Nous remercions la direction du laboratoire de K. Gill et appui technique, J. Hawkins et le personnel du National Institutes of Health (NIH) construction animalerie 50 pour l’aide avec soin de la souris et R. Reed et F. bartherline pour l’assistance administrative. Merci aussi à Motegi S. et M. Uwimana pour le partage de leur protocole de dissection du peau oreille, N. Burns pour aide rédactionnelle et les membres de la laboratoire de cellules souches et biologie Neuro-vasculaire de l’aide technique et une discussion réfléchie. T. Yamazaki a été appuyée par la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS) NIH-KAITOKU. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros du National Heart, Lung, and Blood Institute (HL005702-11 à Y.M.)

Toutes les expériences dans cette section ont été effectuées en vertu de l’approbation de la National Heart, Lung et Blood Institute (NHLBI) et animalier Comité d’urbanisme.
1. adult Mouse Ear peau Collection
<ol><li>Euthanasier des souris adultes par l’exposition de dioxyde de carbone (CO2) dans une chambre fermée, puis vérifiez l’euthanasie par dislocation cervicale. Remarque : L’expérience fait suite à la recommandation de la National Institutes of Health (NIH) pour la méthode d’euthanasie.</li>
	<li>Disséquer l’oreille de la base et le placer dans un 35 x 10 mm2 boîte de Pétri contenant 2 mL de Hank Balanced Salt Solution (HBSS). Brièvement couper les poils avec des ciseaux.</li>
	<li>Peler la peau postérieure et antérieure peau loin soigneusement de cartilage intermédiaire. Remarque : Le Cartilage s’attache à la peau antérieure.</li>
	<li>Transférer la partie postérieure et antérieure peau séparément à un 24 puits plaque contenant 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % frais glacé (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) par puits. Aplatir la peau postérieure et antérieure sous les 4 % PFA.</li>
	<li>Fixer la peau postérieure et antérieure avec cartilage à 4 ° C pendant 1 h.</li>
	<li>Laver la peau postérieure et antérieure 3 fois pendant 5 min dans 1 mL de PBS avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.</li>
	<li>Transférer la peau postérieure et antérieure avec cartilage au fond d’un 35 x 10 mm2 boîte de Pétri. Couper la base région, qui est pliée et a des tissus adipeux et les tissus conjonctifs. Décollez le cartilage de peau antérieur avec une pincette courbée fine.</li>
	<li>Retirez soigneusement les poils, les tissus adipeux et les tissus conjonctifs de l’intérieur de la peau postérieure à l’aide de la pincette courbée fine. Garder la peau humide avec du PBS.</li>
</ol>2. entier-Montez Immunohistochemical souillant de peau d’oreille de souris
Remarque : Toutes les expériences dans les sections suivantes ont été effectuées selon les directives de sécurité de laboratoire de NIH.
<ol><li>Préparer le tampon de blocage. Sérum de chèvre filtre chaleur 10 % inactivé (HIGS) dilué dans du PBS avec 0,2 % triton de tampon de blocage de X-100 (TX-100), ou 10 % de sérum d’âne (DS) dilué dans du PBS avec 0,2 % de tampon de blocage TX-100, à l’aide d’un filtre de 0,45 µm.</li>
	<li>Transférer la partie postérieure et antérieure peau à un 24 plaque bien contenant 1 mL de tampon de blocage de HIGS 10 % ou 10 % tampon de blocage DS / puits. Incuber la peau pendant 30 min avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.</li>
	<li>Préparer la solution d’anticorps primaire en diluant l’anticorps primaires (Table des matières) dans un tampon bloquant (soit 10 %, soit 10 % HIGS DS). NOTE : Ensemble-mout immunohistochemical analyse de peau d’oreille d’adulte avec des anticorps de classe de neurone-spécifique de marqueurs pan-neuronale III β-tubuline (Tuj1, IgG ou souris lapin polyclonal monocloncal IgG2a, dilution de 1/500 à la concentration finale de 2 µg/mL), molécule d’adhésion cellulaire endothéliale Pan-endothélial marqueur plaquettes 1 (PECAM-1, hamster monoclonale IgG, dilution de 1 : 300 à la concentration finale de 3,3 µg/mL), la protéine basique de la myéline de marqueur de gaine de myéline (MBP, lapin IgG polyclonaux, dilution de 1 : 200 à la concentration finale de 5 µg/mL) et un marqueur inflammatoire cellulaire myéloïde CD11b (Rat monoclonal IgG2b, 01:50 dilution à une concentration finale de 20 µg/mL) a été montré dans la Figure 1 et Figure 2. La peau a été incubée avec l’anticorps conjugué Cy3 pour le muscle lisse vasculaire marqueur α muscle lisse actine cellulaire (αSMA) ainsi que des anticorps secondaires (2.6). Les anticorps primaires testées par nous-mêmes ne figuraient dans la Table des matières. Les anticorps primaires multiples provenant de différentes espèces peuvent être mélangées en même temps.</li>
	<li>Transférer la peau postérieure et antérieure à nouveau puits contenant 150 µL de la solution d’anticorps primaires. Incuber la peau avec un mélange doux sur une table de mixage à 4 ° C durant la nuit.</li>
	<li>Le lendemain, la peau de la partie postérieure et antérieure de transfert de nouveaux puits dans la plaque 24 puits ou aspirer le tampon de blocage contenant des anticorps primaires. Ajouter 1 mL de soit 2 % HIGS dilué dans du PBS avec du tampon de lavage pour le TX-100 0,2 % ou 2 % DS dilué dans du PBS avec du tampon de lavage pour le TX-100 0,2 %. Laver la peau avec 3 changements de la mémoire tampon de lavage toutes les 15 min avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.</li>
	<li>Préparer la solution d’anticorps secondaire (Table des matières). Diluer l’anticorps secondaires dans le tampon de blocage (soit 10 % HIGS ou 10 % DS) et filtre le tampon de blocage contenant des anticorps secondaires à travers un filtre de seringue en membrane 0,22 µm polyvinylidène difluoride (PVDF) relié à une seringue de 1 mL. NOTE : Alexa 488 ou chèvre 633-conjugués du anti-lapin IgG (H + L) ou IgG2a de souris pour Tuj1, anti-hamster de chèvre Alexa 647 Conjugué IgG (H + L) pour chèvre PECAM-1, conjugué Alexa 488 du anti-lapin IgG (H + L) pour MBP, et rat Alexa 594 Conjugué IgG (H + L) pour CD11b servaient avec la dilution de 1/250 à la concentration finale de 8 µg/mL. La peau est incubée avec un anticorps conjugué Cy3 αSMA (dilution 1/500 à la concentration finale de 2 à 3 µg/mL) en combinaison avec ces anticorps secondaires.</li>
	<li>Centrifuger la solution à 13 000 x g pendant 10 min enlever les particules agrégées de l’anticorps secondaires de la mémoire tampon de blocage. Remarque : Les types d’anticorps secondaires conjugués fluorescents provenant de différentes espèces peuvent être mélangées en même temps.</li>
	<li>Transférer la peau postérieure et antérieure à cupule contenant 150 µL de la solution d’anticorps secondaires. Enrouler la plaque 24 puits dans du papier aluminium pour éviter la lumière et incuber la peau pendant 1 h avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.</li>
	<li>Transférez la peau postérieure et antérieure aux nouveaux puits de la plaque 24 puits ou aspirer la solution d’anticorps secondaire en pipette complètement. Ajouter 1 mL de tampon de lavage HIGS 2 % ou 2 % tampon de lavage DS.</li>
	<li>Enrouler la plaque 24 puits dans du papier aluminium et laver avec 3 changements de la mémoire tampon de lavage toutes les 15 min avec un mélange doux sur une table de mixage à température ambiante.</li>
</ol>3. montage de la peau de l’oreille de la diapositive
<ol><li>Placez la peau sur le fond d’un 35 x 10 mm2 boîte de Pétri. Retirez soigneusement les poils, les tissus adipeux, les tissus conjonctifs, poussières et les fibres à l’intérieur de la peau à l’aide de fine pince courbée sous stéréomicroscope avec faible éclairage afin de minimiser la grande photo de blanchiment. Garder la peau humide avec du PBS.</li>
	<li>Transférer la peau à une lame de microscope adhésif avec une pincette. Placez la peau postérieure et antérieure avec l’intérieur vers le haut sur la diapositive. Aplatir la peau à l’aide de pinces.</li>
	<li>Montez la peau dans un milieu liquide anti-fondu montage pour éviter le photoblanchiment et préserver les signaux fluorescents. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est sur ou autour de la peau.</li>
	<li>Couvrir avec une lamelle couvre-objet sur les échantillons de peau soigneusement et entreposer les diapositives échantillon de peau monté dans la nuit sombre à température ambiante pour permettre que le support de montage se ferme. Sceller la lamelle couvre-objet de la diapositive avec vernis à ongles et conserver à 4 ° C pour le stockage à long terme.</li>
</ol>4. confocal Microscopy
<ol><li>Mettre en place des lasers pour fluorophores. Un microscope confocal avec trois sources laser (Argon 488 nm, DPSS 561 nm et HeNe 633 nm) est utilisé dans cette expérience.</li>
	<li>Utilisez l’outil de balayage séquentiel, qui excite en même temps les échantillons colorés à triple, pour éviter et réduire les chevauchements. NOTE : Images seront prises de manière séquentielle, en utilisant le mode de balayage séquentiel.</li>
	<li>Image sous un objectif 10 X. Utilisez l’outil d’analyse de tuile pour capturer la peau toute oreille. La valeur de Z-pile et s’assurer que la position z couvre toute l’épaisseur de la peau de l’oreille.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin.">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li><li>Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+confocal+microscopy+for+vascular+branching+morphogenesis.">Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).</li><li>Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunohistochemical+analysis+for+embryonic+limb+skin+vasculature:+a+model+system+to+study+vascular+branching+morphogenesis+in+embryo.">Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Myeloid+Progenitors+Differentiate+into+Pericytes+through+TGF-beta+Signaling+in+Developing+Skin+Vasculature.">Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature.</a> Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).</li><li>Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel-dependent+recruitment+of+sympathetic+axons:+looking+for+innervation+in+all+the+right+places.">Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places.</a> J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve-derived+CXCL12+and+VEGF-A+regulate+the+patterning+of+arterial+vessel+branching+in+developing+limb+skin.">Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin.</a> Dev Cell. 24, 359-371 (2013).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. , e51749 (2014).</li><li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+Whole+Mount:+A+Novel+Processing+and+Imaging+Protocol+for+Thick,+Three-dimensional+Tissue+Cross-sections+of+Skin.">Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Liakath-Ali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+skin+phenotypes+revealed+by+a+genome-wide+mouse+reverse+genetic+screen.">Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen.</a> Nat Commun. 5, 3540 (2014).</li><li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin.">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery.">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).</li><li>Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atopic+dermatitis.">Animal models of atopic dermatitis.</a> J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).</li><li>Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoriasis:+what+we+have+learned+from+mouse+models.">Psoriasis: what we have learned from mouse models.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).</li><li>Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+challenges+of+chronic+wounds:+searching+for+an+optimal+animal+model+to+recapitulate+their+complexity.">Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity.</a> Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).</li><li>O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+diabetic+neuropathy.">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> ILAR J. 54, 259-272 (2014).</li><li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+Adult+Ear+Skin+Imaging+Reveals+Defective+Neuro-Vascular++Branching+Morphogenesis+in+Obese+and+Type+2+Diabetic+Mouse+Models.">Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models.</a> Sci Rep. 8, (2018).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit l’imagerie immunonohistochemical entiers de peau d’oreille d’adulte pour l’analyse des structures neuro-vasculaires et de la distribution de cellules immunitaires. Nous croyons que cette méthode a de nombreux avantages expérimentales aux chercheurs d’étudier la ramification de la morphogénèse et la structuration des nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que la répartition en trois dimensions des composants de peau y compris les cheveux et les cellules immunitaires fol...

La peau se compose de trois couches : épiderme, derme et hypoderme. Il a servi comme modèle pour étudier les cellules souches entretien, différenciation et morphogenèse en développement ainsi que la régénération, tumorigenèse et l’inflammation chez les adultes. La peau est richement vascularisée et innervée tels que le développement du système nerveux périphérique et du système vasculaire est bien coordonné.
Nous avons déjà démontré une technique d’imagerie entier-Montez la peau embryonnaire avec étiquetage multiples pour l’étude des nerfs périphériques intacts et les vaisseaux sanguins, y compris leurs composants cellulaires1,2,3, 4: axones sensoriels, axones sympathiques, Schwann dans les nerfs, les cellules, les cellules endothéliales, péricytes et cellules de muscle lisse vasculaire (CMLV) dans les vaisseaux sanguins. Au cours de l’angiogenèse, un premier réseau capillaire subit un remodelage vasculaire intense et se développe en un réseau de ramification vasculaire hiérarchique. Dans le derme en développement/hypoderme, artères branche aux côtés des veines et des nerfs sensoriels périphériques puis forment adjacentes aux artères. Une fois le réseau vasculaire hiérarchique est complètement recouvert de CMLV, nerfs sympathiques s’étendent le long et innervent le grand diamètre des vaisseaux sanguins1,5,6. Malgré l’importance de l’association étroite entre les développement des systèmes nerveux et vasculaires, une question importante a consisté à aborder ce qui se passe aux réseaux neuro-vasculaires dans diverses situations pathologiques chez l’adulte. Une imagerie de haute résolution en trois dimensions est nécessaire pour apprécier la pathogenèse, ainsi que de la morphogenèse ramification reconnaissable anatomiquement et structuration.
Morphogenèse neuronale et vasculaire dans la peau de souris adulte est couramment analysée par la coloration de la section de tissu. D’autres études ont utilisé entier-Montez l’imagerie de la peau pour visualiser les nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, en plus les follicules pileux, glandes sébacées et arrecteur pili muscles7,8,9. Cependant, l’épaisseur de la peau adulte a rendu difficile analyser la peau dans son ensemble de la profondeur.
Dans la présente étude, nous avons développé une nouvelle imagerie haute résolution d’entier-montent de peau d’oreille d’adulte pour surmonter ces difficultés. Peau de l’oreille est facilement accessible pour la dissection et l’imagerie entier-Montez subséquent de la peau sur l’ensemble de la profondeur. Ainsi, c’est une méthode simple et hautement reproductible qui peut être appliquée pour comparer l’architecture tridimensionnelle des systèmes nerveux et vasculaires périphériques dans la peau, avec des mesures de quantification globale. Nous avons démontré que l’alignement des nerfs sensitifs et sympathiques périphériques avec grand diamètre des vaisseaux sanguins est préservée dans la peau de l’adulte. Le but du présent protocole est de visualiser la ramification de la morphogénèse et la structuration des nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que la distribution des cellules immunitaires au niveau cellulaire dans les modèles de souris adulte dans diverses conditions telles que l’inflammation et régénération.

<table><tbody><tr><td>10 x Phosphate Buffered Saline</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3210</td><td>PBS, without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>HBSS, with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>PFA, fixative, diluted in PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td>Component of blocking/washing buffer</td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson Immuno research</td><td>017-000-121</td><td>Component of blocking/washing buffer</td></tr><tr><td>Curved fine tweezers</td><td>Dumont</td><td>RS-5047</td><td></td></tr><tr><td>Curved tweezers</td><td>Integra Miltex Vantage</td><td>V918-782, V918-784</td><td></td></tr><tr><td>Filter Unit 0.45 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>157-0045</td><td>For filtration</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Coviden</td><td>8881501400</td><td>For filtration</td></tr><tr><td>Syringe filter Unit 0.22 mm</td><td>Millex-GV</td><td>SLGVR04NL</td><td>For filtration</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36934</td><td>Anti-fade mounting medium</td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td>For sealing</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>Graphics editor software</td></tr><tr><td>Illustrator CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>Graphics editor software</td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>Image processing software</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31) antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB1398Z</td><td>Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31) antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553369</td><td>Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#945;SMA antibody conjugated with cy-3</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-EphB1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9319</td><td>Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-neuron-specific Class III &amp;#946;-tubulin (Tuj1)</td><td>Abcam</td><td>AB18207</td><td>Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Tuj1 antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-MBP antibody</td><td>Abcam</td><td>AB40390</td><td>Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200</td></tr><tr><td>Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody</td><td>Chemicon</td><td>AB152</td><td>Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Peripherin antibody</td><td>Chemicon</td><td>AB1530</td><td>Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-CD11b antibody</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA74G</td><td>Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50</td></tr><tr><td>Anti-CD45 antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0451-85</td><td>Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-CD3 antibody</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1477T</td><td>Rat IgG1, immune cell marker, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD45R (B220) antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0452</td><td>Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200</td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11122</td><td>Rabbit polyclonal, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab13970</td><td>Chicken polyclonal, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#946;-gal antibody</td><td>Cappel</td><td>55976</td><td>Rabbit polyclonal, 1:5000</td></tr><tr><td>Anti-RFP antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td>Rabbit polyclonal, 1:300</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647</td><td>Jackson Immuno research</td><td>127-605-160</td><td>Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594</td><td>Jackson Immuno research</td><td>112-585-167</td><td>Rat polyclonal secondary antibody, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21136</td><td>Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250</td></tr></tbody></table>

whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution

Nous présentons ici un protocole d’une peau d’oreille d’adulte entier-montent d’imagerie technique pour étudier la morphogenèse de ramification neuro-vasculaire tridimensionnelle complète et structuration, ainsi que distribution de cellules immunitaires au niveau cellulaire. L’analyse des structures anatomiques nerveuses et des vaisseaux sanguins périphériques dans les tissus adultes fournit un aperçu de la compréhension du câblage neuro-vasculaire fonctionnelle et la dégénérescence neuro-vasculaires dans certaines pathologies telles que la cicatrisation des plaies. Comme système modèle hautement instructif, nous avons concentré nos études sur peau d’oreille d’adulte, qui est facilement accessible pour la dissection. Notre protocole simple et reproductible fournit une description précise des composants cellulaires de la peau entière, tels que les nerfs périphériques (axones sensoriels, axones sympathiques et les cellules de Schwann), des vaisseaux sanguins (cellules endothéliales et les cellules musculaires lisses vasculaires ) et des cellules inflammatoires. Nous croyons que ce protocole préparera le terrain pour enquêter sur des anomalies morphologiques dans les nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que l’inflammation dans la peau de l’oreille d’adulte dans des conditions pathologiques différentes.

Souris adulte oreille postérieure (Figure 1 a) et peaux oreille antérieure (Figure 1 b) ont été immunomarquées avec anticorps anti-αSMA (rouge), Tuj1 (vert) et PECAM-1 (bleu). Peau postérieure a été immunomarquées pour étudier la distribution de neuro-immunitaire à l’aide d’anticorps anti-CD11b (rouge) et MBP (vert), ainsi que Tuj1 (bleu) (Figure 2 a). Distribution de CD11b+</sup...

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Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Nous décrivons ici une méthode d’imagerie de haute résolution entier-montent dans la peau d’oreille de souris adulte entier, qui nous permet de visualiser la ramification de la morphogenèse et structuration des nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que distribution de cellules immunitaires.

Entier-Montez la microscopie confocale pour la peau de l’oreille d’adulte : un système modèle pour étudier la morphogenèse ramification Neuro-vasculaire et la Distribution de cellules immunitaires

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

whole-mount-confocal-microscopy-for-adult-ear-skin-model-system-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.1K vues.  National Institutes of Health. Nous décrivons ici une méthode d’imagerie de haute résolution entier-montent dans la peau d’oreille de souris adulte entier, qui nous permet de visualiser la ramification de la morphogenèse et structuration des nerfs périphériques et les vaisseaux sanguins, ainsi que distribution de cellules immunitaires.

Vidéo: Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

Appartement Mont imagerie de la peau de souris et son application à l&#39;analyse des follicules pileux Modélisation et sensorielle Axon Morphologie

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Recherche

Neurosciences

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imagerie CD4 T Cellule interstitielle Migration dans les Derme Enflammé

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Immunologie et infection

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Whole-Mont analyse immunohistochimique à la vascularisation cutanée Limb embryonnaires: un modèle pour l&#39;étude vasculaire morphogenèse de branchement de l&#39;embryon

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Biologie

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Surveillance optique de Living Nerve Terminal Marquer follicule pileux lancéolées Endings du<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Souris oreille peau

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

Cryosectionnement et immunomarquage du tissu de l’oreille interne de souris : du stade embryonnaire au stade adulte

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Biologie du développement

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

This protocol describes the induction of an ischemia-reperfusion (IR) model on mouse ear skin using magnet clamping. Using a custom-built intravital imaging model, we study in vivo inflammatory responses post-reperfusion. The rationale behind the development of this technique is to extend the understanding of how leukocytes respond to skin IR injury.

Induire ischémie-reperfusion chez la souris Ear Skin pour Intravitale multiphotonique Imaging des réponses immunitaires

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Médecine

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

Coloration par immunofluorescence à monture entière, imagerie confocale et reconstruction 3D du nœud sino-auriculaire et auriculo-ventriculaire chez la souris

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Microdissection de stries vasculaires pour le séquençage d’un seul noyau ou l’immunocoloration

Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell mechanotransduction and ultimately hearing. Pathologies of the stria vascularis can result in a decreased hearing. Dissection of the adult stria vascularis allows for focused single-nucleus capture and subsequent single-nucleus sequencing and immunostaining. These techniques are used to study stria vascularis pathophysiology at the single-cell level. 
Single-nucleus sequencing can be used in the setting of transcriptional analysis of the stria vascularis. Meanwhile, immunostaining continues to be useful in identifying specific populations of cells. Both methods require proper stria vascularis dissection as a prerequisite, which can prove to be technically challenging.

Pleins feux sur l’auteur : Dissection de stria vascularis de souris adultes pour le séquençage d’un seul noyau ou l’immunomarquage  

The stria vascularis is vital to the generation of endocochlear potential. Here, we present the dissection of the adult mouse stria vascularis for single-nucleus sequencing or immunostaining.

Entier-Montez la microscopie confocale pour la peau de l’oreille d’adulte : un système modèle pour étudier la morphogenèse ramification Neuro-vasculaire et la Distribution de cellules immunitaires

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