Ringraziamo K. Gill per la gestione del laboratorio e supporto tecnico, J. Hawkins e il personale del National Institutes of Health (NIH) costruzione impianto 50 animali per l'assistenza con cura del mouse e R. Reed e F. Boi per l'assistenza amministrativa. Grazie anche a Motegi S. e M. Udey per loro orecchio pelle dissezione protocollo N. Burns per aiuto editoriale e membri del laboratorio di cellule staminali e biologia Neuro-vascolare per aiuto tecnico e riflessivo discussione di condivisione. T. Yamazaki è stata sostenuta dalla società Giappone per la promozione della scienza (JSPS) NIH-KAITOKU. Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale del cuore nazionale, polmone e sangue Institute (HL005702-11 al Y.M.)

Tutti gli esperimenti in questa sezione sono stati eseguiti sotto approvazione dal National Heart, Lung e Blood Institute (NHLBI) Animal Care e Comitato di uso.
1. adulto Mouse orecchio pelle collezione
<ol><li>Eutanasia di topi adulti tramite l'esposizione di anidride carbonica (CO2) in una camera chiusa e quindi confermare l'eutanasia di dislocazione cervicale. Nota: L'esperimento segue la Guida di riferimento di National Institutes of Health (NIH) per il metodo di eutanasia.</li>
	<li>Sezionare l'orecchio dalla base e metterlo in un 35 x 10 mm2 capsula di Petri contenente 2 mL di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS). Brevemente tagliare i capelli con le forbici.</li>
	<li>Sbucciare la pelle posteriore e anteriore pelle distanza attentamente dalla cartilagine intermedio. Nota: Cartilagine si attacca alla pelle anteriore.</li>
	<li>Trasferire la parte posteriore e anteriore della pelle separatamente a un 24 ben piastra contenente 1 mL di ghiacciata fresca 4% paraformaldeide (PFA) in tampone fosfato salino (PBS) per pozzetto. Appiattire la pelle anteriore e posteriore a 4% PFA.</li>
	<li>Fissare la pelle anteriore e posteriore con cartilagine a 4 ° C per 1 h.</li>
	<li>Lavare la pelle anteriore e posteriore 3 volte per 5 min in 1 mL di PBS con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire la pelle anteriore e posteriore con cartilagine alla parte inferiore di un 35 x 10 mm2 piastra di Petri. Tagliare la regione della base, che è piegato e ha adiposo e connettivo. Staccare la cartilagine dalla pelle anteriore utilizzando una pinzetta curva.</li>
	<li>Dall'interno della pelle posteriore con Pinzette curve bene, togliere i peli, tessuti adiposi e tessuti connettivi. Mantenere la pelle umida con PBS.</li>
</ol>2. la macchiatura di Immunohistochemical intero-monta della pelle dell'orecchio del topo
Nota: Tutti gli esperimenti nelle sezioni che seguono sono stati eseguiti in conformità con le direttive di sicurezza di laboratorio NIH.
<ol><li>Preparare il tampone di bloccaggio. Siero di capra filtro 10% calore inattivato (Villa) diluito in PBS con 0,2% triton tampone bloccante X-100 (TX-100), o 10% di siero di asino (DS) diluito in PBS con 0,2% tampone bloccante TX-100, utilizzando un filtro da 0,45 µm.</li>
	<li>Trasferire la parte posteriore e anteriore della pelle a un 24 ben piastra contenente 1 mL di tampone di bloccaggio Villa 10% o 10% tampone bloccante di DS per pozzetto. Incubare la pelle per 30 min con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare la soluzione di anticorpo primario diluendo gli anticorpi primari (Tabella materiali) in tampone bloccante (entrambi 10% Villa o 10% DS). Nota: Intero-mout l'analisi di immunohistochemical della pelle dell'orecchio dell'adulto con gli anticorpi di classe di neurone-specific marcatore pan-neuronale III β-tubulina (Tuj1, monocloncal mouse o IgG policlonale IgG2a coniglio, diluizione 1: 500 alla concentrazione finale di 2 µ g/mL), molecola di adesione Pan-endothelial delle cellule marcatore della piastrina delle cellule endoteliali 1 (PECAM-1, criceto monoclonale IgG, diluizione di 1: 300 alla concentrazione finale di 3,3 µ g/mL), proteina di base del fodero di myelin marcatore della mielina (MBP, coniglio IgG policlonale, diluizione 1: 200 al concentrazione finale di 5 µ g/mL) e indicatore infiammatorio delle cellule mieloidi CD11b (Rat monoclonali IgG2b, 01:50 diluizione alla concentrazione finale di 20 µ g/mL) è stata indicata nella Figura 1 e Figura 2. La pelle è stata incubata con l'anticorpo coniugato con Cy3 per actina di muscolo liscio α marcatore di muscolo liscio vascolare delle cellule (αSMA) insieme con gli anticorpi secondari (2,6). Gli anticorpi primari testati da noi stessi sono stati elencati nella Tabella materiali. Gli anticorpi primari multipli derivati da specie diverse possono essere mescolati contemporaneamente.</li>
	<li>Trasferire la pelle anteriore e posteriore al nuovo pozzo contenente 150 µ l della soluzione di anticorpi primari. Incubare la pelle con miscelazione delicata su un mixer a 4 ° C durante la notte.</li>
	<li>Il giorno seguente, trasferire la pelle anteriore e posteriore nuovi pozzi nella piastra di ben 24 o aspirare il tampone bloccante contenente anticorpi primari. Aggiungere 1 mL di o 2% Villa diluito in PBS con tampone di lavaggio di TX-100 0,2% o 2% DS diluito in PBS con tampone di lavaggio di 0,2% TX-100. Lavare la pelle con 3 cambi di tampone di lavaggio ogni 15min con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare la soluzione di anticorpo secondario (Tabella materiali). Diluire anticorpi secondari in tampone bloccante (entrambi 10% Villa o 10% DS) e filtro sul blocco buffer contenente anticorpi secondari attraverso una siringa filtro 0,22 µm polivinilidene difluoruro (PVDF) membrana collegato ad una siringa da 1 mL. Nota: Alexa 488 o anti-coniglio di capra 633-coniugato IgG (H + L) o mouse IgG2a per Tuj1, del anti-criceto capra Alexa 647-coniugato IgG (H + L) per il anti-coniglio di capra PECAM-1, Alexa 488-coniugato IgG (H + L) per MBP, e ratto Alexa 594-coniugato IgG (H + L) per CD11b sono stati utilizzati con diluizione di 1: 250 alla concentrazione finale di 8 µ g/mL. La pelle è stata incubata con l'anticorpo coniugato con Cy3 αSMA (diluizione 1: 500 alla concentrazione finale di 2-3 µ g/mL) in combinazione con questi anticorpi secondari.</li>
	<li>Centrifugare la soluzione a 13.000 x g per 10 min rimuovere le particelle aggregate degli anticorpi secondari da tampone bloccante. Nota: Possono essere miscelati simultaneamente diversi anticorpi secondari coniugati fluorescenti derivati da specie diverse.</li>
	<li>Trasferire la pelle anteriore e posteriore ben contenente 150 µ l della soluzione di anticorpi secondari. Avvolgere la piastra ben 24 in foglio di alluminio per evitare la luce e incubare la pelle per 1 h con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasferire la pelle anteriore e posteriore nuovi pozzi nella piastra di ben 24 oppure aspirare la soluzione di anticorpo secondario di dispensare completamente. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio di Villa 2% o 2% tampone di lavaggio DS.</li>
	<li>Avvolgere la piastra ben 24 in un foglio di alluminio e lavare con 3 cambi di tampone di lavaggio ogni 15min con miscelazione delicata su un mixer a temperatura ambiente.</li>
</ol>3. montaggio la pelle dell'orecchio sulla diapositiva
<ol><li>Posizionare la pelle sul fondo di un 35 x 10 mm2 piastra di Petri. Rimuovere con cura i peli, tessuti adiposi, tessuti connettivi, polveri e fibre dall'interno della pelle utilizzando una pinzetta curva sotto stereomicroscopio con scarsa illuminazione per ridurre al minimo fotografica ampia candeggio. Mantenere la pelle umida con PBS.</li>
	<li>Trasferire la pelle in un vetrino da microscopio adesivo usando il forcipe. Posizionare la pelle anteriore e posteriore con l'interno rivolto verso l'alto sulla diapositiva. Appiattire la pelle usando il forcipe.</li>
	<li>Montare la pelle in un mezzo liquido anti-dissolvenza montaggio per evitare il photobleaching e preservare i segnali fluorescenti. Assicurarsi che nessun bolle di aria sono su o intorno alla pelle.</li>
	<li>Coprire con vetrino coprioggetto sui campioni di pelle attentamente e memorizzare le diapositive di esempio pelle montato nel buia durante la notte a temperatura ambiente per consentire che il supporto di montaggio ottiene costante. Sigillare il coprioggetto alla diapositiva con smalto e conservare a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.</li>
</ol>4. microscopio confocale
<ol><li>Impostare il laser appropriato per fluorofori. Un microscopio confocale con tre sorgenti laser (Argon 488 nm, DPSS 561 nm e HeNe 633 nm) viene utilizzato in questo esperimento.</li>
	<li>Utilizzare lo strumento di scansione sequenziale, che eccita contemporaneamente campioni triple-macchiato, per evitare e ridurre eventuali sovrapposizioni. Nota: Le immagini saranno prese in modo sequenziale utilizzando la modalità di scansione sequenziale.</li>
	<li>Immagine sotto un obiettivo 10x. Utilizzare lo strumento di analisi delle mattonelle per acquisire la pelle tutto l'orecchio. Impostare Z-stack e assicurarsi che la posizione z copre l'intero spessore della pelle dell'orecchio.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin.">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li><li>Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+confocal+microscopy+for+vascular+branching+morphogenesis.">Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).</li><li>Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunohistochemical+analysis+for+embryonic+limb+skin+vasculature:+a+model+system+to+study+vascular+branching+morphogenesis+in+embryo.">Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Myeloid+Progenitors+Differentiate+into+Pericytes+through+TGF-beta+Signaling+in+Developing+Skin+Vasculature.">Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature.</a> Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).</li><li>Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel-dependent+recruitment+of+sympathetic+axons:+looking+for+innervation+in+all+the+right+places.">Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places.</a> J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve-derived+CXCL12+and+VEGF-A+regulate+the+patterning+of+arterial+vessel+branching+in+developing+limb+skin.">Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin.</a> Dev Cell. 24, 359-371 (2013).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. , e51749 (2014).</li><li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+Whole+Mount:+A+Novel+Processing+and+Imaging+Protocol+for+Thick,+Three-dimensional+Tissue+Cross-sections+of+Skin.">Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Liakath-Ali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+skin+phenotypes+revealed+by+a+genome-wide+mouse+reverse+genetic+screen.">Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen.</a> Nat Commun. 5, 3540 (2014).</li><li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin.">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery.">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).</li><li>Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atopic+dermatitis.">Animal models of atopic dermatitis.</a> J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).</li><li>Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoriasis:+what+we+have+learned+from+mouse+models.">Psoriasis: what we have learned from mouse models.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).</li><li>Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+challenges+of+chronic+wounds:+searching+for+an+optimal+animal+model+to+recapitulate+their+complexity.">Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity.</a> Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).</li><li>O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+diabetic+neuropathy.">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> ILAR J. 54, 259-272 (2014).</li><li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+Adult+Ear+Skin+Imaging+Reveals+Defective+Neuro-Vascular++Branching+Morphogenesis+in+Obese+and+Type+2+Diabetic+Mouse+Models.">Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models.</a> Sci Rep. 8, (2018).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive l'intero-monta immunonohistochemical imaging della pelle dell'orecchio dell'adulto per l'analisi delle strutture neuro-vascolari e la distribuzione delle cellule immuni. Crediamo che questo metodo presenta numerosi vantaggi sperimentali per i ricercatori a studiare la morfogenesi di ramificazione e la campitura di vasi sanguigni e nervi periferici, così come la distribuzione tridimensionale di componenti della pelle tra cui capelli e cellule del sistema immunitario follicoli. I risultati dell'...

Pelle è composto da tre strati: l'epidermide, derma e ipoderma. È stato utilizzato come sistema modello per studiare il mantenimento delle cellule staminali, la differenziazione e la morfogenesi in sviluppo come pure la rigenerazione, tumorigenesi e infiammazione in adulto. Pelle è riccamente vascolarizzata ed innervata tale che lo sviluppo del sistema nervoso periferico e sistema vascolare è ben coordinato.
Precedentemente abbiamo dimostrato una tecnica di imaging intero-monta embrionale della pelle con l'etichettatura più per studiare i nervi periferici intatti e vasi sanguigni, compresi i loro componenti cellulari1,2,3, 4: assoni sensoriali, simpatici assoni, cellule in nervi Schwann, cellule endoteliali, periciti e cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) nei vasi sanguigni. Durante il processo di angiogenesi, una rete capillare primaria subisce intensivo rimodellamento vascolare e si sviluppa in una rete gerarchica di ramificazione vascolare. In sviluppo derma/ipoderma, arterie ramificano al fianco di vene e nervi sensoriali periferici quindi formano adiacenti alle arterie. Dopo la rete vascolare gerarchica è completamente ricoperta di VSMCs, nervi simpatici si estendono lungo e innervano i vasi sanguigni di grande diametro1,5,6. Nonostante il significato in stretta associazione tra i sistemi nervosi e vascolari in via di sviluppo, è stata una questione importante per affrontare ciò che accade alle reti neuro-vascolare in varie situazioni patologiche negli adulti. La formazione immagine tridimensionale ad alta risoluzione è necessaria apprezzare la patogenesi, insieme a morfogenesi di ramificazione anatomicamente riconoscibile e patterning.
Morfogenesi neuronale e vascolare nella pelle del topo adulto è comunemente analizzata macchiando tessuto sezione. Altri studi hanno utilizzato intero-monta la formazione immagine della pelle per visualizzare i nervi periferici e vasi sanguigni, oltre ai follicoli piliferi, ghiandole sebacee e arrector pili muscoli7,8,9. Tuttavia, lo spessore della pelle adulta ha reso difficile analizzare la pelle nel corso di tutta la sua profondità.
Nello studio presente, abbiamo sviluppato un romanzo imaging ad alta risoluzione di intero-monta della pelle dell'orecchio dell'adulto per vincere queste sfide. Pelle dell'orecchio è facilmente accessibile per la dissezione e la formazione immagine intero-monta successiva della pelle nel corso di tutta la sua profondità. Così, è un metodo semplice e altamente riproducibile che possa essere applicato per confrontare l'architettura tridimensionale dei sistemi nervosi e vascolari periferici nella pelle, con misurazioni di quantificazione completa. Abbiamo dimostrato che l'allineamento dei nervi periferici sensoriali e simpatici con i vasi sanguigni di grande diametro è conservato nella pelle adulta. L'obiettivo del presente protocollo è quello di visualizzare la morfogenesi di ramificazione e la campitura di nervi periferici e vasi sanguigni, come pure la distribuzione delle cellule immuni a livello cellulare in modelli di topo adulto in varie condizioni quali l'infiammazione e rigenerazione.

<table><tbody><tr><td>10 x Phosphate Buffered Saline</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3210</td><td>PBS, without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>HBSS, with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>PFA, fixative, diluted in PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td>Component of blocking/washing buffer</td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson Immuno research</td><td>017-000-121</td><td>Component of blocking/washing buffer</td></tr><tr><td>Curved fine tweezers</td><td>Dumont</td><td>RS-5047</td><td></td></tr><tr><td>Curved tweezers</td><td>Integra Miltex Vantage</td><td>V918-782, V918-784</td><td></td></tr><tr><td>Filter Unit 0.45 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>157-0045</td><td>For filtration</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Coviden</td><td>8881501400</td><td>For filtration</td></tr><tr><td>Syringe filter Unit 0.22 mm</td><td>Millex-GV</td><td>SLGVR04NL</td><td>For filtration</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36934</td><td>Anti-fade mounting medium</td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td>For sealing</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>Graphics editor software</td></tr><tr><td>Illustrator CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>Graphics editor software</td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>Image processing software</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31) antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB1398Z</td><td>Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31) antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553369</td><td>Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#945;SMA antibody conjugated with cy-3</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-EphB1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9319</td><td>Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-neuron-specific Class III &amp;#946;-tubulin (Tuj1)</td><td>Abcam</td><td>AB18207</td><td>Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Tuj1 antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-MBP antibody</td><td>Abcam</td><td>AB40390</td><td>Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200</td></tr><tr><td>Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody</td><td>Chemicon</td><td>AB152</td><td>Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Peripherin antibody</td><td>Chemicon</td><td>AB1530</td><td>Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-CD11b antibody</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA74G</td><td>Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50</td></tr><tr><td>Anti-CD45 antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0451-85</td><td>Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-CD3 antibody</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1477T</td><td>Rat IgG1, immune cell marker, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD45R (B220) antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0452</td><td>Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200</td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11122</td><td>Rabbit polyclonal, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab13970</td><td>Chicken polyclonal, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#946;-gal antibody</td><td>Cappel</td><td>55976</td><td>Rabbit polyclonal, 1:5000</td></tr><tr><td>Anti-RFP antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td>Rabbit polyclonal, 1:300</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647</td><td>Jackson Immuno research</td><td>127-605-160</td><td>Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594</td><td>Jackson Immuno research</td><td>112-585-167</td><td>Rat polyclonal secondary antibody, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21136</td><td>Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250</td></tr></tbody></table>

whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution

Qui, presentiamo un protocollo di una pelle dell'orecchio dell'adulto intero-monta imaging tecnica per studiare la morfogenesi di ramificazione neuro-vascolare tridimensionale completa e patterning, come pure la distribuzione delle cellule immuni a livello cellulare. L'analisi della periferiche strutture anatomiche del nervo e dei vasi sanguigni nei tessuti adulti fornisce alcuni spunti per la comprensione della funzionale neuro-vascolare cablaggio e degenerazione neuro-vascolare in condizioni patologiche come la guarigione della ferita. Come sistema modello altamente informativo, abbiamo concentrato i nostri studi sulla pelle dell'orecchio dell'adulto, che è facilmente accessibile per la dissezione. Il nostro protocollo semplice e riproducibile fornisce una rappresentazione accurata dei componenti cellulari della pelle intera, come i nervi periferici (assoni sensoriali, simpatici assoni e le cellule di Schwann), vasi sanguigni (cellule endoteliali e cellule muscolari lisce vascolari ) e cellule infiammatorie. Crediamo che questo protocollo spianerà la strada per studiare le anomalie morfologiche in nervi periferici e dei vasi sanguigni così come l'infiammazione della pelle dell'orecchio dell'adulto sotto diverse condizioni patologiche.

Pelle di topo adulto posteriore dell'orecchio (Figura 1A) e pelle anteriore dell'orecchio (Figura 1B) immunostained con anticorpi anti-αSMA (rosso), Tuj1 (verde) e PECAM-1 (blu). Pelle posteriore era immunostained per studiare neuro-immunitario distribuzione utilizzando anticorpi anti-CD11b (rosso) e MBP (verde), insieme a Tuj1 (blu) (Figura 2A). Distribuzione di CD11b+ cellule infiammato...

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Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Qui, descriviamo un metodo di imaging intero-monta ad alta risoluzione nella pelle dell'orecchio intero topo adulto, che consente di visualizzare la morfogenesi di ramificazione e patterning di nervi periferici e vasi sanguigni, come pure la distribuzione delle cellule immuni.

Intero-monta la microscopia confocale per la pelle dell'orecchio dell'adulto: un sistema modello per lo studio di morfogenesi di ramificazione Neuro-vascolare e la distribuzione delle cellule immuni

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

whole-mount-confocal-microscopy-for-adult-ear-skin-model-system-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.1K Views.  National Institutes of Health. Qui, descriviamo un metodo di imaging intero-monta ad alta risoluzione nella pelle dell'orecchio intero topo adulto, che consente di visualizzare la morfogenesi di ramificazione e patterning di nervi periferici e vasi sanguigni, come pure la distribuzione delle cellule immuni.

Video: Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

Appartamento Monte Imaging di pelle di topo e la sua applicazione alla analisi del follicolo pilifero patterning e sensoriale Axon Morfologia

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Ricerca

Neuroscienze

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Immunologia e infezioni

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Con tutto il supporto per l&#39;analisi immunoistochimica vasi embrionali pelle degli arti: un sistema modello per studiare morfogenesi vascolare diramazione in embrione

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Biologia

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Il monitoraggio ottico di Living nervo terminale Etichettatura nel follicolo pilifero lanceolate Endings del<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Ear pelle

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

Criosezione e immunocolorazione del tessuto dell'orecchio interno del topo: dagli stadi embrionali a quelli adulti

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Biologia dello sviluppo

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

This protocol describes the induction of an ischemia-reperfusion (IR) model on mouse ear skin using magnet clamping. Using a custom-built intravital imaging model, we study in vivo inflammatory responses post-reperfusion. The rationale behind the development of this technique is to extend the understanding of how leukocytes respond to skin IR injury.

Inducendo ischemia-riperfusione lesioni in Ear pelle mouse per intravitale Multiphoton Imaging delle risposte immunitarie

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Medicina

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

Colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero, imaging confocale e ricostruzione 3D del nodo senoatriale e atrioventricolare nel topo

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Microdissezione della stria vascolare per il sequenziamento di un singolo nucleo o l'immunocolorazione

Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell mechanotransduction and ultimately hearing. Pathologies of the stria vascularis can result in a decreased hearing. Dissection of the adult stria vascularis allows for focused single-nucleus capture and subsequent single-nucleus sequencing and immunostaining. These techniques are used to study stria vascularis pathophysiology at the single-cell level. 
Single-nucleus sequencing can be used in the setting of transcriptional analysis of the stria vascularis. Meanwhile, immunostaining continues to be useful in identifying specific populations of cells. Both methods require proper stria vascularis dissection as a prerequisite, which can prove to be technically challenging.

Autore in primo piano: Dissezione di stria vascolare di topo adulto per il sequenziamento di un singolo nucleo o l'immunocolorazione  

The stria vascularis is vital to the generation of endocochlear potential. Here, we present the dissection of the adult mouse stria vascularis for single-nucleus sequencing or immunostaining.

Intero-monta la microscopia confocale per la pelle dell'orecchio dell'adulto: un sistema modello per lo studio di morfogenesi di ramificazione Neuro-vascolare e la distribuzione delle cellule immuni

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