K. Gill Laboratuvar Yönetimi için teşekkür ediyoruz ve fare Bakımı ve R. Reed konusunda yardım almak için 50 hayvan tesis ve F. Baldrey yönetim yardım almak için teknik destek, J. Hawkins ve personel Ulusal kurumları, Sağlık (NIH) bina. Onların kulak cilt diseksiyon protokolü, N. Burns Editör Yardım ve üyeleri kök hücre Laboratuvarı ve teknik yardım ve düşünceli tartışma için Neuro-vasküler Biyoloji paylaştığınız için teşekkür ederiz S. Motegi ve M. Udey. T. Yamazaki bilim promosyon (JSP'ler) NIH-KAITOKU için Japonya Derneği tarafından desteklenmiştir. Bu eser Ulusal kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (Y.M. için HL005702-11), Intramural araştırma programı tarafından desteklenen

Bu bölümdeki tüm deneylerin Ulusal kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (NHLBI) hayvan bakım ve kullanım Komitesi onayını altında yapıldı.
1. yetişkin Fare kulağı deri koleksiyonu
<ol><li>Kapalı bir oda içinde karbondioksit (CO2) maruz yetişkin fareler ötenazi ve ötenazi tarafından servikal çıkığı onaylayın. Not: Deneme ötenazi yöntemi için Ulusal Enstitüsü Sağlık (NIH) kılavuz takip eder.</li>
	<li>Kulak tabanından incelemek ve bir 35 x 10 mm2 ' de 2 mL, Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) içeren Petri kabına yerleştirin. Kısa bir süre kıllar makasla kesme.</li>
	<li>Soyma posterior cilt ve anterior deriden uzak dikkatli bir şekilde müdahalede bulunan kıkırdak. Not: Kıkırdak ön cilde ekler.</li>
	<li>Aktarım arka ve ön cilde ayrı ayrı bir 24 iyi plakası buz gibi taze % 4 (PFA) fosfat tamponlu tuz iyi (PBS) içinde paraformaldehyde içeren 1 mL. %4 arka ve ön deride dümdüz PFA.</li>
	<li>Arka ve ön Cilt 1 h için 4 ° C'de kıkırdak ile düzeltmek.</li>
	<li>Arka ve ön Cilt 3 kere 5 min için PBS bir karıştırıcı oda sıcaklığında hafif karıştırma ile 1 mL yıkayın.</li>
	<li>Arka ve ön cilt kıkırdak ile bir 35 x 10 mm2 Petri kabına altına aktarın. Katlandığında ve yağ ve bağ dokusu olduğu temel bölge, kes. Ön deri ince kavisli forseps kullanarak kıkırdak akasındaki.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde kıllar, yağ doku ve bağ dokusu iyi eğri cımbız kullanarak arka deri içinden çıkarın. PBS ile ıslak cilt tutmak.</li>
</ol>2. bütün Dağı immunohistokimyasal Fare kulağı deri boyama
Not: Aşağıdaki bölümlerde tüm deneylerin NIH laboratuvar güvenlik kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
<ol><li>Engelleme arabellek hazırlayın. Filtre % 10 ısı inaktive keçi serum (HIGS) PBS içinde % 0,2 triton ile X-100 (TX-100) engelleme arabellek seyreltilmiş veya % 10 eşek serum (DS) PBS içinde % 0,2 ile 0,45 µm filtre birimini kullanarak TX-100 engelleme arabellek seyreltilmiş.</li>
	<li>Arka aktarmak ve ön bir 24 cilde de içeren 1 mL % 10 HIGS engelleme arabellek veya iyi başına % 10 DS engelleme arabellek plakası. Cilt üzerinde bir karıştırıcı oda sıcaklığında hafif karıştırma ile 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Birincil antikor çözüm engelleme arabellekte (Malzemeler tablo) birincil antikorlar sulandrarak hazırlamak (ya da %10 HIGS veya % 10 DS). Not: Bütün mout immunohistokimyasal analizi (Tuj1, tavşan poliklonal IgG veya fare monocloncal Igg2a, 2 µg/mL son konsantrasyonu, 1:500 seyreltme), pan-nöronal marker nöron özgü sınıf III β-tübülin antikorlar ile yetişkin kulak deri Pan-endotel hücre işaretçisi trombosit endotel hücre adezyon molekül 1 (PECAM-1, hamster monoklonal IgG, 3.3 µg/mL son konsantrasyonu, 1:300 seyreltme), miyelin kılıf marker miyelin temel protein (MBP, tavşan poliklonal IgG, 1: 200 seyreltme, son konsantrasyonu 5 µg/mL) ve inflamatuar myeloid hücre işaretçisi CD11b (fare monoklonal Igg2b, 1:50 20 µg/mL son konsantrasyonu, seyreltme) şekil 1 ve Şekil 2' gösterildi. Deriyi Cy3 Birleşik antikor vasküler düz kas hücre işaretçisi α düz kas aktin (αSMA) ile birlikte ikincil antikorlar (2,6) ile inkübe. Kendimiz test birincil antikorlar Malzemeler tabloiçinde listelenen. Birden çok birincil antikorlar farklı türlerden elde edilen aynı anda karışabilir.</li>
	<li>Arka ve ön cilt 150 µL birincil antikorlar çözüm içeren yeni iyi transfer. Nazik bir karıştırıcı 4 ° c üzerinde gecede karıştırma ile cilt kuluçkaya.</li>
	<li>Ertesi gün, arka ve ön cilt 24 iyi plaka yeni kuyu transfer veya birincil antikorlar içeren engelleme arabellek Aspire edin. 1 mL de %2 HIGS seyreltilmiş DS PBS içinde % 0,2 TX-100 yıkama arabellek ile seyreltilmiş PBS % 2 veya % 0,2 TX-100 yıkama arabellek ile ekleyin. Her oda sıcaklığında bir mikser nazik karıştırma ile 15dk yıkama tamponunun 3 değişiklikler ile deri yıkayın.</li>
	<li>İkincil antikor çözüm (Tablo reçetesi) hazırlayın. İkincil antikorlar engelleme arabellekte seyreltik (ya da %10 HIGS veya % 10 DS) ve 0,22 µm polivinilidin difluoride (PVDF) membran şırınga filtre ikincil antikorlar içeren engelleme arabellek bağlı 1 mL şırınga için filtre. Not: Alexa 488 veya 633 Birleşik keçi Anti-tavşan IgG (H + L) veya Tuj1, Alexa 647 Birleşik keçi Anti-hamster IgG (H + L) PECAM-1, Alexa 488 Birleşik keçi Anti-tavşan IgG (H + L) MBP için için için Igg2a fare ve sıçan IgG (H + L) CD11b için Alexa 594 Birleşik kullanılmıştır 8 µg/mL son konsantrasyonu, 1:250 seyreltme ile. Deriyi Cy3 Birleşik αSMA antikor (2-3 µg/mL son konsantrasyonu, 1:500 seyreltme) ikincil Bu antikorlar ile birlikte ile inkübe.</li>
	<li>Belgili tanımlık eriyik vasıl 13.000 x g engelleme arabelleğinden ikincil antikorların toplanan parçacıklar kaldırmak 10 dakika santrifüj kapasitesi. Not: aynı anda farklı floresan konjuge ikincil antikorlar farklı türlerden elde edilen karışık olabilir.</li>
	<li>Arka ve ön cilt de 150 µL ikincil antikorlar çözüm içeren için transfer. 24 iyi plaka ışık önlemek ve cilt için 1s ile bir mikser, oda sıcaklığında hafif karıştırma kuluçkaya alüminyum folyo şal.</li>
	<li>Arka ve ön cilt 24 iyi plaka yeni kuyu transfer veya ikincil antikor çözüm damlalıklı tarafından tamamen Aspire edin. 1 mL % 2 HIGS çamaşır arabellek veya % 2 DS çamaşır arabellek ekleyin.</li>
	<li>Alüminyum folyo içinde 24 iyi plaka sarın ve her oda sıcaklığında bir mikser nazik karıştırma ile 15dk yıkama arabellek 3 değişiklikler ile yıkayın.</li>
</ol>3. montaj kulak cilt slayt üzerinde
<ol><li>Deri bir 35 x 10 mm2 Petri kabına dibinde yerleştirin. Dikkatli bir şekilde kıllar, yağ dokuları, bağ dokusu, toz ve elyaf geniş fotoğraf beyazlatma en aza indirmek için düşük aydınlatma ile stereomicroscope altında ince kavisli forseps kullanarak deri içinden çıkarın. PBS ile ıslak cilt tutmak.</li>
	<li>Cilt forseps kullanarak bir yapıştırıcı mikroskop slayt aktarın. Arka ve ön deri iç ile yer slayt üzerinde karşı karşıya. Deri forseps kullanarak düzleştirin.</li>
	<li>Photobleaching önlemek ve floresan sinyallerini korumak için sıvı Anti-fade montaj orta deride bağlayın. Hiçbir hava kabarcıklarının deri çevresinde veya üzerinde olduğundan emin olun.</li>
	<li>Coverslip deri örnekleri üzerinde dikkatle kapak ve bağlı cilt örnek slaytlar karanlık gecede montaj medya sağlam olsun izin vermek için oda sıcaklığında saklayın. Oje içeren coverslip mühür ve uzun süreli depolama için 4 ° C'de saklayın.</li>
</ol>4. confocal mikroskobu
<ol><li>Fluorophores için uygun lazerler ayarlayın. Confocal mikroskop üç lazer kaynakları (Argon 488 nm, DPSS 561 nm ve Helene 633 nm) ile bu deneyde kullanılır.</li>
	<li>Aynı anda önlemek ve herhangi bir çakışma azaltmak için üç kez lekeli örnekleri heyecanlandıran sıralı tarama aracını kullanın. Not: Sıralı bir şekilde sıralı tarama modunu kullanarak görüntüleri alınacaktır.</li>
	<li>10 X amaç altında görüntü. Bütün kulak cilt yakalamak için döşeme tarama aracını kullanın. Z-yığın ayarla ve z-pozisyon kulak cilt tüm kalınlığı kapsadığından emin olun.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin.">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li><li>Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+confocal+microscopy+for+vascular+branching+morphogenesis.">Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).</li><li>Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunohistochemical+analysis+for+embryonic+limb+skin+vasculature:+a+model+system+to+study+vascular+branching+morphogenesis+in+embryo.">Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Myeloid+Progenitors+Differentiate+into+Pericytes+through+TGF-beta+Signaling+in+Developing+Skin+Vasculature.">Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature.</a> Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).</li><li>Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel-dependent+recruitment+of+sympathetic+axons:+looking+for+innervation+in+all+the+right+places.">Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places.</a> J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve-derived+CXCL12+and+VEGF-A+regulate+the+patterning+of+arterial+vessel+branching+in+developing+limb+skin.">Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin.</a> Dev Cell. 24, 359-371 (2013).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. , e51749 (2014).</li><li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+Whole+Mount:+A+Novel+Processing+and+Imaging+Protocol+for+Thick,+Three-dimensional+Tissue+Cross-sections+of+Skin.">Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Liakath-Ali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+skin+phenotypes+revealed+by+a+genome-wide+mouse+reverse+genetic+screen.">Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen.</a> Nat Commun. 5, 3540 (2014).</li><li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin.">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery.">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).</li><li>Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atopic+dermatitis.">Animal models of atopic dermatitis.</a> J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).</li><li>Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoriasis:+what+we+have+learned+from+mouse+models.">Psoriasis: what we have learned from mouse models.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).</li><li>Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+challenges+of+chronic+wounds:+searching+for+an+optimal+animal+model+to+recapitulate+their+complexity.">Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity.</a> Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).</li><li>O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+diabetic+neuropathy.">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> ILAR J. 54, 259-272 (2014).</li><li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+Adult+Ear+Skin+Imaging+Reveals+Defective+Neuro-Vascular++Branching+Morphogenesis+in+Obese+and+Type+2+Diabetic+Mouse+Models.">Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models.</a> Sci Rep. 8, (2018).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı nöro-vasküler yapılar ve bağışıklık hücre dağıtım analizi için yetişkin kulak derinin bütün-mount immunonohistochemical görüntüleme açıklar. İnanıyoruz Bu yöntem dallanma morfogenez ve periferik sinirler ve kan damarları desenlendirme, hem de bağışıklık hücreleri ve saç gibi cilt bileşenlerinin üç boyutlu dağıtım çalışmaya araştırmacılar için çok sayıda deneysel avantajları folikülleri. Görüntüleme sonuçlarını görüntüleme yazılımları kullan...

Cilt üç katmandan oluşur: epidermis, dermis ve hypodermis. Bu kök hücre bakım, farklılaşma ve morfogenetik geliştirme gibi yeniden oluşturma işlemi, tumorigenesis ve inflamasyon yetişkin eğitim için bir model sistem olarak kullanılmıştır. Cilt zengin skarların ve periferik sinir sistemi ve damar sistemi gelişimi iyi koordine öyle ki innervated.
Biz daha önce olduğu gibi periferik sinirler ve kan damarları onların hücresel bileşenleri1,2,3, de dahil olmak üzere eğitim için birden çok etiket yapma ile bir bütün-mount embriyonik cilt görüntüleme tekniği göstermiştir 4: duyusal aksonlar, sempatik aksonlar, Schwann sinir hücrelerinde, endotel hücreleri, perisitlerden ve kan damarlarının damar düz kas hücrelerinde (VSMCs). Angiogenez sırasında birincil kapiller ağ yoğun vasküler remodeling uğrar ve hiyerarşik bir vasküler dallanma ağına geliştirir. Gelişmekte olan DermIS/hypodermis, arterler çevresel duyusal sinirler ve damarlar ile birlikte şube ardından arterler için bitişik form. Hiyerarşik damar ağı iyice VSMCs ile kapalı sonra sempatik sinirler boyunca genişletmek ve geniş çaplı kan damarları1,5,6innervate. Gelişmekte olan sinir ve damar sistemleri arasındaki yakın ilişki içinde önemini rağmen yetişkin çeşitli patolojik durumlarda nöro-vasküler ağlarda ne yönelik olarak önemli bir soru oldu. Üç boyutlu bir yüksek çözünürlüklü görüntü Patogenez, anatomik olarak tanınabilir dallanma morfogenez ve desenlendirme ile birlikte takdir etmek gereklidir.
Nöronal ve vasküler morfogenez yetişkin fare deride yaygın doku bölümü boyama tarafından analiz edilir. Diğer çalışmalar bütün Dağı görüntüleme deri periferik sinirler ve kan damarları, ek olarak saç folikülleri, yağ bezleri ve arrector pili kas7,8,9görselleştirmek için kullandık. Ancak, Yetişkin cilt kalınlığı deri tüm derinliği üzerinde analiz etmek zor yaptı.
Bu da çalışmanın, biz bu zorlukları aşmak için yetişkin kulak deri bir roman yüksek çözünürlüklü bütün Dağı görüntüleme geliştirdik. Kulak cilt üzerinde tüm derinliği diseksiyon ve sonraki bütün Dağı görüntüleme cilt için kolayca erişilebilir. Böylece, bu üç boyutlu mimari cilt kapsamlı miktar ölçümleri ile periferik sinir ve damar sistemlerinin karşılaştırmak için uygulanan bir basit ve son derece tekrarlanabilir yolu. Büyük çaplı kan damarları ile çevresel duyusal ve sempatik sinirler hizalamasını yetişkin cilt korunur gösterdi. Bu protokol dallanma morfogenez ve periferik sinirler ve kan damarları, aynı zamanda iltihabı gibi değişik koşullarda yetişkin fare modellerinde hücresel düzeyde bağışıklık hücre dağıtım desenlendirme görselleştirmek için hedeftir ve rejenerasyon.

<table><tbody><tr><td>10 x Phosphate Buffered Saline</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3210</td><td>PBS, without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>HBSS, with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>PFA, fixative, diluted in PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td>Component of blocking/washing buffer</td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson Immuno research</td><td>017-000-121</td><td>Component of blocking/washing buffer</td></tr><tr><td>Curved fine tweezers</td><td>Dumont</td><td>RS-5047</td><td></td></tr><tr><td>Curved tweezers</td><td>Integra Miltex Vantage</td><td>V918-782, V918-784</td><td></td></tr><tr><td>Filter Unit 0.45 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>157-0045</td><td>For filtration</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Coviden</td><td>8881501400</td><td>For filtration</td></tr><tr><td>Syringe filter Unit 0.22 mm</td><td>Millex-GV</td><td>SLGVR04NL</td><td>For filtration</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36934</td><td>Anti-fade mounting medium</td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td>For sealing</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>Graphics editor software</td></tr><tr><td>Illustrator CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>Graphics editor software</td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>Image processing software</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31) antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB1398Z</td><td>Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31) antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553369</td><td>Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#945;SMA antibody conjugated with cy-3</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-EphB1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9319</td><td>Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-neuron-specific Class III &amp;#946;-tubulin (Tuj1)</td><td>Abcam</td><td>AB18207</td><td>Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Tuj1 antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-MBP antibody</td><td>Abcam</td><td>AB40390</td><td>Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200</td></tr><tr><td>Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody</td><td>Chemicon</td><td>AB152</td><td>Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Peripherin antibody</td><td>Chemicon</td><td>AB1530</td><td>Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-CD11b antibody</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA74G</td><td>Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50</td></tr><tr><td>Anti-CD45 antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0451-85</td><td>Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-CD3 antibody</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1477T</td><td>Rat IgG1, immune cell marker, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD45R (B220) antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0452</td><td>Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200</td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11122</td><td>Rabbit polyclonal, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab13970</td><td>Chicken polyclonal, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#946;-gal antibody</td><td>Cappel</td><td>55976</td><td>Rabbit polyclonal, 1:5000</td></tr><tr><td>Anti-RFP antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td>Rabbit polyclonal, 1:300</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647</td><td>Jackson Immuno research</td><td>127-605-160</td><td>Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594</td><td>Jackson Immuno research</td><td>112-585-167</td><td>Rat polyclonal secondary antibody, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21136</td><td>Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250</td></tr></tbody></table>

whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution

Burada, kapsamlı üç boyutlu nöro-vasküler dallanma morfogenez ve desenlendirme yanı sıra bağışıklık hücre dağıtım hücresel düzeyde eğitim için teknik görüntüleme bir bütün-mount yetişkin kulak deri bir iletişim kuralı mevcut. Periferik sinir ve damar anatomik yapıları yetişkin dokularda analizini bazı anlayışlar fonksiyonel nöro-vasküler kablolama ve patolojik durumlarda yara iyileşmesi gibi nöro-vasküler dejenerasyon anlayışı sunuyor. Son derece bilgilendirici modeli sistemi çalışmalarımız diseksiyon için kolay erişilebilir yetişkin kulak cilt üzerinde odaklanmıştır. Bizim basit ve tekrarlanabilir Protokolü (duyusal aksonlar, sempatik akson ve Schwann hücreleri) periferik sinirler, kan damarları (endotel hücreleri ve vasküler düz kas hücreleri gibi tüm cilt hücresel bileşenlerindeki doğru bir tasviri sağlar ) ve inflamatuar hücre. Bizce bu protokolü periferik sinirler ve kan damarları morfolojik anormallikleri yanı sıra farklı patolojik şartlar altında yetişkin kulak deride enflamasyon araştırmak için önünü açacak.

Yetişkin fare arka kulak cilt (şekil 1A) ve ön kulak cilt (şekil 1B) olduğunu αSMA (kırmızı), Tuj1 (yeşil), antikorlar ile immunostained ve PECAM-1 (mavi). Posterior cilt immunostained nöro-bağışıklık dağıtım CD11b (kırmızı) ve MBP (yeşil), Tuj1 (mavi) ile birlikte (şekil 2A) antikorları kullanarak çalışma yapıldı. CD11b dağılımı+ inflamatuar hücreler, ma...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution at JoVE.com

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Burada, dallanma morfogenez ve periferik sinirler ve kan damarları yanı sıra bağışıklık hücre dağıtım desenlendirme görselleştirmek sağlayan tüm yetişkin fare kulak deride bir yüksek çözünürlüklü bütün Dağı görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır.

Bütün-Confocal mikroskobu yetişkin kulak cilt için mount: nöro-vasküler dallanma morfogenez ve bağışıklık hücre dağıtım modeli sistemi

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

whole-mount-confocal-microscopy-for-adult-ear-skin-model-system-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.1K Görüntüleme.  National Institutes of Health. Burada, dallanma morfogenez ve periferik sinirler ve kan damarları yanı sıra bağışıklık hücre dağıtım desenlendirme görselleştirmek sağlayan tüm yetişkin fare kulak deride bir yüksek çözünürlüklü bütün Dağı görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır.

Video: Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

Fare Cilt ve Saç Folikül Desenlendirme ve Duyusal Akson Morfoloji Analizi Uygulanması Düz ​​Görüntüleme Dağı

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Nörobilim

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Tüm Dağı Diseksiyon ve Yetişkin Fare Kohlea immünofloresan

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Biyoloji

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Saç Folikül hançer Endings Yaşam Sinir Terminal Etiketleme Optik İzleme<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Fare Kulak Cilt

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

Fare İç Kulak Dokusunun Kriyoseksiyon ve İmmün Boyama: Embriyonik Aşamalardan Yetişkin Aşamalarına

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Gelişim Biyolojisi

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

This protocol describes the induction of an ischemia-reperfusion (IR) model on mouse ear skin using magnet clamping. Using a custom-built intravital imaging model, we study in vivo inflammatory responses post-reperfusion. The rationale behind the development of this technique is to extend the understanding of how leukocytes respond to skin IR injury.

Bağışıklık Yanıtları intravital multiphoton Görüntüleme Fare Kulak Skin uyaran İskemi-reperfüzyon yaralanması

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Tıp

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

Faredeki Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümün Tam Montajlı İmmünofloresan Boyama, Konfokal Görüntüleme ve 3D Rekonstrüksiyonu

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Tek Çekirdekli Dizileme veya İmmün Boyama için Stria Vascularis Mikrodiseksiyonu

Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell mechanotransduction and ultimately hearing. Pathologies of the stria vascularis can result in a decreased hearing. Dissection of the adult stria vascularis allows for focused single-nucleus capture and subsequent single-nucleus sequencing and immunostaining. These techniques are used to study stria vascularis pathophysiology at the single-cell level. 
Single-nucleus sequencing can be used in the setting of transcriptional analysis of the stria vascularis. Meanwhile, immunostaining continues to be useful in identifying specific populations of cells. Both methods require proper stria vascularis dissection as a prerequisite, which can prove to be technically challenging.

Yazar Spot Işığı: Tek Çekirdekli Dizileme veya İmmün Boyama için Yetişkin Fare Stria Vascularis'in Diseksiyonu  

The stria vascularis is vital to the generation of endocochlear potential. Here, we present the dissection of the adult mouse stria vascularis for single-nucleus sequencing or immunostaining.

Bütün-Confocal mikroskobu yetişkin kulak cilt için mount: nöro-vasküler dallanma morfogenez ve bağışıklık hücre dağıtım modeli sistemi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

PLAYLIST