקל על מניפולציה של coverslip.</li>
	<li>להציף את coverslip עם מתנול כקרח (~ 300 µL עבור coverslip2 20 x 20 מ מ) ולתת לו לחלוטין אוויר יבש. זהירות: מתנול היא מוטגן. יש להימנע ממגע ישיר עם העור.</li>
	<li>לשטוף את coverslip שלוש פעמים פוספט Buffered מלוחים (PBS)42 על ידי בעדינות dispensing והסרה של הפתרון.</li>
	<li>להוסיף 15 µL של 100 μg/ml יודיד Propidium ו/או μg/מ"ל נבט-חיטה-Agglutinin מצומדת כדי fluorescein isothiocyanate (WGA-FITC) שבוצעו ב- 50% גליצרול שקופית שכותרתו מיקרוסקופ. הערה: Propidium יודיד כתמי DNA אדום כדי לזהות בהכפלת ה-DNA מיקום בזמן WGA-FITC כתמי קיר התא הירוק.</li>
	<li>היפוך coverslip עם הפנים כלפי מטה על גבי הירידה של הכתם פלורסנט בשקופית זכוכית. (אופציונלי) חותם עם לק ברורים לשימור של שקופית.  כמו הצבעים הם רגישים לאור, תקופת דגירה של 15 דקות בחדר החשוך או בתאורה עמומה.</li>
	<li>לצפות בשקופיות תחת עדשת 100 X המטרה באמצעות ניגוד שלב או מיקרוסקופ DIC מצויד epifluorescence עירור קוביות propidium יודיד (להגדיר מסנן 'טקסס אדום' או maxima עירור/פליטת 535/617 nm), FITC (FITC לסנן nm לקבוע או 490/525 maxima עירור/פליטה).</li>
	<li>במקום השקופית על הבמה ונוחות שימוש את ידיות התאמת בסדר וגסים.</li>
	<li>להתבונן על ידי קרינה פלואורסצנטית כפי שמוצג במקום43.</li>
	<li>השתמש חבילת תוכנה של תמונה חופשית ניתוח שיכול לעזור בזיהוי נבגים עם פלורסצנטיות נמוך העוצמה44.</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור מתחילים Streptomyces החוקרים ליזום מחקרים על-ידי הכללת השלבים הדרושים כדי להפיץ זנים ולהכין מניות לאחסון לטווח ארוך. לאחר מכן נתאר את הפרוטוקולים עבור אפיון ויזואלי, מיקרוסקופיים של זנים Streptomyces . כמה צעדים הראשונית טיפוסי phenotyping התפתחותית המוטציות הן: 1) בדיקה חזותית של המושבות מוטציה בהשוואה פראי סוג המושבות של אגר בינוני; 2) מיקרוסקופ שלב חדות; ו 3) זריחה מיקרוסקופיה של sporogenic hyphae אווירית. בהתבסס על פנוטיפ מוצגים שלושה שלבים אלה, במגוון טכניקות עשוי להיות מועסק להבחין נוספת של פנוטיפ למתח מסוים.
Phenotyping הראשונית ניסויים משמשים כדי לאפיין מינים חדשים, לזהות מוטציות של עניין, חלקית לאפיין מוטציות, ולהתחיל להבחין את התפקיד טיפוסי של גן מסוים על סמך על פנוטיפ של מזוהה מוטציה. כבר בשימוש בשיטות המתוארות כאן באוניברסיטה מלמד מעבדות כדי לזהות ולאפיין מגוון רחב של מוטציות Streptomyces , כולל אלה בעלי פגמים בחלוקת התא48,49, 50 , 51 , 52 , 53 , 54הנבגה55,56, תפטיר אווירי היווצרות57,58, ייצור לאנטיביוטיקה59, השליח השני איתות47, כרומוזום סגרגציה 60. שיטות אלה צעדים חיוניים לקביעת של פנוטיפ של מוטציות באופן כללי ולחשוף את כמות גדולה של מידע חשוב אודות התפקידים של הגנים של עניין. השיטות בקלות יורחב כדי מינים אחרים של Streptomyces , כבר השתמשו כדי לתאר את זני תזונתם העיקרי ס, ס venezuelae, גרדת סו streptomycetes רבים אחרים. הפרוטוקולים וידאו המתוארים כאן צפויים לשמש משאב חשוב עבור חוקרים חדשים נכנסים תחומי מחקר Streptomyces , כמו למשל בתחום גילוי תרופות. זה כולל את המדריכים החדשים אשר עובדים כדי להתמודד עם המשבר עמידות לאנטיביוטיקה ולחנך את מספרי אינספור של חוקרים הסטודנטים לתואר ראשון חדשים מצטרפים המאמצים מיקור המונים של היוזמה עולם קטן.
מהטכניקות שתוארו כאן ניתן בקלות להתאים לשימוש בכיתה במכללה ובתיכון בנוסף מעבדות מחקר, באמצעות השינויים המתוארים וידאו, טקסט. סטודנטים במודול מיקרוסקופ השנה הראשונה במכללה קטנה שבע האמנויות החופשיות הצליחו צובעות זנים, לקחת תמונות דיגיטליות של זנים גדל על אגר מדיה, ולבצע מיקרוסקופ שלב-ניגודיות, זריחה, אשר הגיע לשיאו הגשת תיק של דמויות רב ספון בקצה של המודול 3 בשבוע, המייצג h 15 של עבודה בבית-lab. כ 160 לתלמידי השנה הראשונה היו אחראים phenotyping הראשונית של מוטציות transposon הרומן 320. תלמידי מחקר לתואר ראשון במוסדות שלושה השתתפו את phenotyping הראשוני של מוטציות נוספות ואפיון עוקבות של הזנים רבים. הנתונים מקיף שהושג תוך תקופה קצרה יחסית של זמן, ממחישים את הערך של הפרוטוקולים המתוארים כאן. מאות מוטציות נוספות אוחסנו גליצרול מניות mycelial של אפיון בעתיד.
בעקבות הניסויים הראשוניים המתוארים כאן, מגוון שיטות עשוי להיות מועסק כדי להאריך את האיכות של מידע המתייחס זנים מעניינים. אם המוטציה אינם ידועים, שיטה genotyping צריך להיות מועסק כדי לקבוע את סוג ו/או מיקום המוטציה. לדוגמה, transposon אקראיים מוטגנזה מכוונת פראי-סוג כרומוזום6,7,8,9,10,11,12,13 תוצאות במושבות צריך עוברים הראשונית פנוטיפי במסכים כגון מהמתואר לעיל. אז המיקום של transposon צריכה להיות מזוהה באמצעות טכניקה כגון פולימראז הופכי תגובת שרשרת (iPCR)61. קביעת של גנוטיפ של מוטציות שהתגלתה היא צעד חשוב בעקבות משלב האפיון הראשוני.
כמה שיטות מתקדמות נפוץ לניתוח phenotyping הבאים עשויים להיות הזכיר בכיתה או חקר באמצעות מחקרי המשך כוללים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תיוג כדי לקבוע תבניות לוקליזציה עבור החלבון של עניין, ג'ין ביטוי ניתוחים כגון נדל בפעם ה-PCR כמותי (qPCR) ודפוסי ביטוי גנים הכללית של פראי-סוג לעומת מוטציה באמצעות ה-RNA רצף (RNA-seq). Phenotyping מיומנויות נדרשות גם לניתוח קומפלמנטציה גנטי. בניסוי קומפלמנטציה, העותק פראי-סוג של גנים מוחדרים זן שעבר שינוי כדי לקבוע אם אלל שנוספו לאחרונה יכול לפצות על האובדן-של-הפונקציה של אלל מוטציה. השוואת של פנוטיפ של המתח המלווים לזה של המוטציה המקורי והן את ההורים, פראי-סוג מאמץ נדרש.

Streptomycetes הם חיידקים גראם חיוביים, filamentous קרקע ידועה וביכולתם לייצר מגוון של מטבוליטים משניים, כולל שני שלישים של אנטיביוטיקה זמין מסחרית, כמו גם כמה אנטי הגידול, תרופות נגד איידס, ואני נגד טפילים 1. ס coelicolor הוא החבר מאופיין ביותר גנטית של סוג2,3 , והוא המין בשימוש בשיטות המתוארות כאן. ס coelicolor יש מחזור חיים מורכב מתחיל עם הנביטה של נבג יחיד, ומתחזקים נרחב, מסעף תפטיר צמח שגדל לתוך המדיום אגר. כל מחזור החיים של התמורה, חוטים אווירי נוצרות לשבור את מתח הפנים של תפטיר המצע, סוף סוף מחולקים שרשראות ארוכות של תאים מומרים בסופו של דבר נבגים בוגרת, גריי-פיגמנט. פיזור של נבגים שהוקם אלה מהווה את תחילת מחזור החיים הבא4.
בגלל שלה דפוס מורכבות של בידול, ס coelicolor משמש מודל מצוין עבור חקר התפתחות חיידקים. מבחינה היסטורית, מוטציות כתוצאה בבלוקים עבור שני שלבים עיקריים של פיתוח ומפיקים פנוטיפים חזותיים ברורים. המוטציות (קירח) בנין נחסמות על היווצרות תפטיר אווירי ולהוביל חוסר תפטיר אוויר מעורפל להקניית מראה המושבה "קירח". מוטציות עכבות במבנה נבג, ההבשלה מכונים מוטציות הל (לבן) כי הם בדרך כלל נכשלים לייצר רמות פראי-סוג של הפיגמנט נבג אפור תפטיר אוויר נשאר לבן. מוטאנטים מעניינים אחרים הם והשרירי לאנטיביוטיקה ייצור, חלוקת התא, סגרגציה כרומוזום או תהליכים חשובים אחרים,4,5.
למרות גילוי גנים התפתחותיים רבים במינים Streptomyces , ישנם רבים יותר האמינו להתקיים בהתבסס על חוסר הרוויה של מסכי מוטציה. מעבדות שלנו להמשיך לזהות גנים התפתחותיים חדשים באמצעות מערכת transposon מיני ואנחנו יש נבנה. הרומן זנים מוטציה מבודד בניסויים מוטגנזה מכוונת אקראי עם transposon שלנו עוברים סינון פנוטיפי כדי לזהות את תפקיד אפשרי של כל חדש ג'ין גילה6,7. שיטות phenotyping חיידקי המתוארים כאן הרלוונטיים מוטציות Streptomyces מבודדים-transposon מוטגנזה מכוונת8,9,10,11,12, 13 ו אקראית בשיטות אחרות, כגון כימי, אולטרה סגול (UV) מוטגנזה מכוונת14, כמו גם בנייה בבימויו של מוטציות כגון מחיקות הגן באמצעות15,recombineering16 או CRISPR-Cas9 (מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר) הגנום עריכה טכנולוגיה17,18,19 ו מוטציות נקודה20.
עמידות לאנטיביוטיקה בקרב פתוגנים הופך נפוץ יותר ויותר, הצורך אנטיביוטיקה חדשה הופך יותר ויותר דחוף21,22. "היוזמה עולם קטן" (או מושכל) הוא יעיל המדע, טכנולוגיה, הנדסה, מתמטיקה (גזע) למידה23 ומחקר אסטרטגיה24 כדי להילחם עמידות לאנטיביוטיקה דרך מיקור המונים של סטודנטים, ועוד לאחרונה תלמידי תיכון. תמיכה קורסים עבודתו כוללת זיהוי חיידקים אדמה חדשה לייצר אנטיביוטיקה הרומן (http://www.smallworldinitiative.org). הוא האמין כי המקור העיקרי של אנטיביוטיקה שעדיין לא התגלו ימשיכו להיות Streptomyces מינים נמצאו במגוון רחב של אדמה ומים בתי גידול25,26,27,28, 29,31. לאחרונה, המעבדה שלנו עבודתם של אחרים גילו והם יהיו מאופיין איתות גנים במינים Streptomyces המסדירים מורפולוגיה ופיתוח, לרבות ייצור לאנטיביוטיקה7,32. 33. שינויים בביטוי הגנים האלה לגרום שינוי הכמות ואת העיתוי של אנטיביוטיקה המיוצר. Phenotyping מיומן של מינים חדשים, המוטנטים מייצרי אנטיביוטיקה החדשים ימשיכו להיות חשוב. כמו מדריכים חדשים ותלמידים שלהם להיות התורמים העיקריים בתחום של גילוי תרופות, הכשרה phenotyping חיידקי הוא הכרחי עבור ההצלחה של אנשים אלה המתחיל. יתר על כן, הניסויים האלה הם צייתן בתיכון גזע או אוניברסיטת מיקרוביולוגיה החינוך מעבדות. הם מייצגים הפגנה של עקרונות יסוד גנטי מיקרוביאלי מעבדת הוראה הגדרת.

<table><tbody><tr><td>50% Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil (Type DF)</td><td>Cragille&amp;nbsp;</td><td>16482</td><td></td></tr><tr><td>Lens Paper</td><td>Fisherbrand</td><td>11-995</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Water</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-1L</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Toothpicks (flat)</td><td>Target</td><td>081-22-1957</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (10 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-10</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (200 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-200Y</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (1,250 mL)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-1250</td><td></td></tr><tr><td>Wooden Applicators 6&#039;&#039;</td><td>Solon Care</td><td>070809</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swabs</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>Soy Flour&amp;nbsp;</td><td>Bob&#039;s Red Mill&amp;nbsp;</td><td>1516C164</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol 100%</td><td>VWR amresco life science&amp;nbsp;</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>0.8% NaCl (Saline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9000V</td><td></td></tr><tr><td>1.2 mL freezer tube</td><td>NEST</td><td>606101</td><td></td></tr><tr><td>Ultra low (-80 &amp;deg;C) freezer</td><td>SO-LOW</td><td>U85-18</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Safety Gloves</td><td>Bel-Art</td><td>H13201</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Cover slips #1.5</td><td>Thomas Scientific</td><td>64-0721</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>Carolina</td><td>63-2010</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Tuttnauer</td><td>2540E</td><td></td></tr><tr><td>Phase-Contrast Microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td>BX40</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Carolina Biological</td><td>624504</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>Carolina Biological</td><td>706706</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffer saline)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>Biotium</td><td>29022-1</td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td>OPI</td><td>22001009000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Free Software</td><td></td></tr><tr><td>100 mL beaker</td><td>Pyrex USA</td><td>1000-T</td><td></td></tr><tr><td>1 L beaker</td><td>Carolina Biological</td><td>721253</td><td></td></tr><tr><td>1 L flask</td><td>Fisherbrand</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>250 mL flask</td><td>Pyrex USA</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>100 mL graduated cylinder</td><td>Carolina Biological</td><td>721788</td><td></td></tr><tr><td>500 mL graduated cylinder&amp;nbsp;</td><td>Carolina Biological</td><td>721792</td><td></td></tr><tr><td>Stir Bar</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-271825</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Camera for Microscope</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>Nitrile Examination Gloves (Med)</td><td>Bio Excell</td><td>71011002</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Carolina Biological</td><td>701077</td><td></td></tr></tbody></table>

visual and microscopic evaluation of streptomyces developmental mutants

Streptomycetes הם חיידקים אדמה filamentous השייכת שלקרוא Actinobacteria פזורים ברחבי העולם, לייצר מגוון רחב של אנטיביוטיקה, מטבוליטים משניים אחרים. Streptomyces coelicolor הוא מין מאופיין היטב, פתוגניים שאינם זה לבצע מגוון רחב של ניתוחים במעבדה. Phenotyping בשיטות המתוארות כאן להשתמש ס coelicolor כמו streptomycete דגם; עם זאת, השיטות ישימות כל בני הסוג גדולים, כמו גם כמה actinomycetes הקשורים קשר הדוק. Phenotyping יש צורך לאפיין מינים חדשים של Streptomyces זיהה בסביבה, זה גם צעד ראשון חיוני באפיון לאחרונה מבודד מוטציה זנים של Streptomyces. מיומנות ב phenotyping חשוב עבור החוקרים חדשים רבים אשר נכנסים לשדה המחקר Streptomyces , כולל המחקר של התפתחות חיידקים, חלוקת התא, כרומוזום סגרגציה השליח השני איתות. מיקור המונים האחרונות של גילוי לאנטיביוטיקה תוך בידודו של חיידקים אדמה חדשה הביאה צורך בהכשרה phenotyping למדריכים החדשים בשטח המחקר Streptomyces , מכללה או תיכון שלהם מוגבר סטודנטים. כתב יד זה מתאר שיטות הפצת זן חיידקי, אחסון של אפיון באמצעות בדיקה חזותית, מיקרוסקופיים. לאחר קריאת מאמר זה, חוקרים חדשים (מעבדות מיקרוביולוגיה החינוך ומדענים אזרח) אמור להיות מסוגל לתמרן זנים Streptomyces ולהתחיל אפיון ויזואלי ניסויים.

Phenotyping הראשונית ניסויים נחוצים עבור אפיון מינים חדשים, זנים, יכול לשמש בגישה חינם פילוגנטיקה, DNA-DNA הכלאה ניסויים המשמשות לטיפול באפיון של זנים חדשים. Streptomyces מוטציות הנובעות מוטגנזה מכוונת אקראית בשיטות כגון כימיקלים, UV, או transposon מוטגנזה מכוונת מזוהים בדרך כלל דרך מסכי ישירה, חזותי על פלטות אגר. מושבות של Streptomyces נבדקים לשינויים בפנוטיפ לעומת המתח פראי-סוג, הורים. לדוגמה, תפטיר אווירי בצבע בהיר מצביעים על רמה נמוכה יותר של פיגמנט האפור הנגרם על ידי פגם הנבגה, או חוסר מראה מטושטש מעידה על חסימה במבנה תפטיר אווירי (איור 1). Streptomycetes רבים לייצר אנטיביוטיקה פיגמנט תפטיר וגטטיבי או אגר שמסביב. ס coelicolor מייצרת שני סוגי אנטיביוטיקה פיגמנט, כמו גם שני אלה ללא פיגמנט. Actinorhodin הוא אנטיביוטיקה-פיגמנט כחול והוא undecylprodigiosin45-פיגמנט אדום לאנטיביוטיקה. זנים שעברו ראשוני המושבה החזותית מסכי מופצים ואז על ידי ומבטא עבור מושבות יחיד.
בעקבות זיהוי חזותי של פוטנציאל מעניין מוטציות, זנים הם נתון בבדיקה מיקרוסקופית. שלב-ניגודיות מיקרוסקופ מתאימה במיוחד לבחינת Streptomyces מוטציות פגמים התפתחותית, באמצעות הלחץ פראי-סוג כפקד (איור 2). מושבות ס coelicolor פראי סוג בדרך כלל לייצר של תפטיר מהאוויר על ידי כיומיים של צמיחה ב 30 מעלות צלזיוס על אגר MS, שרשראות ארוכות של נבגים על ידי שלושה ימים של צמיחה. מחזור חיי יתפתחו מעט איטי או מהיר יותר על סוגי מדיה אחרים. זה הכרחי כי המוטציות לנתח בתנאים צמיחה אותו כסוג פראי בעת הסקת מסקנות על ליקויים התפתחותיים, עיכובים. מוטציות קירח עשויה לייצר נבגי לאחר צמיחה ממושכת במדיה אגר. מחלקה של מוטציות המכונה מוטציות לבן עשוי להתעכב גם על היווצרות נבג, להראות ירידה השפע של נבגים המיוצר, נבגים תוצרת עם פגמים צורה ו/או גודל, או פשוט לייצר רמות נמוכות יותר של פיגמנט ספורה בוגרת, אפור46 . מוטאנטים אחרים נחקרו עד כה מתעכבת או מואצת בהתקדמות מחזור החיים כגון המוטציות יושפע עבור ההצטברות של מולקולות (למשל, מחזורית-di-GMP47) איתות.
המשך פשוט הטכניקה מיקרוסקופ אור שתוארו לעיל היא מיקרוסקופ פלורסצנטיות באמצעות propidium יודיד הכתם בהכפלת ה-DNA nucleoids, agglutinin fluorescently שכותרתו נבט חיטה כתם בדופן התא הנבגה septa. נבגים חסר כרומוזום יהיה חסר יודיד propidium אדום מכתים, בעוד נבגים המכילים את הדנ א פחות מכפי הרגיל ניתן לזהות אם הם מופיעים כדי ירדו מכתים (איור 3). נבט חיטה agglutinin עשוי לשמש כדי להכתים את דופן התא, ייבחנו הבדלים דופן התא מכתים דפוסים (כלומר, חלוקת התא פגמים). בזן איור 4 הפראי-סוג של ס' venezuelae, זן לאחרונה משמשת כמודל עוד streptomycete בשל מחזור החיים מהיר יותר היכולת sporulate ב נוזלי45, יש נוטף WGA-FITC להבהיר המערך דמוי סולם של החטיבה septa שהם ראו בדרך כלל מוקדם במהלך הנבגה.
האסטרטגיות phenotyping הראשונית המתוארים כאן יביא הפעולות הבאות: 1) זיהוי זנים mutant הריבית ללימוד נוסף; 2) רכשה את הידע החשבונאי שזוהה ועל התפקיד הפוטנציאלי של גן זה יש כבר מוטציה; 3) ניסוח של סדרת השלבים הבאים ניסיוני יכול לשמש כדי להבהיר עוד יותר את התפקיד של הגן המדובר עוקבות. במקרה של streptomycete שזוהה מן הסביבה, החוקר יקבל ידע של מינים חדשים פוטנציאליים בהשוואה כבר מאופיין מינים של Streptomyces.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig1.jpg"> איור 1: תצלום של צלחת אגר נציג הוכחת המושבה מאקרוסקופית פנוטיפים של S. coelicolor. צלחת אגר מראה מעורפל, אפור המראה החזותי של תפטיר אווירי עבור פראי-סוג coelicolor ס זן MT1110 (WT) בהשוואה transposon אקראיים שונים ההכנסה מוטציות עם פנוטיפים התפתחותית. מוטציות חסרים גם של תפטיר אווירי [קירח (בנין)] או של תפטיר אווירי עם פיגמנטציה נבג מופחתת [לבן (א)]. מוטציות transposon נוצרו באמצעות מיני-Tn5 עבור הכניסה מוטגנזה מכוונת6,7. הזנים היו מבוגרים על MS אגר במשך 5 ימים ב- 30 ° C. צלחת פטרי קוטר 100 מ מ.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig2.jpg"> איור 2: שלב-ניגודיות micrographs מציג נציג אווירי בשביל המוטציה S. coelicolor לבן זנים המכילים transposon אקראיים ההכנסה מוטציות. (א) מוצג הוא פילמנט אווירי נציג פראי סוג עבר חלוקות תאים סינכרונית, המרווחות באופן קבוע, ייצור אחיד בצורת, בגודל נבגים (MT1110). (B–F) הלוחות הנותרים מראים על הפנוטיפים מיקרוסקופיים שונה לחלוטין של מוטציות לבן שונים שהיו מבודדים באמצעות מוטגנזה מכוונת transposon אקראיים. פאנל B מראה של פילמנט אווירי לא עבר הנבגה, אך במקום זאת הפיק בולטות שטחים בתוך חוט הלהט. חיצים ארוכים ב- C, Dו- F מציינים נבגים גדולה באופן חריג האופייניים של מוטציות MIC42, MIC43 ו- TH49. החץ קצר בחלונית D מציין דוגמה תא נבג lysed. פאנל E מראה התאים קטנים יותר בחלקו מכווץ האופייניים של הרשתות נבג המיוצר על ידי מוטציה TH10. הזנים היו מבוגרים על MS אגר במשך 5 ימים ב- 30 ° C. המוטציות אינן קשורות לאלו המוצגות באיור1. נבג פראי סוג הוא כ 1.1 מיקרומטר על ציר זמן. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2.jpg"> איור 3: נציג micrographs מראה coelicolor ס מוטציה כרומוזום פנוטיפים סגרגציה. (א) A תרשים ייצוג מראה פראי-סוג, המרווחות באופן קבוע צביעת במראה הטיפוסי של שרשרת של נבגים (כל נבג מכיל DNA כרומוזומלית) לעומת התבנית מכתימים לסירוגין עבור מוטנט המציג כרומוזום סגרגציה פגם. (B) לכל זוג פאנלים מראה הנבג באותה שרשרת שנצפה על ידי ניגודיות התערבות דיפרנציאלית (DIC) התמונה משמאל תמונת פלורסצנטיות שהוכתמו יודיד propidium מוצגת בצד הימין. פנוטיפ פראי-סוג (a, b) לעומת שתי מוטציות ההכנסה transposon אקראיים (c, d ו- e, f). חיצים מציינים נבגים ללא ה-DNA. הזנים היו מבוגרים על MS אגר במשך 5 ימים ב- 30 ° C. המוטציות המוצגות אינן קשורות לאלו איור 1 ו- 2 איור. סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3.jpg"> איור 4: זריחה micrograph של זן פראי-סוג venezuelae ס מוכתם WGA-FITC. (א) A תרשים של פילמנט אווירי מופיעה חלקה עם אין כניסות ויש סימנים נראים לעין הנבגה באמצעות מיקרוסקופ שלב-ניגודיות בהשוואה המערך דמוי סולם של צביעת קיר התא, זה מצביע על שלב מוקדם הנבגה החלה את הלהט אותו באמצעות WGA-FITC תחת מיקרוסקופ זריחה. Micrographs (B) של פראי-סוג venezuelae ס. חוטים אווירי חלקה () נמצאים בין שרשראות של נבגים. (b) במרחק תפטיר שמוצג בחלונית, אחד נימה אווירי בשלב מוקדם בהתפתחות הנו מערך דמוי סולם של דופן התא התצהיר. חיצים מציינים היווצרות המרווחות באופן קבוע של צלב-קירות מוכתמת WGA-FITC המתפתחים באופן סינכרוני בתוך פילמנט אווירי יחיד כמו זה עובר הנבגה הקשורים נכה. המתח היה גדל על MYM MYM (altoseמ', תמצית מזרח Y, תמצית alt מ') אגר במשך 38 h ב- 30 ° C. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants at JoVE.com

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

הערכות חזותי מיקרוסקופיים של מוטציות התפתחותית Streptomyces

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור המתחיל החוקרים ליזום phenotyping עבור סוג חיידקים חשובים פרמקולוגית של Streptomyces.

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

visual-microscopic-evaluation-streptomyces-developmental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

17.8K Views.  Otterbein University. כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור המתחיל החוקרים ליזום phenotyping עבור סוג חיידקים חשובים פרמקולוגית של Streptomyces.

Video: Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the replacement of the entire gene with a selectable marker via homologous recombination. During homologous recombination, exchange of DNA takes place between sequences with high similarity. Therefore, linear genomic sequences flanking a target gene can be used to specifically direct a selectable marker to the desired integration site. Blunt ends of the deletion construct activate the cell&#39;s DNA repair systems and thereby promote integration of the construct either via homologous recombination or by non-homologous-end-joining. In organisms with efficient homologous recombination, the rate of successful gene deletion can reach more than 50% making this strategy a valuable gene disruption system. The smut fungus Ustilago maydis is a eukaryotic model microorganism showing such efficient homologous recombination. Out of its about 6,900 genes, many have been functionally characterized with the help of deletion mutants, and repeated failure of gene replacement attempts points at essential function of the gene. Subsequent characterization of the gene function by tagging with fluorescent markers or mutations of predicted domains also relies on DNA exchange via homologous recombination. Here, we present the U. maydis strain generation strategy in detail using the simplest example, the gene deletion.

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

We describe a robust gene replacement strategy to genetically manipulate the smut fungus Ustilago maydis. This protocol explains how to generate deletion mutants to investigate infection phenotypes. It can be extended to modify genes in any desired way, e.g., by adding a sequence encoding a fluorescent protein tag.

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Genetics

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the abundances of key metabolites to which regulatory factors respond, adjusting cellular metabolism. In recent years, a number of proteins and RNA have emerged as important regulators of virulence gene expression. For example, the CodY protein responds to levels of branched-chain amino acids and GTP and is widely conserved in low G+C Gram-positive bacteria. As a global regulator in Staphylococcus aureus, CodY controls the expression of dozens of virulence and metabolic genes. We hypothesize that S. aureus uses CodY, in part, to alter its metabolic state in an effort to adapt to nutrient-limiting conditions potentially encountered in the host environment. This manuscript describes a method for extracting and analyzing metabolites from S. aureus using liquid chromatography coupled with mass spectrometry, a protocol that was developed to test this hypothesis. The method also highlights best practices that will ensure rigor and reproducibility, such as maintaining biological steady state and constant aeration without the use of continuous chemostat cultures. Relative to the USA200 methicillin-susceptible S. aureus isolate UAMS-1 parental strain, the isogenic codY mutant exhibited significant increases in amino acids derived from aspartate (e.g., threonine and isoleucine) and decreases in their precursors (e.g., aspartate and O-acetylhomoserine). These findings correlate well with transcriptional data obtained with RNA-seq analysis: genes in these pathways were up-regulated between 10- and 800-fold in the codY null mutant. Coupling global analyses of the transcriptome and the metabolome can reveal how bacteria alter their metabolism when faced with environmental or nutritional stress, providing potential insight into the physiological changes associated with nutrient depletion experienced during infection. Such discoveries may pave the way for the development of novel anti-infectives and therapeutics.

Here we describe a protocol for the extraction of metabolites from Staphylococcus aureus and their subsequent analysis via liquid chromatography and mass spectrometry.

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Biochemistry

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Biology

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

לימוד לחץ חימצוני נגרם על-ידי Streptococci קבוצה מיטיס ב Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Developmental Biology

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties. 
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.

זמן לשגות הדמיה הקרינה של השלם<em&gt; S. venezuelae</em&gt; מחזור החיים באמצעות מכשיר microfluidic

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

מחיקות Gene הגנום ב<em&gt; סטרפטוקוקוס sanguinis</em&gt; על ידי תפוקה הגבוהה PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. The non-replicative elementary body (EB) initiates infection of the host. Once inside, the EB differentiates into the reticulate body (RB). The RB then undergoes multiple rounds of replication, before differentiating back to the infectious EB form. This cycle is essential for chlamydial survival as failure to switch between cell types prevents either host invasion or replication.
Limitations in genetic techniques due to the obligate intracellular nature of Chlamydia have hampered identification of the molecular mechanisms involved in the cell-type development. We designed a novel dual promoter-reporter plasmid system that, in conjunction with live-cell microscopy, allows for the visualization of cell type switching in real time. To identify genes involved in the regulation of cell-type development, the live-cell promoter-reporter system was leveraged for the development of a forward genetic approach by combining chemical mutagenesis of the dual reporter strain, imaging and tracking of Chlamydia with altered developmental kinetics, followed by clonal isolation of mutants. This forward genetic workflow is a flexible tool that can be modified for directed interrogation into a wide range of genetic pathways.

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

This protocol utilizes fluorescent promoter-reporters, live-cell microscopy, and individual inclusion extraction in a directed forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants of Chlamydia trachomatis.

גישה גנטית חיה-תא קדימה לזהות ולבודד מוטנטים התפתחותיים ב trachomatis כלמידיה

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic changes are regulated by a complex signaling network controlled in response to environmental stimuli. These regulatory components have been highly studied, but almost all studies use a variety of in vitro stimuli to trigger filamentation. To determine how morphogenesis is regulated during the pathogenesis process, we developed an in vivo microscopy system to obtain high spatial resolution images of organisms undergoing hyphal formation within the mammalian host. The protocol presented here describes the use of this system to screen small collections of C. albicans mutant strains, allowing us to identify key regulators of morphogenesis as it occurs at the site of infection. Representative results are presented, demonstrating that some regulators of morphogenesis, such as the transcriptional regulator Efg1, have consistent phenotypes in vitro and in vivo, whereas other regulators, such as adenyl cyclase (Cyr1), have significantly different phenotypes in vivo compared to in vitro.

Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host

This manuscript describes a method for screening moderately sized Candida albicans mutant libraries for morphogenesis phenotypes during active infection in a mammalian host using non-invasive confocal microscopy.

שימוש בהדמיית in vivo לבדיקת פנוטיפים של מורפוגנזה בזנים מוטנטיים של קנדידה אלביקנס במהלך זיהום פעיל בפונדקאי של יונקים

Candida albicans is an important human pathogen. Its ability to switch between morphologic forms is central to&#160;its pathogenesis; these morphologic ...

הערכות חזותי מיקרוסקופיים של מוטציות התפתחותית Streptomyces

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט