저자는 Otterbein 대학 학부 학생 연구 장학금 및 학생 연구 기금 상 SGK; GVK을 인정 하 고 싶습니다. Otterbein 교수 길버트 E. 밀스 기념 식 프로그램 상을 부여 하 고 학과의 생물학 및 지구 과학 교수 연구와 장학금 부여 잽을 수상. 버트와 제인 경적 부여 학생 연구 기금 과학에서 SGK GVK를 수 여 되었다. 저자 또한 기꺼이 인정 뒤 케 인 대학 GVK 및 SGK 학부 연구 장학 프로그램을 투자 하 고 싶습니다. 전 Juniata 대학 학부 연구 생, 라이언 존슨과 린지 드레이퍼 공헌 했다 현미경 이미지 그림 2 및 3, 각각.

1. 악기, 문화 미디어, 솔루션, 그리고 접시를 준비
<ol><li>50 mL 비 커에 압력솥 이쑤시개 무 균 유지를 알루미늄 호 일로 덮여.</li>
	<li>될 모든 드라이 물품 소독 압력솥에 (팁, 막대기, 유리, 등)을 사용. 참고: 주의! 사용 되는 압력솥 모델에 대 한 모든 안전 지침을 따릅니다. 오토 클레이 브는 폭발, 및 증기와 뜨거운 표면, 재료, 및 미디어와 접촉에서 화상에 대 한 위험을 내포. 오토 클레이 브 안전에 대 한 "적절 한 사용의 오토 클레이 브"34볼.</li>
	<li>
Agar (마 니 톨 콩 가루 (SFM))14 문화를 성장 하는 MS를 준비 합니다.
	<ol>
<li>1 L 플라스 크에 콩 가루와 한 천 5 g 5 g을 추가 합니다.</li>
		<li>수돗물의 250 ml에서 마 니 톨의 5 g을 녹이 고 콩 가루와 한을 포함 하는 플라스 크에 분배.</li>
		<li>121 ° C, 적어도 30 분 동안 15 psi에서 거품 플러그와 플라스 크 및 고압의 오프닝에 호 일을 추가 합니다. 주의:이 매체를 통해 쉽게 종 기. 4 배 이상 압력가 마로 소독 되 고 MS agar의 실제 볼륨을 저장할 수 있는 플라스 크를 사용 합니다. 표준 압력 밥 솥 압력솥 유사한 안전 고려 대신 사용할 수 있습니다. 또는, 렌지 압력솥에 대 한 액세스 가능한35,36하지 않으면 미디어와 자료를 소독 하 사용할 수 있습니다. 고등학교 교사 또한 현지 대학 또는 대학에 압력가 공급에 액세스와 함께 공동 작업을 할 수 있습니다.</li>
		<li>멋진 미디어까지 충분히 편안 하 게 처리 합니다. 안 천이 온도 50 ° c에서 고형화 하기 때문에 너무 오랫동안 멋진 조심</li>
		<li>각 페 트리 접시의 하단은 약 절반까지 멸 균 페 트리 디쉬에 플라스 크에서 MS agar를 부 어 전체 (페 트리 접시 당 미디어의 약 25 mL). 한 천 배지를 사용 하기 전에 응고를 허용 합니다. 필요할 때까지 실 온에서 비닐 봉지에 한 천 배지를 저장 합니다. 참고: 한 천 배지도 저장할 수 있습니다는 냉장고에 항생제는 미디어에서 필요로 하는 경우에 특히.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 행진 Streptomyces 전파에 대 한 접시에
<ol><li>MS 한 천 배지는 사분면 같은 표준 메서드를 사용 하 여 단일 식민지에 행진 Streptomyces 긴장 샌 더 스, 201237에서 같이 메서드를 행진. 참고: inoculating 루프 또는 살 균 이쑤시개 사용할 수 있습니다. 선택 사항: 다른 미디어 일반적으로 사용 됩니다 Streptomyces 종, R2YE 및 최소한의 미디어14.</li>
	<li>30 ° c.에 번호판을 품 어</li>
	<li>4-6 일 마다 하나의 식민지를 선택 하 여 플레이트를 restreak. 식민지 시대에 그들은 무작위 돌연변이 하는 경향이 된다로.</li>
</ol>3. 세균 저장용 글리세롤 바로 주식 만들기
참고: 바로 주식 위 를 포함 하 여 모든 Streptomyces 긴장 및 빌딩 긴장, 및 다른 발달 돌연변이 포자 형성을 완료할 수 없습니다에 대 한 만들 수 있습니다.
<ol><li>메 마른 나무 못 주걱을 사용 하 여 20% 글리세롤의 200-500 µ L에서 15-20 식민지 macerate</li>
	<li>Micropipette 또는 살 균 전송 피 펫을 사용 하 여 1.5 mL 냉장고 문화 관에 물 식민지의 슬러리를 전송 합니다. 참고: micropipette 사용의 기초는 다른 덮여 있다38.</li>
	<li>최종 볼륨을 충분히 20% 글리세롤을 추가 1 mL 부드럽게 섞는다. -80 ° c.에 샘플 저장 참고: 주의! 사용 극저온 안전 장갑 그리고 극단적인 추위와 접촉에서 피부를 보호 하기 위해 연구실 코트. 또는-20 ° C 냉동 고 장기 저장 시간에 잠재적인 감소와 함께 사용할 수 있습니다. 과도 한 중지 및 재개 생존을 연장 하지 마십시오.</li>
</ol>4. 온 종자에 대 한 글리세롤 포자 주식 만들기 수 포자 형성
참고: 포자 주식 장기 생존 능력에 대 한 바람직 하지만 포자 형성을 완료 수 있는 변종에 대 한 가능한.
<ol><li>
소재의 물 (3.1 단계)의 성장37confluent 잔디를 한 천 배지에서 100 µ L를 확산. 참고: 확산 도금 샌 더 스37 에 표시 됩니다 (수정: 턴테이블 필요 하지 않습니다.). 접시 설정할 수 있습니다 한 손으로 다른 손을 스프레더 부드러운 앞뒤로 이동 사용 하는 동안 모션 한 미디어를 통해.<ol>
<li>피펫으로 100 µ L의 분해 균 사체는 MS 한 천 격판덮개의 센터에.</li>
		<li>소독 한 유리 또는 금속 도구 부분적으로 70% 에탄올에 잠수 하는 에탄올의 증발 속도 분 젠 버너 불꽃을 통해 천천히 한번 분산기를 전달 하 여 확산. 주의: 에탄올은 가연성 이다. 에탄올으로 불타는 분산기를 배치 하거나 에탄올 에탄올 접시에의 불타는 드롭 수 마십시오. 또는, 일회용 멸 균 면봉을 사용 하 여 에탄올 또는 불꽃 격판덮개에 박테리아를 확산.</li>
		<li>MS agar를 다시 사용 하는 동안 한 손으로 접시와 앞 접종 균 분산기와 플레이트를 모션 켜십시오.</li>
		<li>긴장은 잘 sporulated 때까지 30 ° C에서 5-7 일 동안 품 어. 참고: 보육 시간 종 및 변형에 따라 달라 집니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>멸 균 식 염 수의 2 개 mL를 추가 (0.8 %NaCl) 포자 형성 겪은 Streptomyces 셀 confluent 잔디밭의 센터에.</li>
	<li>부드럽게 문 지르고 잔디밭의 가장자리 쪽으로 살 균 접종 루프 (또는 목화 꽃 봉 오리), 천천히 움직이는와 균 사체의 표면으로 포자를 수확.</li>
	<li>피펫으로 염 분 포함 된 15 mL 원뿔 튜브로 포자. 개별 셀에 포자 체인을 적극적으로 소용돌이.</li>
	<li>약 2500 x g에 5 분 동안 상 온에서 원심.</li>
	<li>피펫으로 상쾌한 고 삭제입니다. 남은 액체의 작은 금액에서 격렬 한 소용돌이 동요 하 여 포자 펠 릿을 분산.</li>
	<li>아래로 피 펫과 솔루션을 그려서 20% 글리세롤의 1 mL에 포자를 resuspend.</li>
	<li>글리세롤 포자 주식 1.5 mL 냉장고 튜브에 전송. -80 ° c.에 게 주의: 사용 극저온 안전 장갑 그리고 극단적인 추위와 접촉에서 피부를 보호 하기 위해 연구실 코트. 또는-20 ° C 냉동 고 장기 저장 시간에 생존 능력의 잠재적인 감소와 함께 사용할 수 있습니다. 과도 한 중지 및 재개 생존을 연장 하지 마십시오.</li>
</ol>5. 수행 Mutagenesis
<ol><li>Mutagenesis 소개 에서 참조로 원하는 결과에 따라, 최근 Baltz, 201639의 검토를 수행 합니다. 참고: 일부 형질 실험 mutagenesis 환경에서 새로운 종족을 식별 하는 것 등을 요구 하지 않습니다. 임의의 mutagenesis의 방법은 transposon8,,910,11,,1213, 자외선, 또는 화학 물질14의 사용을 포함합니다. 사이트 감독 mutagenesis15,16,17,18,,1920 기술을 특정 점 돌연변이, 삭제를 만드는 데 사용할 수 또는 돌연변이의 다른 종류입니다.</li>
</ol>6. 비교 하 고 시각적 모양을 기록합니다
<ol><li>주의 식민지 형태학의 야생-타입 부모 스트레인에 비해 각 돌연변이 대 한 후 2 단계에서 모든 긴장을 질주 합니다. 잘 공부 종, coelicolor S. S. venezuelae 때 새로운 Streptomyces 종 특성화 등의 새로운 분리를 비교 합니다. 기본 모양, 식민지의 표면 특성 (그림 1)을 참고 (퍼지, 대머리, 주름, 등), 불투명도, 해발 고도, 및 착 색 (식물 사체, 공중 균 사체 및 주위 매체 구분).</li>
	<li>MS 한 접시와 행진 야생 형 및 돌연변이 체 긴장 쐐기 패턴 (그림 1)에 레이블을 지정 합니다. 아무 긴장 교차 오염을 피하기 위하여 다른 긴장을만 지 다는 것을 조심 하십시오. 날짜와 시간을 긴장 접시에 줄무늬는 note. 30 ° c.에 번호판을 품 어</li>
	<li>균질 배경 색 또는 흰 종이에 성장된 접시를 놓습니다. 질주 하는 첫 번째 접시에서 종이 스트레인 이름, 날짜, 부 화 온도 및 시간에 쓰기. 후자의 정보 혼란 최소화 되도록 종이 바탕에 작성 된 접시의 디지털 이미지를 가져가 라. 참고: 쓰기 수 수 자른 사진에서 나중에 그림 준비를 위해 사용 하는 경우.</li>
</ol>7. 수행 단계 대조 현미경 검사 법
<ol><li>70% 에탄올에 세척 하 고 다음 에탄올을 증발 하는 분 젠 버너 불꽃을 통과 하 여 족집게를 소독. 냉각 수 있습니다.</li>
	<li>70% 에탄올 세척 및 멸 균 페 트리 접시에 건조 있도록 다음 coverslips를 소독.</li>
	<li>
검사할 수 세균성 성장의 coverslip 리프트 준비.
	<ol>
<li>멸 균 핀셋으로 살 균 coverslip 들고 위는 coverslip MS 한 천 배지 세균성 성장 밀도 이다. 눌러 coverslip의 뒷면에 부드럽게 핀셋으로 세균성 포자와 공중 균의 충분 한 전송 되도록 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>접시에서 coverslip를 선택 하 고 그렇게 셀 소재 측면 장착을 위한 준비 물에 50% 글리세롤의 15 µ L 드롭 현미경 슬라이드의 표면 쪽으로 향하게 놓습니다. 슬라이드에 45 ° 각도로 coverslip를 배치 하 여 공기 방울을 감소 하 고 50% 글리세롤에가 보자.</li>
	<li>(선택 사항) 클리어와 인감 슬라이드의 보존에 대 한 폴란드어 네일.</li>
	<li>
단계 대조 현미경 검사 법 라이프 사이클 동안 다양 한 시간 간격 Frohlich40 에 의해 설명 된 대로 수행 합니다. 참고: 반복된 영상 더 완전 한 분석 및 개발에서 지연을 검색할 수 있습니다. 독립적으로 반복 하지 정확성과 재현성을 보장 하기 위해 관찰 합니다.<ol>
<li>준비 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 커버 슬립의 센터에 침수 오일 한 방울을 추가 합니다. 100 X 단계 목표 장소와 적절 한 "일치" 단계 설정 콘덴서 포 탑을 설정 회전. 대물 렌즈는 기름에 접촉 하는 면만 미세 조정 손잡이 사용 하 여 이미지의 초점을 맞춥니다.</li>
		<li>눈에 띄는 하 고 일관 된 차이 돌연변이 체 긴장 및 야생 형식 양식 포자, 포자 크기 및 모양, 및 포자 ( 그림 2참조)의 전체 수를 분별 하는 보기의 여러 필드를 검사 합니다. 참고: 단계 대조 현미경 검사 법에 대안 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 현미경40 를 포함 하 고 간단한 얼룩 기법에 대 한 밝은 분야 현미경41, 크리스탈 바이올렛 얼룩 등으로 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 수행 형광 현미경 검사 법
<ol><li>70% 에탄올에 세척 후 분 젠 버너 불꽃을 통해 실행 하 여 족집게를 소독.</li>
	<li>살 균 족집게와 장소는 MS 한 천 배지에서 세균성 성장을 분명 살 균 coverslip 데리 러. 세균성 포자와 공중 필 라 멘 트의 충분 한 전송에 되도록 핀셋으로는 coverslip의 뒷면을 부드럽게 터치 합니다.</li>
	<li>접시에서 coverslip를 선택 하 고 셀 소재 측 직면 하 고, 쉽게는 coverslip의 조작에 대 한 두꺼운 용지에 배치.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 메탄올 (20 x 20 m m2 coverslip 대 ~ 300 µ L)으로 coverslip 홍수 그리고 완전히 건조 공기. 주의: 메탄올은 돌연은. 피부와 직접 접촉을 하지 마십시오.</li>
	<li>워시는 coverslip 3 회 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)42 에 부드럽게 분배 하는 솔루션을 제거 하 여.</li>
	<li>100 μ g/ml Propidium 요오드 화물의 15 µ L를 추가 하거나 10 μ g/mL 밀-세균-Agglutinin fluorescein isothiocyanate (WGA-FITC) 레이블이 현미경 슬라이드에 50% 글리세롤에서 만든를 활용 합니다. 참고: DNA WGA FITC 얼룩 세포 벽 녹색 동안 염색체 DNA 위치를 감지 하는 빨간색 하 게 얼룩 Propidium 요오드 화물.</li>
	<li>반전에 유리 슬라이드에 형광 성 얼룩의 드롭 다운 coverslip 얼굴. (옵션) 슬라이드의 보존에 대 한 명확 매니큐어와 함께 인감.  염료는 빛에 민감한, 어두운 또는 어렴풋이 점등 방에 15 분 동안 품 어.</li>
	<li>단계 대조 또는 propidium 요오드 화물 (' 텍사스 레드 ' 필터 설정 또는 535/617 nm 여기/방출 맥시 마)와 FITC epifluorescence 여기 큐브 갖춘 DIC 현미경을 사용 하 여 100 X 객관적 렌즈 아래 슬라이드를 관찰 (FITC 필터 설정 또는 490/525 nm 여기/방출 맥시 마)입니다.</li>
	<li>무대와 조 악 하 고 정밀한 조정 손잡이 사용 하 여 초점에 슬라이드를 놓습니다.</li>
	<li>같이 다른43형광을 관찰 합니다.</li>
	<li>더 낮은 형광 강도44와 포자의 id에서 도울 수 있는 무료 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용 합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기 선물이 Streptomyces 연구원 종자를 전파 하 고 장기 저장을 위한 주식을 준비 하는 데 필요한 단계를 포함 하 여 연구를 시작 하려면 시작을 위한 프로토콜. 우리는 다음 Streptomyces 긴장의 영상 및 현미경 특성에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 형질 발달 돌연변이 몇 가지 전형적인 초기 단계: 1) 한 천 매체;에 야생 유형 식민지에 비해 돌연변이 식민지의 시각적인 검사 2) 단계 대조 현미경 검사 법; 그리고 3) sporogenic 공중 균의 형광 현미경 검사 법. 이 세 단계에 표시 된 표현 형을 바탕으로, 다양 한 기술 더 분별 특정 긴장의 표현 형을 채택 될지도 모른다.
초기 형질 실험 새로운 종족의 특성, 식별 하 관심의 돌연변이, 부분적으로 돌연변이, 특성화 고는 확인 된 돌연변이의 표현 형에 따라 특정 유전자의 일반적인 역할을 분별 하기 시작 일반적으로 사용 됩니다. 여기에 설명 된 방법은 식별 하 고 특성 Streptomyces 돌연변이, 세포 분열48,49, 에 그 결함을 포함 한 광범위 한 실험실을 교육 하는 대학에 이미 사용 되었습니다. 50 , 51 , 52 , 53 , 54, 포자 형성55,56, 공중 사체가 형성57,58, 항생제 생산59, 두번째 메신저 신호47및 염색체 분리 60. 이러한 일반적인 돌연변이의 표현 형을 결정 하는 중요 한 첫 번째 단계는 기술과 많은 양의 관심사의 유전자의 역할에 대 한 중요 한 정보를 공개. 방법은 Streptomyces 의 다른 종에 쉽게 확장 될 수 있습니다 그리고 이미 긴장의 S. griseus, S. venezuelae, S. 옴, 다른 많은 streptomycetes를 설명 하기 위해 사용 되었습니다. 여기서 설명 하는 비디오 프로토콜은 약물 발견의 지역에서와 같은 Streptomyces 연구의 분야를 입력 하는 새로운 연구를 위한 중요 한 자원으로 봉사 예상 된다. 항생제 저항 위기와 교육의 작은 세계 이니셔티브 crowdsourcing 노력에 합류 새로운 학부 학생 연구원의 무수 한 숫자에 대처 하기 위해 노력 하 고 새로운 교원 포함 됩니다.
여기에 설명 된 기술 연구 실험실, 비디오 및 텍스트에 설명 된 수정을 사용 하 여 뿐만 아니라 대학 및 고등학교 교실 사용을 쉽게 적용할 수 있습니다. 학생 들은 작은 교양 과목 대학에서 첫 해 현미경 모듈에 긴장을 행진, 한 천 매체에 성장 긴장의 디지털 사진을 수행의 제출에 최고봉 단계 대조 및 형광 현미경을 수 있었다는 실험실에서 작업의 15 h 대표 3 주 모듈의 끝에 멀티 패널된 그림의 포트폴리오. 약 160 첫 해 학생 320 소설 transposon 돌연변이의 초기 형질에 대 한 책임 했다. 3 교육 기관에서 학부 연구 생 추가 돌연변이의 초기 형질 및 긴장의 많은 것의 후속 특성화에 참가 했다. 상대적으로 짧은 기간에 얻은 포괄적인 데이터 여기에 설명 된 프로토콜의 값을 보여 줍니다. 수백 추가적인 돌연변이 미래 특성화에 대 한 글리세롤 바로 주식으로 저장 되어 있다.
여기서 설명 하는 초기 실험에 따라 방법의 다양 한 관심의 계통에 관한 정보의 품질을 확장 하 채택 될지도 모른다. 돌연변이 알 수 없는 경우 유전형 메서드 타입이 돌연변이의 위치를 결정 하기 위해 고용 해야 합니다. 예를 들어 임의의 transposon mutagenesis 야생-타입 염색체6,7,,89,10,11,12,13 초기 phenotypic 화면 그 설명 등 위의 받아야 한다 식민지에 있는 결과. 다음 위치는 transposon의 역 중 합 효소 연쇄 반응 (iPCR)61같은 기술을 사용 하 여 식별 되어야 합니다. 새로 발견된 된 돌연변이의 유전자 형 결정 초기 특성을 다음 중요 한 단계입니다.
교실에서 언급 되거나 추가 연구를 통해 탐험 수 있는 후속 형질 분석에 대 한 몇 가지 일반적으로 사용 되 고급 방법이 포함 녹색 형광 단백질 (GFP), 관심사의 단백질에 대 한 지역화 패턴을 확인 하려면 태그 진짜 같은 유전자 표정 분석 시간 정량 PCR (정량) 및 야생-타입의 글로벌 유전자 표현 패턴 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)를 통해 돌연변이 대. 형질 실력은 또한 유전 보완성 분석을 위해 필요 합니다. 보완성 실험에서 야생-타입 유전자 사본의 새로 추가 된 대립 유전자의 손실 돌연변이 대립 유전자의 기능에 대 한 보상 수 있습니다 여부를 결정 하는 돌연변이 스트레인에 소개 된다. 원래 돌연변이는 부모 모두의 보충된 긴장의 표현 형 비교, 야생-타입 스트레인이 필요 합니다.

Streptomycetes은 그람 양성, filamentous 토양 박테리아 항 HIV 및 안티 기생 약물 다양 한 상용 항생제 뿐만으로 안티 종양의 2/3 이상을 포함 하 여 2 차 대사 산물을 생산 하는 능력에 대 한 알려진 1. S. coelicolor 속2,3 의 가장 유전자 특징이 회원 이며 여기에 설명 된 방법을 사용 하는 종족 이다. S. coelicolor 는 한 천 매체에 성장 하는 광범위 한, 분기 식물 사체가 진행 단일 포자의 발 아로 시작 하는 복잡 한 수명 주기 있다. 라이프 사이클 진행, 공중 필 라 멘 트 기판 균 사체의 표면 장력을 깰 하 고 마침내 성숙, 회색 착 포자로 궁극적으로 변환 되는 셀의 긴 체인으로 나누어집니다 형성 된다. 이 새로 형성된 된 포자의 분산 다음 라이프 사이클4의 시작 부분을 구성합니다.
차별화의 복잡 한 패턴, 때문에 S. coelicolor 세균 개발의 연구에 대 한 우수한 모델 역할을 합니다. 역사적으로, 돌연변이 블록 개발의 두 가지 주요 단계에 대 한 고 독특한 시각적 고기를 생산. 빌딩 (대머리) 돌연변이 공중 사체가 형성 및 퍼지 공중 균 "대머리" 식민지 모양을 부여의 부족에서 결과 대 한 차단 됩니다. 돌연변이 포자 형성에 저해 하 고 성숙 이라고 합니다 whi (흰색) 돌연변이 때문에 그들은 일반적으로 야생-타입 수준의 회색 포자 안료의 생산에 실패 하 고 공중 균 남아 흰색. 다른 흥미로운 돌연변이 항생제 생산, 세포 분열, 염색체 분리, 또는 다른 중요 한 프로세스4,5에 저해 된다.
Streptomyces 종에 많은 발달 유전자의 발견에도 불구 하 고 많은 더으로 존재 돌연변이 스크린의 채도의 부족에 따라 있다. 우리의 실험실 우리가 건설 미니 transposon 시스템을 사용 하 여 새로운 발달 유전자 확인 계속. 소설 돌연변이 체 긴장 우리의 transposon 임의의 mutagenesis 실험에서 고립 된 각 새로운 유전자 발견6,7의 가능한 역할을 식별 하는 phenotypic 심사를 받 다. 여기서 설명 하는 세균성 형질에 대 한 메서드는 transposon mutagenesis8,,910,11,12,에 의해 절연 Streptomyces 돌연변이 관련이 13 및 recombineering15,16 를 사용 하 여 유전자 삭제 같은 돌연변이의 감독된 건설 뿐만 아니라 화학 및 자외선 (UV) mutagenesis14, 임의의 다른 방법 또는 CRISPR-Cas9 (클러스터 정기적으로 Interspaced 짧은 구조 반복) 게놈 기술17,,1819 와 점 돌연변이20편집.
항생제 내성 병원 균 중에서 점점 더 널리 되 고, 새로운 항생제에 대 한 필요성은 점점 긴급21,22. "" 작은 세계 이니셔티브 (SWI) 효과적인 과학, 기술, 공학 및 수학 (줄기) 학습 이다 대학생, 등의 crowdsourcing 통해 항생제 저항에 대처 하기 위해23 및 연구 전략24 최근 고 등 학생입니다. 작업 포함 소설 항생제 (http://www.smallworldinitiative.org)을 생성 하는 새로운 토양 미생물을 식별 하는 과정을 지원 합니다. 그것은 알려지지 않은 항생제의 주요 원천이 Streptomyces 종 토양의 넓은 범위에서 발견 하 고 물 서식 지25,26,,2728, 계속 믿고 29,31. 최근, 우리의 실험실과 다른 사람의 작품 발견 하 고 형태학 및 개발, 항생제 생산7,32, Streptomyces 종 신호 유전자 특징 33. 이 유전자의 표정에 변화 양과 항생제 생산의 타이밍에 있는 변화 귀 착될. 새로운 종 및 새로운 항생제 생산 돌연변이의 숙련 된 형질 중요 한 것을 계속할 것 이다. 새로운 강사와 학생 들이 될 신약 분야의 주요 참여자, 박테리아 형질에 훈련은 이러한 초보자 개인의 성공을 위해 필요 합니다. 또한,이 실험은 고등학교 줄기 또는 대학 미생물학 교육 실험실에 대 한 세공. 그들은 가르치는 실험실 설정에서 기본 미생물 유전 원리의 데모를 나타냅니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="543">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:197px;">50% Glycerol</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:121px;">G5516</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Immersion Oil (Type DF)</td>
			<td>Cragille&#160;</td>
			<td>16482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lens Paper</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>11-995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Water</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>G-3250-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium Iodide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Toothpicks (flat)</td>
			<td>Target</td>
			<td>081-22-1957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Tips (10 ml)</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1240-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Tips (200 ml)</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1240-200Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipette Tips (1250 ml)</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1240-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Wooden Applicators 6&#39;&#39;</td>
			<td>Solon Care</td>
			<td>070809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cotton Swabs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>23-400-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Soy Flour&#160;</td>
			<td>Bob&#39;s Red Mill&#160;</td>
			<td>1516C164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-Mannitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4125-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1296-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol 100%</td>
			<td>VWR amresco life science&#160;</td>
			<td>0854-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.8% NaCl (Saline)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SLBB9000V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.2 mL freezer tube</td>
			<td>NEST</td>
			<td>606101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultra low (-80&#176;C) freezer</td>
			<td>SO-LOW</td>
			<td>U85-18</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cryo Safety Gloves</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>H13201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri dishes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5856-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover slips #1.5</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>64-0721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Slides</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>63-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>2540E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phase-Contrast Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>624504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bunsen Burner</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>706706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS (phosphate buffer saline)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-50TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">WGA-FITC</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>29022-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Clear nail polish</td>
			<td>OPI</td>
			<td>22001009000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>Free Software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 mL beaker</td>
			<td>Pyrex USA</td>
			<td>1000-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 L beaker</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>721253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 L flask</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S63274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">250 mL flask</td>
			<td>Pyrex USA</td>
			<td>4980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 mL graduated cylinder</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>721788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">500 mL graduated cylinder&#160;</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>721792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stir Bar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-271825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Camera for Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>DP72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nitrile Examination Gloves (Med)</td>
			<td>Bio Excell</td>
			<td>71011002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>701077</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visual and microscopic evaluation of streptomyces developmental mutants

Streptomycetes는 세계에 걸쳐 발견 되 고 광범위 한 항생제 및 다른 이차 대사 산물을 생산 하는 문 Actinobacteria에 속하는 filamentous 토양 박테리아. Streptomyces coelicolor 는 다양 한 실험실 분석에 순종을 잘 특징, 비 병원 성 종입니다. 설명 하는 형질 방법을 여기 모델 streptomycete; S. coelicolor 사용 그러나, 방법 몇 가지 밀접 하 게 관련 된 actinomycetes로 서이 큰 속의 모든 구성원에 적용 됩니다. 형질 Streptomyces 환경에서 확인 된의 새로운 종 특성화 하는 데 필요한 이며 또한 특성화 Streptomyces의 새로 고립 된 돌연변이 체 긴장에 중요 한 첫 번째 단계입니다. 형질에 능력 세균 개발, 세포 분열, 염색체 분리 및 두번째 메신저 신호 연구 포함 Streptomyces 연구 분야를 입력 하는 많은 새로운 연구자에 대 한 중요 하다. 새로운 토양 미생물의 격리를 통해 항생제 발견의 최근 crowdsourcing 학생 훈련 강사 Streptomyces 연구와 그들의 대학 또는 고 등의 분야에 새로운에 대 한 형질에 대 한 증가 필요에 결과 있다. 이 원고는 세균성 긴장 전파, 저장, 및 영상 및 현미경 검사를 통해 특성화에 대 한 방법을 설명합니다. 이 기사를 읽은 후 새로운 연구원 (미생물학 교육 연구소와 시민 과학자) Streptomyces 긴장을 조작 하 여 시각적 특성 실험을 시작 수 있어야 합니다.

초기 형질 실험 새로운 종 및 긴장을 특성화에 필요한 고 계통학 및 새로운 종족을 특성화 하는 데 사용 되는 DNA-DNA 교 잡 실험에 대 한 무료 접근으로 사용할 수 있습니다. 화학 제품, UV, 같은 임의의 mutagenesis 방법에서 인 streptomyces 돌연변이 또는 transposon mutagenesis는 일반적으로 한 천 배지에서 직접, 영상 화면을 통해 식별 됩니다. Streptomyces 의 식민지 야생-타입, 부모의 부담에 비해 형 변경 내용을 검사 합니다. 예를 들어 밝은 색된 공중 균 포자 형성, 결함으로 인 한 회색 안료의 낮은 수준을 나타낼 수 있습니다 또는 퍼지 외관의 부족은 공중 사체가 형성 (그림 1) 블록의 표시 이다. 많은 streptomycetes 식물 균 사체 또는 주변 agar 안료 항생제 생산. S. coelicolor 는 두 착 아닌 것 들으로 서 두 가지 안료 항생제를 생성합니다. Actinorhodin 파란 색소 항생제 이며 undecylprodigiosin은 빨간색 색소 항생제45. 초기 비주얼 식민지 스크린 받은 긴장 다음 단일 식민지를 위한 줄무늬에 의해 전파 됩니다.
잠재적으로 흥미로운 돌연변이의 시각적 식별, 다음 긴장은 현미경 검사를 받게 됩니다. 단계 대조 현미경 검사 법은 특히 야생-타입 스트레인을 사용 하 여 컨트롤 (그림 2)로 발달 결함, Streptomyces 돌연변이 검사에 적합. 일반적으로 야생 타입 S. coelicolor 식민지 성장의 3 일 공중 균 MS 한 천에 30 ° C에서 성장의 약 2 일 및 포자의 긴 사슬에 의해 생산. 약간 느린 또는 다른 종류의 미디어에 빠른 라이프 사이클 진행 됩니다. 그것은 발달의 결함 및 지연에 대 한 결론을 그릴 때 돌연변이 야생 유형으로 동일한 성장 조건 하에서 분석 될. 대머리 돌연변이 한 미디어에 장기간된 성장 후 포자를 생성할 수 있습니다. 백색 돌연변이 중 포자 형성, 지연 될 수 있습니다으로 돌연변이의 클래스 포자 생산, 모양 및 크기 결함 생성 포자의 풍부 또는 성숙, 회색 포자 안료46 의 저수준 생산 단순히 감소 표시 . 지금까지 조사 하는 다른 돌연변이 지연 또는 신호 분자 (예를 들면, 순환 디 GMP47)의 축적에 대 한 영향을 돌연변이 같은 라이프 사이클 진행에 가속 수 있습니다.
가벼운 현미경 검사 법 기술은 위에서 설명한 간단한 후속은 포자 형성 격 막의 세포 벽 얼룩 얼룩 염색체 DNA nucleoids을 붙일 레이블된 밀 세균 agglutinin propidium 요오드 화물을 사용 하 여 형광 현미경 검사 법. 포자는 염색체 부족 얼룩, 포자 평소 식별 될 수 있습니다 (그림 3) 얼룩 감소를 표시 하는 경우 보다 적은 DNA를 포함 하는 동안 빨간 propidium 요오드 화물은 없는 것입니다. 밀 세균 agglutinin 세포 벽 얼룩 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 세포 벽 얼룩 패턴 (즉, 세포 분열 결함)에 차이가 관찰 될 수 있습니다. 그림 4 야생-타입 긴장의 S. venezuelae, 다른 모델로 사용 되 고 최근에 종에서 streptomycete의 빠른 라이프 사이클 및 액체45, sporulate 수는 명료 하 WGA FITC 물 되었습니다. 일반적으로 포자 형성 동안 일찍 본 부문 septa의 사다리 같은 배열입니다.
여기에 설명 된 초기 형질 전략 다음 초래 한다: 1) 추가 연구;에 대 한 관심의 돌연변이 체 긴장의 식별 2) 새로 확인된 된 돌연변이 유전자가 돌연변이 되어;의 잠재적인 역할에 대 한 지식을 축적 하 고 3) 이후 일련의 추가 질문에 유전자의 역할을 명확히 하는 데 사용할 수 다음 실험 단계를 수립 환경에서 새로 확인된 된 streptomycete의 경우 연구원 이미 Streptomyces종의 특징에 비해 잠재적인 새로운 종류의 지식을 얻을 것 이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig1.jpg"> 그림 1: S. coelicolor의 거시적인 식민지 고기를 보여주는 대표적인 한 천 격판덮개의 사진. 천 배지 표시 퍼지, 야생-타입 S. coelicolor 에 대 한 공중 균 사체의 회색 모양 발달 고기 다양 한 임의의 transposon 삽입 돌연변이 비해 MT1110 (WT) 스트레인. 돌연변이 공중 균 [대머리 (빌딩)] 또는 감소 포자 착 색 [화이트 (whi)] 공중 균에도 부족 한. Transposon 돌연변이 삽입 mutagenesis6,7에 대 한 미니-Tn5를 사용 하 여 생성 되었습니다. 변종 MS agar에 30 ° c.에서 5 일 동안 성장 했다 페 트리 접시 지름 100 m m입니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig2.jpg"> 그림 2: 단계 대조 현미경 대표 공중 보여주는 S. coelicolor 백색 돌연변이 대 한 필 라 멘 트 변종 포함 임의의 transposon 삽입 돌연변이. (A) 표시 이며 균일 하 게 생산 동기, 정기적으로 간격 세포 분열을 겪은 대표적인 야생 타입 공중 멘 모양의 포자 (MT1110) 크기. (B-F) 나머지 패널 표시 임의의 transposon mutagenesis 통해 고립 된 다양 한 백색 돌연변이 체의 다른 미세한 고기. 패널 B 공중 필 라 멘 트 포자 형성, 겪은 하지 하지만 대신 불 룩 한 일대는 필 라 멘 트 생산 하고있다 보여줍니다. C, D, 그리고 F 에 긴 화살표는 비정상적으로 큰 포자 돌연변이 MIC42, MIC43, 및 TH49의 특성을 나타냅니다. 패널 D 에 짧은 화살표 lysed 포자 구획의 예를 나타냅니다. 패널 전자 돌연변이 TH10 제작한 포자 체인의 전형적인 부분적으로 압축된 작은 구획을 보여줍니다. 변종 MS agar에 30 ° c.에서 5 일 동안 성장 했다 돌연변이 그림 1에 표시 된 관련이 없습니다. 야생 타입 포자 긴 축에 약 1.1 µ m 이다. 눈금 막대 = 2 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2.jpg"> 그림 3: 대표 현미경 보여주는 S. coelicolor 돌연변이 염색체 분리 고기. (A) A 다이어그램 표현 보여주는 포자 (모든 포자 염색체 DNA를 포함)의 체인에 대 한 일반적인 야생-타입, 정기적으로 간격 얼룩 모양을 표시 한 염색체 돌연변이 대 한 간헐적인 얼룩 패턴에 비해 분리의 결함 (B) 패널의 각 쌍이 보여줍니다 같은 포자 체인 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 이미지 왼쪽에 의해 관찰 된 propidium 요오드 화물-얼룩진 형광 이미지 오른쪽에 표시 됩니다. 야생-타입 형 (a, b) 두 명의 임의의 transposon 삽입 돌연변이 (c, d 와 e, f)과 비교 됩니다. 화살표는 DNA가 없는 포자를 나타냅니다. 변종 MS agar에 30 ° c.에서 5 일 동안 성장 했다 표시 된 돌연변이 그림 1 과 그림 2에 그 관련 되지 않습니다. 눈금 막대 = 1 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3.jpg"> 그림 4: 형광 현미경 사진 S. venezuelae 야생-타입 스트레인의 WGA FITC와 스테인드. 공중 필 라 멘 트의 (A) A 다이어그램이 나타납니다 없음 들여쓰기와 부드러운 있으며 포자 형성의 초기 단계를 나타내는 세포 벽 얼룩의 사다리 같은 배열 비교 단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 포자 형성의 보이는 흔적 형광 현미경 검사 법에서 WGA FITC를 사용 하 여 그 같은 필 라 멘 트에 시작. 야생-타입 S. venezuelae의 현미경 사진 (B). (한) 부드러운 공중 필은 포자 체인 중 존재 한다. (b) 패널에 표시 된 균 사체 내, 1 공중 필 라 멘 트 개발에서 초기 단계에서 세포 벽 증 착의 사다리 모양의 배열을. 화살표는 크로스-벽의 정기적으로 간격을 형성 발달 관련 된 포자 형성을 겪 습으로 단일 공중 필 라 멘 트 내에서 동기적으로 개발 하는 WGA FITC에 의해 스테인드 나타냅니다. 변형 30 ° c.에 38 h (Maltose, Y이스트 추출 물, Malt 추출) MYM MYM agar에 성장 했다 눈금 막대 = 2 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomyces 발달 돌연변이의 영상 및 현미경 평가

여기 우리는 초보자에 대 한 프로토콜 Streptomyces약리학 중요 한 세균 속에 대 한 형질을 시작 하는 연구원을 제시.

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

visual-microscopic-evaluation-streptomyces-developmental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

17.6K 조회수.  Otterbein University. 여기 우리는 초보자에 대 한 프로토콜 Streptomyces약리학 중요 한 세균 속에 대 한 형질을 시작 하는 연구원을 제시.

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Facilitating the Analysis of Immunological Data with Visual Analytic Techniques

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the flexibility of a VA approach in the analysis of biological datasets. Examples of these datasets in immunology include flow cytometry, Luminex data, and genotyping (e.g., single nucleotide polymorphism) data. Contrary to the traditional information visualization approach, VA restores the analysis power in the hands of analyst by allowing the analyst to engage in real-time data exploration process. We selected the VA software called Tableau after evaluating several VA tools. Two types of analysis tasks analysis within and between datasets were demonstrated in the video presentation using an approach called paired analysis. Paired analysis, as defined in VA, is an analysis approach in which a VA tool expert works side-by-side with a domain expert during the analysis. The domain expert is the one who understands the significance of the data, and asks the questions that the collected data might address. The tool expert then creates visualizations to help find patterns in the data that might answer these questions. The short lag-time between the hypothesis generation and the rapid visual display of the data is the main advantage of a VA approach.

Visual analytics (VA) is a new approach of analyzing data interactively. In this video, we discuss the data overload problem brought on by high-throughput biological experiments, and propose VA as a solution to such problem. The video demonstrates analysis within and between immunological datasets using a VA tool called Tableau.

비주얼 분석 기법과 면역 데이터 분석을 촉진

Visual analytics (VA) has emerged as a new way to analyze large dataset through interactive visual display. We demonstrated the utility and the ...

연구

면역학 및 감염병학

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

분리하기위한 유전자 스크린 Toxoplasma gondii 호스트 세포 재현의 돌연변이

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

T6SS로 인한 세균 경쟁을 모니터링 할 비주얼 분석

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible for most malaria-related deaths globally. Several factors including parasite sequestration in tissues, vascular dysfunction, and inflammatory responses influence the evolution of the disease in malaria-infected people. P. falciparum-infected red blood cells (iRBCs) release small extracellular vesicles (EVs) containing different kinds of cargo molecules that mediate pathogenesis and cellular communication between parasites and host. EVs are efficiently taken up by cells in which they modulate their function. Here we discuss strategies to address the role of EVs in parasite-host interactions. First, we describe a straightforward method for labeling and tracking EV internalization by endothelial cells, using a green cell linker dye. Second, we report a simple way to measure permeability across an endothelial cell monolayer by using a fluorescently labeled dextran. Finally, we show how to investigate the role of small non-coding RNA molecules in endothelial cell function.

In this work, we describe protocols to investigate the role of extracellular vesicles (EVs) released by Plasmodium falciparum infected erythrocytes. In particular, we focus on the interactions of EVs with endothelial cells.

말라리아 감염 시 세포 외 기 기능의 평가

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and sectioning of intact microbial colony biofilms using perfused paraffin wax. To adapt this method for use on colony biofilms, we developed techniques for maintaining each sample on its growth substrate and laminating it with an agar overlayer, and added lysine to the fixative solution. These optimizations improve sample retention and preservation of micromorphological features. Samples prepared in this manner are amenable to thin sectioning and imaging by light, fluorescence, and transmission electron microscopy. We have applied this technique to colony biofilms of Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, and Vibrio cholerae. The high level of detail visible in samples generated by this method, combined with reporter strain engineering or the use of specific dyes, can provide exciting insights into the physiology and development of microbial communities.

We describe fixation, paraffin embedding, and thin sectioning techniques for microbial colony biofilms. In prepared samples, biofilm substructure and reporter expression patterns can be visualized by microscopy.

파라핀 포함 및 현미경 분석에 대 한 미생물 식민지 Biofilms의 얇은 단면

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

주문, 녹 농 균 스트레인 PA14 Transposon 삽입 돌연변이의 비중복 라이브러리의 복제

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

크립토코커스-아메바 상호 작용 을 연구할 때 현미경 기술과 형광 읽기의 상호 보완적 사용

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Rapid, Seamless Generation of Recombinant Poxviruses using Host Range and Visual Selection

Vaccinia virus (VACV) was instrumental in eradicating variola virus (VARV), the causative agent of smallpox, from nature. Since its first use as a vaccine, VACV has been developed as a vector for therapeutic vaccines and as an oncolytic virus. These applications take advantage of VACV&#8217;s easily manipulated genome and broad host range as an outstanding platform to generate recombinant viruses with a variety of therapeutic applications. Several methods have been developed to generate recombinant VACV, including marker selection methods and transient dominant selection. Here, we present a refinement of a host range selection method coupled with visual identification of recombinant viruses. Our method takes advantage of selective pressure generated by the host antiviral protein kinase R (PKR) coupled with a fluorescent fusion gene expressing mCherry-tagged E3L, one of two VACV PKR antagonists. The cassette, including the gene of interest and the mCherry-E3L fusion is flanked by sequences derived from the VACV genome. Between the gene of interest and mCherry-E3L is a smaller region that is identical to the first ~150 nucleotides of the 3&#8217; arm, to promote homologous recombination and loss of the mCherry-E3L gene after selection. We demonstrate that this method permits efficient, seamless generation of rVACV in a variety of cell types without requiring drug selection or extensive screening for mutant viruses.

This is a method to generate &#8220;scarless&#8221; recombinant vaccinia viruses using host-range selection and visual identification of recombinant viruses.