ونشكر ك. جيل لإدارة المختبرات والدعم التقني، J. هوكينز والموظفين من الوطنية معاهد للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) بناء 50 منشأة الحيوان للمساعدة مع الرعاية الماوس، ور. ريد وبالدريي واو للمساعدة الإدارية. شكرا أيضا موتيجى س. و. م. أوديي لتقاسم على بروتوكول تشريح الجلد الإذن، وحروق أ لتعليمات تحريرية، وأعضاء من "مختبر الخلايا الجذعية" وبيولوجيا الأعصاب والأوعية الدموية للمساعدة التقنية ومناقشة مدروسة. ت يامازاكي أيده "الجمعية اليابانية" لتعزيز العلوم (JSPS) المعاهد الوطنية للصحة-كايتوكو. هذا العمل كان يدعمها "برنامج البحوث الداخلية الوطني للقلب" والرئة، والدم معهد (HL005702-11 إلى Y.M.)

أجريت جميع التجارب في هذا الباب تحت الموافقة من الوطني للقلب والرئة، والدم معهد (NHLBI) العناية بالحيوان واللجنة استخدام.
1-الكبار الماوس الإذن الجلد جمع
<ol><li>Euthanize الفئران الكبار بالتعرض لغاز ثاني أكسيد الكربون (CO2) في دائرة مغلقة، ثم قم بتأكيد القتل الرحيم بخلع عنق الرحم. ملاحظة: التجربة يتبع المبدأ التوجيهي المعاهد الوطنية للصحة (NIH) لأسلوب القتل الرحيم.</li>
	<li>تشريح الإذن من القاعدة ووضعه في 35 × 10 مم2 طبق بتري يحتوي على 2 مل من موازنة الملح الحل (حبس هانك). بإيجاز قص الشعر بالمقص.</li>
	<li>قشر الجلد الخلفي والجلد الأمامي بعيداً بعناية من الغضاريف الفاصلة. ملاحظة: غضروف تعلق على الجلد الأمامي.</li>
	<li>نقل مؤخرة والجلد الأمامي بشكل منفصل إلى 24 جيدا لوحة تحتوي على 1 مل من المثلج الطازج 4% بارافورمالدهيد (PFA) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) كل بئر. تسطيح الجلد الأمامي والخلفي في 4% منهاج عمل بيجين.</li>
	<li>إصلاح الجلد الأمامي والخلفي مع غضروف في 4 درجات مئوية عن ح 1.</li>
	<li>أغسل الجلد الأمامي والخلفي 3 مرات لمدة 5 دقائق في 1 مل من برنامج تلفزيوني مع خلط لطيف في خلاط في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>نقل الجلد الأمامي والخلفي مع الغضروف إلى الجزء السفلي من 35 × 10 مم2 طبق بيتري. قطع منطقة الأساسي، الذي هو مطوية والدهنية والأنسجة الضامة. تقشر الغضروف من الجلد الأمامي باستخدام الملقط المنحنية الجميلة.</li>
	<li>بعناية إزالة الشعر والأنسجة الدهنية، والأنسجة الضامة من داخل الجلد الخلفي باستخدام الملقط المنحنية الجميلة. الحفاظ على الجلد الرطب مع برنامج تلفزيوني.</li>
</ol>2-المناعي الجامعة-جبل تلطيخ الجلد الإذن الماوس
ملاحظة: أجريت جميع التجارب في المقاطع التالية وفقا لإرشادات السلامة المختبرية المعاهد الوطنية للصحة.
<ol><li>إعداد المخزن المؤقت حظر. تصفية الحرارة 10% معطل الماعز المصل (هيجس) المخفف في برنامج تلفزيوني مع تريتون 0.2% X-100 (تكساس-100) حظر المخزن المؤقت، أو المخفف 10% حمار المصل (DS) في برنامج تلفزيوني مع 0.2% المخزن المؤقت حظر TX-100، باستخدام وحدة تصفية 0.45 ميكرومتر.</li>
	<li>نقل مؤخرة والجلد الأمامي 24 أيضا لوحة تحتوي على 1 مل 10% هيجس حظر المخزن المؤقت أو المخزن المؤقت حظر س 10% كل بئر. احتضان الجلد لمدة 30 دقيقة مع خلط لطيف في خلاط في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>إعداد الحل جسم الأولية بتمييع الأجسام المضادة الأولية (جدول المواد) في المخزن المؤقت لحظر (أي 10% هيجس أو 10% DS). ملاحظة: كل-موت المناعي تحليل الجلد الإذن الكبار مع الأجسام المضادة لعموم العصبية العلامة الخاصة بالخلايا العصبية فئة الثالث β-tubulin (Tuj1، أرنب [بولكلونل] مفتش أو الماوس مونوكلونكال IgG2a، وتمييع 1: 500 في تركيز نهائي 2 ميكروغرام/مل)، خلية عموم غشائي ماركر الصفائح الدموية غشائي خلية التصاق جزيء 1 (بيكم-1، الهامستر [مونوكلونل] مفتش، تمييع رافعة في تركيز نهائي 3.3 ميكروغرام/مل)، المايلين غمد المايلين ماركر البروتين الأساسية (MBP، أرنب [بولكلونل] مفتش، تمييع 1: 200 في النهائي تركيز 5 ميكروغرام/مل) وعلامة خلية النقوي التهاب CD11b (الفئران [مونوكلونل] IgG2b، 01:50 إضعاف تركيز النهائي 20 ميكروغرام/مل) كان هو مبين في الشكل 1 و الشكل 2. وكان المحتضنة الجلد مع مترافق Cy3 الأجسام المضادة للعضلات الملساء والأوعية الدموية الخلية علامة α العضلات الملساء أكتين (αSMA) جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة الثانوية (2.6). الأجسام المضادة الابتدائي اختبرت بأنفسنا مدرجة في الجدول للمواد. يمكن أن تكون مختلطة متعددة الأجسام الأولية المستمدة من مختلف الأنواع في وقت واحد.</li>
	<li>نقل الجلد الأمامي والخلفي لبئر جديدة تحتوي على 150 ميليلتر من الحل الأجسام الأولية. احتضان الجلد مع خلط لطيف في خلاط في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.</li>
	<li>اليوم التالي، نقل الجلد الأمامي والخلفي لآبار جديدة في لوحة جيدا 24 أو نضح حظر المخزن المؤقت الذي يحتوي على الأجسام المضادة الأولية. أضف 1 مل أما 2% المخفف هيجس في برنامج تلفزيوني مع المخزن المؤقت للغسيل TX-100 0.2% أو 2% المخفف DS في برنامج تلفزيوني مع 0.2% TX 100 الغسيل المخزن المؤقت. أغسل الجلد مع التغييرات 3 الغسيل المخزن المؤقت كل 15 دقيقة مع خلط لطيف في خلاط في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>إعداد الحل جسم الثانوي (جدول المواد). تمييع الأجسام المضادة الثانوية في المخزن المؤقت لحظر (أي 10% هيجس أو 10% DS) وتصفية حظر المخزن المؤقت الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية من خلال 0.22 ميكرومتر ثنائي الفلوريد (PVDF) غشاء الفينيليدن مرشح حقنه متصلة بحقنه 1 مل. ملاحظة: أليكسا 488 أو الماعز مترافق 633 أرنب المضادة IgG (H + L) أو الماوس IgG2a ل Tuj1، الهامستر المضادة مفتش (H + L) مترافق 647 أليكسا الماعز للماعز بيكم-1، 488 أليكسا مترافق الأرنب المضادة IgG (H + L) ل MBP، واستخدمت الفئران مترافق 594 أليكسا مفتش (H + L) ل CD11b مع تمييع 1: 250 في تركيز النهائي 8 ميكروغرام/مل. وكان المحتضنة الجلد بجسم αSMA Cy3 مترافق (تخفيف 1: 500 في تركيز نهائي 2-3 ميكروغرام/مل) في تركيبة مع هذه الأجسام المضادة الثانوية.</li>
	<li>الطرد المركزي الحل في 13,000 س ز لمدة 10 دقيقة لإزالة الجسيمات المجمعة من الأجسام المضادة الثانوية من المخزن المؤقت حظر. ملاحظة: يمكن أن تكون مختلطة مختلفة الفلورسنت مترافق الثانوي الأجسام المضادة المستمدة من مختلف الأنواع في وقت واحد.</li>
	<li>نقل الجلد الأمامي والخلفي جيدا يحتوي على 150 ميليلتر من الأجسام المضادة الثانوية الحل. التفاف لوحة جيدا 24 في رقائق الألومنيوم تجنب الضوء واحتضان الجلد ح 1 مع خلط لطيف في خلاط في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>نقل الجلد الأمامي والخلفي لآبار جديدة في لوحة جيدا 24 أو نضح الحل جسم الثانوية قبل بيبيت تماما. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل هيجس 2% أو 2% DS الغسيل المخزن المؤقت.</li>
	<li>التفاف لوحة جيدا 24 في رقائق الألومنيوم وتغسل مع التغييرات 3 من المخزن المؤقت الغسيل كل 15 دقيقة مع خلط لطيف في خلاط في درجة حرارة الغرفة.</li>
</ol>3-تصاعد الجلد الإذن على الشريحة
<ol><li>مكان الجلد في الجزء السفلي من 35 × 10 مم2 طبق بيتري. بعناية إزالة الشعر والأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة، وغبار وألياف من داخل الجلد باستخدام الملقط المنحنية الجميلة تحت ستيريوميكروسكوبي مع إضاءة منخفضة إلى أدنى حد من تبييض الصورة الواسعة. الحفاظ على الجلد الرطب مع برنامج تلفزيوني.</li>
	<li>نقل الجلد إلى شريحة مجهر لاصقة باستخدام الملقط. ضع الجلد الأمامي والخلفي مع الداخل مواجهة على الشريحة. تسطيح الجلد باستخدام الملقط.</li>
	<li>جبل الجلد في متوسط سائل تتلاشى لمكافحة تصاعد تجنب فوتوبليتشينج والحفاظ على إشارات الفلورسنت. تأكد من أن لا فقاعات الهواء على أو حول الجلد.</li>
	<li>تغطية مع ساترة على عينات الجلد بعناية وتخزين الشرائح عينة الجلد المحملة في ليل الظلام في درجة حرارة الغرفة للسماح بالحصول على وسائل الإعلام تصاعد راسخ. ختم ساترة للشريحة مع طلاء الأظافر وتخزينها في 4 درجات مئوية للتخزين على المدى الطويل.</li>
</ol>4-[كنفوكل] مجهرية
<ol><li>إعداد الليزر المناسبة فلوروفوريس. ويستخدم مجهر [كنفوكل] مع ثلاثة مصادر الليزر (الأرجون 488 نانومتر، nm 561 والعسف وزناد 633 نانومتر) في هذه التجربة.</li>
	<li>استخدم أداة التفحص متسلسلة، مما يثير في نفس الوقت عينات ثلاثية الملون، لتجنب والحد من حدوث أي تداخل. ملاحظة: سوف تؤخذ الصور بطريقة متسلسلة باستخدام طريقة المسح الضوئي متسلسلة.</li>
	<li>الصورة تحت هدف X 10. استخدام أداة مسح البلاط لالتقاط الجلد الإذن كلها. تعيين مكدس Z وتأكد من أن z-الموقف الذي يغطي كامل سمك الجلد الإذن.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin.">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li><li>Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+confocal+microscopy+for+vascular+branching+morphogenesis.">Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).</li><li>Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunohistochemical+analysis+for+embryonic+limb+skin+vasculature:+a+model+system+to+study+vascular+branching+morphogenesis+in+embryo.">Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Myeloid+Progenitors+Differentiate+into+Pericytes+through+TGF-beta+Signaling+in+Developing+Skin+Vasculature.">Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature.</a> Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).</li><li>Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel-dependent+recruitment+of+sympathetic+axons:+looking+for+innervation+in+all+the+right+places.">Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places.</a> J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve-derived+CXCL12+and+VEGF-A+regulate+the+patterning+of+arterial+vessel+branching+in+developing+limb+skin.">Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin.</a> Dev Cell. 24, 359-371 (2013).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. , e51749 (2014).</li><li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+Whole+Mount:+A+Novel+Processing+and+Imaging+Protocol+for+Thick,+Three-dimensional+Tissue+Cross-sections+of+Skin.">Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Liakath-Ali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+skin+phenotypes+revealed+by+a+genome-wide+mouse+reverse+genetic+screen.">Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen.</a> Nat Commun. 5, 3540 (2014).</li><li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin.">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery.">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).</li><li>Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atopic+dermatitis.">Animal models of atopic dermatitis.</a> J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).</li><li>Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoriasis:+what+we+have+learned+from+mouse+models.">Psoriasis: what we have learned from mouse models.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).</li><li>Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+challenges+of+chronic+wounds:+searching+for+an+optimal+animal+model+to+recapitulate+their+complexity.">Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity.</a> Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).</li><li>O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+diabetic+neuropathy.">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> ILAR J. 54, 259-272 (2014).</li><li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+Adult+Ear+Skin+Imaging+Reveals+Defective+Neuro-Vascular++Branching+Morphogenesis+in+Obese+and+Type+2+Diabetic+Mouse+Models.">Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models.</a> Sci Rep. 8, (2018).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

ويصف هذا البروتوكول تصوير الجامع-جبل إيمونونوهيستوتشيميكال من الجلد الإذن الكبار لتحليل الهياكل العصبية والأوعية الدموية وتوزيع الخلايا المناعية. ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب له العديد من المزايا التجريبية للباحثين لدراسة morphogenesis المتفرعة والزخرفة للأعصاب المحيطية، والأوعية الدموية، وك...

يتكون الجلد من ثلاث طبقات: البشرة، الأدمة و hypodermis. قد استخدمت كنظام نموذجي لدراسة الحفاظ على الخلايا الجذعية، والتمايز، و morphogenesis في التنمية، فضلا عن تجديد وتوموريجينيسيس، والتهاب في تعليم الكبار. الجلد الغني vascularized ومعصب أن تطوير نظام الأوعية الدموية والجهاز العصبي المحيطي منسقة تنسيقاً جيدا.
وقد أثبتنا سابقا تقنية تصوير الجامع-جبل جنينية جلد مع وضع العلامات متعددة لدراسة سليمة الأعصاب المحيطية والأوعية الدموية، بما في ذلك تلك المكونات الخلوية1،2،3، 4: محاور عصبية حسية ومحاور عصبية متعاطفة، شوان خلايا الأعصاب، خلايا بطانية، بيريسيتيس، وخلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية (فسمكس) في الأوعية الدموية. خلال الأوعية، شبكة شعرية الأولية يخضع لإعادة عرض الأوعية الدموية المكثفة ويتطور إلى شبكة المتفرعة الأوعية الدموية هرمية. في الأدمة النامية/hypodermis، فرع جنبا إلى جنب مع الأعصاب الحسية الطرفية وعروق الشرايين ثم تشكل المتاخمة للشرايين. بعد شبكة الأوعية الدموية الهرمية دقة مغطاة فسمكس، تمتد على طول الأعصاب متعاطفة ويعصب الأوعية الدموية كبيرة قطرها1،،من56. وعلى الرغم من الأهمية في الارتباط الوثيق بين نظم الأوعية الدموية والجهاز العصبي النامي، كان سؤالاً رئيسيا للتصدي لما يحدث للشبكات العصبية والأوعية الدموية في مختلف الحالات المرضية لدى البالغين. تصوير ثلاثي الأبعاد عالية الدقة ضروري نقدر المرضية، جنبا إلى جنب مع التعرف تشريحيا morphogenesis المتفرعة والزخرفة.
عادة يتم تحليل morphogenesis الخلايا العصبية والأوعية الدموية في الجلد الماوس الكبار تلطيخ قسم الأنسجة. واستخدمت دراسات أخرى تصوير الجامع-جبل من الجلد إلى تصور الأعصاب المحيطية والأوعية الدموية، بالإضافة إلى بصيلات الشعر والغدد الدهنية، ومقفه الشعرة العضلات7،،من89. ومع ذلك، سمك الجلد الكبار جعلت من الصعب تحليل الجلد على مدى عمق أكملها.
في هذه الدراسة، قمنا بتطوير تصوير الجامع-جبل عالية الدقة رواية الجلد الإذن الكبار للتغلب على هذه التحديات. الجلد الإذن متاحة لتشريح وتصوير الجامع-جبل اللاحقة من الجلد على مدى عمق أكملها. وهكذا، هو أسلوب مباشر واستنساخه بشدة التي يمكن تطبيقها لمقارنة هيكل ثلاثي الأبعاد نظم الجهاز العصبي والأوعية الدموية الطرفية في الجلد، مع القياسات القياس الكمي الشامل. أظهرنا أن المحاذاة للأعصاب المحيطية الحسية ومتعاطفة مع الأوعية الدموية كبيرة قطرها محفوظاً في الجلد الكبار. والهدف من هذا البروتوكول تصور morphogenesis المتفرعة، والزخرفة للأعصاب المحيطية، والأوعية الدموية، فضلا عن توزيع الخلايا المناعية على مستوى خلوي في نماذج الماوس الكبار في ظروف مختلفة مثل التهاب و التجديد.

<table><tbody><tr><td>10 x Phosphate Buffered Saline</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3210</td><td>PBS, without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>HBSS, with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>PFA, fixative, diluted in PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td>Component of blocking/washing buffer</td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson Immuno research</td><td>017-000-121</td><td>Component of blocking/washing buffer</td></tr><tr><td>Curved fine tweezers</td><td>Dumont</td><td>RS-5047</td><td></td></tr><tr><td>Curved tweezers</td><td>Integra Miltex Vantage</td><td>V918-782, V918-784</td><td></td></tr><tr><td>Filter Unit 0.45 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>157-0045</td><td>For filtration</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Coviden</td><td>8881501400</td><td>For filtration</td></tr><tr><td>Syringe filter Unit 0.22 mm</td><td>Millex-GV</td><td>SLGVR04NL</td><td>For filtration</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36934</td><td>Anti-fade mounting medium</td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td>For sealing</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>Graphics editor software</td></tr><tr><td>Illustrator CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>Graphics editor software</td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>Image processing software</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31) antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB1398Z</td><td>Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31) antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553369</td><td>Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#945;SMA antibody conjugated with cy-3</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-EphB1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9319</td><td>Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-neuron-specific Class III &amp;#946;-tubulin (Tuj1)</td><td>Abcam</td><td>AB18207</td><td>Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Tuj1 antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-MBP antibody</td><td>Abcam</td><td>AB40390</td><td>Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200</td></tr><tr><td>Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody</td><td>Chemicon</td><td>AB152</td><td>Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Peripherin antibody</td><td>Chemicon</td><td>AB1530</td><td>Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-CD11b antibody</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA74G</td><td>Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50</td></tr><tr><td>Anti-CD45 antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0451-85</td><td>Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-CD3 antibody</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1477T</td><td>Rat IgG1, immune cell marker, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD45R (B220) antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0452</td><td>Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200</td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11122</td><td>Rabbit polyclonal, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab13970</td><td>Chicken polyclonal, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#946;-gal antibody</td><td>Cappel</td><td>55976</td><td>Rabbit polyclonal, 1:5000</td></tr><tr><td>Anti-RFP antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td>Rabbit polyclonal, 1:300</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647</td><td>Jackson Immuno research</td><td>127-605-160</td><td>Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594</td><td>Jackson Immuno research</td><td>112-585-167</td><td>Rat polyclonal secondary antibody, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21136</td><td>Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250</td></tr></tbody></table>

whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution

نقدم هنا، على بروتوكول للجلد كلياً-جبل الإذن الكبار التصوير تقنية لدراسة شاملة morphogenesis المتفرعة الأوعية الدموية العصبية ثلاثي الأبعاد والزخرفة، فضلا عن توزيع الخلايا المناعية على مستوى خلوي. ويوفر تحليل الهياكل التشريحية الأعصاب والأوعية الدموية الطرفية في أنسجة البالغين بعض الأفكار في فهم الأسلاك الوظيفية العصبية والأوعية الدموية وضمور الأعصاب والأوعية الدموية في الحالات المرضية مثل التئام الجروح. كنظام نموذجي الزاخر، وقد ركزنا على دراساتنا على جلد الإذن الكبار، ومتاحة للتشريح. ويوفر لنا البروتوكول بسيطة واستنساخه تصوير دقيق للمكونات الخلوية في الجلد كله، مثل الأعصاب المحيطية (محاور عصبية حسية ومتعاطفة مع محاور عصبية وخلايا شوان)، والأوعية الدموية (خلايا بطانية وخلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية )، والخلايا الملتهبة. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول سوف تمهد الطريق للتحقيق المورفولوجية تشوهات في الأعصاب المحيطية والأوعية الدموية وكذلك الالتهاب في الجلد الإذن الكبار تحت مختلف الحالات المرضية.

كانت الماوس الكبار الإذن الخلفي الجلد (الشكل 1A) والجلد الإذن الأمامية (الشكل 1B) إيمونوستينيد مع الأجسام المضادة إلى αSMA (أحمر)، Tuj1 (الأخضر)، وبيكم-1 (أزرق). وكان الجلد الخلفي إيمونوستينيد لدراسة التوزيع العصبية المناعية باستخدام الأجسام الم?...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution at JoVE.com

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

هنا، نحن وصف أسلوب تصوير الجامع-جبل عالية دقة في الجلد الإذن الكامل الماوس الكبار، والتي تمكننا من تصور morphogenesis المتفرعة والزخرفة للأعصاب المحيطية، والأوعية الدموية، فضلا عن توزيع الخلايا المناعية.

الجامعة-جبل [كنفوكل] الفحص المجهري للجلد الإذن الكبار: نظام نموذجي لدراسة Morphogenesis المتفرعة العصبية والأوعية الدموية وتوزيع الخلايا المناعية

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

whole-mount-confocal-microscopy-for-adult-ear-skin-model-system-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.1K Views.  National Institutes of Health. هنا، نحن وصف أسلوب تصوير الجامع-جبل عالية دقة في الجلد الإذن الكامل الماوس الكبار، والتي تمكننا من تصور morphogenesis المتفرعة والزخرفة للأعصاب المحيطية، والأوعية الدموية، فضلا عن توزيع الخلايا المناعية.

Video: Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

شقة التصوير من جبل ماوس الجلد وتطبيقه على تحليل الشعر جريب الزخرفة والحسية أكسون الصرف

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Neuroscience

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

التصوير CD4 T خلية الخلالية الهجرة في الأدمة الملتهبة

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Immunology and Infection

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

كله يشن التحليل المناعى للالجنينية الاطراف الأوعية الدموية الجلدية : نظام نموذجي لدراسة الأوعية الدموية المتفرعة التشكل في الأجنة

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Biology

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

رصد بصري الأعصاب الطرفية المعيشة وصفها في الشعر المسام سناني الشكل النهايات لل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس الأذن الجلد

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

التقطيع بالتبريد والتلوين المناعي لأنسجة الأذن الداخلية للفأر: من المراحل الجنينية إلى مرحلة البلوغ

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

This protocol describes the induction of an ischemia-reperfusion (IR) model on mouse ear skin using magnet clamping. Using a custom-built intravital imaging model, we study in vivo inflammatory responses post-reperfusion. The rationale behind the development of this technique is to extend the understanding of how leukocytes respond to skin IR injury.

حمل إصابة نقص التروية ضخه في الجلد الأذن ماوس لحيوي داخلي Multiphoton التصوير من الاستجابات المناعية

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Medicine

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

تلطيخ التألق المناعي بالكامل ، والتصوير البؤري وإعادة البناء 3D للعقدة الجيبية الأذينية والأذينية البطينية في الماوس

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

تشريح الأوعية الدموية المجهرية للخطوط الدموية لتسلسل النواة المفردة أو تلطيخ المناعة

Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell mechanotransduction and ultimately hearing. Pathologies of the stria vascularis can result in a decreased hearing. Dissection of the adult stria vascularis allows for focused single-nucleus capture and subsequent single-nucleus sequencing and immunostaining. These techniques are used to study stria vascularis pathophysiology at the single-cell level. 
Single-nucleus sequencing can be used in the setting of transcriptional analysis of the stria vascularis. Meanwhile, immunostaining continues to be useful in identifying specific populations of cells. Both methods require proper stria vascularis dissection as a prerequisite, which can prove to be technically challenging.

تسليط الضوء على المؤلف: تشريح الأوعية الدموية للفأر البالغ من أجل تسلسل النواة المفردة أو تلطيخ المناعة  

The stria vascularis is vital to the generation of endocochlear potential. Here, we present the dissection of the adult mouse stria vascularis for single-nucleus sequencing or immunostaining.

الجامعة-جبل [كنفوكل] الفحص المجهري للجلد الإذن الكبار: نظام نموذجي لدراسة Morphogenesis المتفرعة العصبية والأوعية الدموية وتوزيع الخلايا المناعية

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST