Agradecemos la gestión del laboratorio K. Gill y soporte técnico, J. Hawkins y el personal de institutos nacionales de salud (NIH) facilidad del edificio 50 animales para la ayuda del ratón, y R. Reed y F. Baldrey para asistencia administrativa. Gracias también a Motegi S. y M. Udey para compartir su oído piel disección Protocolo N. quemaduras ayuda editorial y los miembros del laboratorio de células madre y biología Neuro-Vascular para la ayuda técnica y discusión reflexiva. T. Yamazaki fue apoyada por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) NIH-KAITOKU. Este trabajo fue financiado por el programa de investigación intramuros de la National Heart, Lung and Blood Institute (HL005702-11 para Y.M.)

Todos los experimentos en esta sección fueron realizados bajo aprobación de la nacional del corazón, pulmón, sangre Institute (NHLBI) Animal atención y Comité de uso.
1. adultos ratón oído piel colección
<ol><li>Eutanasia a ratones adultos por la exposición de dióxido de carbono (CO2) en una cámara cerrada y luego confirmar la eutanasia por dislocación cervical. Nota: El experimento sigue la pauta de institutos nacionales de salud (NIH) para el método de eutanasia.</li>
	<li>Diseccionar el oído de la base y colóquelo en una de 35 x 10 mm2 caja de Petri que contiene 2 mL de Hank equilibrada solución de sal (HBSS). Brevemente recortar el vello con unas tijeras.</li>
	<li>Pelar la piel posterior y anterior piel lejos cuidadosamente el cartílago intermedio. Nota: El cartílago se adhiere a la piel anterior.</li>
	<li>Transferencia de la parte posterior y anterior piel por separado para una 24 bien la placa que contiene 1 mL de helado fresco paraformaldehído al 4% (PFA) en tampón fosfato salino (PBS) por pozo. Aplanar la piel anterior y posterior en el 4% del PDC.</li>
	<li>Fijar la piel anterior y posterior con cartílago a 4 ° C durante 1 hora.</li>
	<li>Lave la piel posterior y anterior 3 veces durante 5 minutos en 1 mL de PBS con suaves se mezclan en un mezclador a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transferencia de la piel anterior y posterior con cartílago en la parte inferior de 35 x 10 mm2 caja de Petri. Cortar la región de base, que se pliega y adiposo y los tejidos conectivos. Pele el cartílago de la anterior piel con unas pinzas curvas finas.</li>
	<li>Desde el interior de la piel posterior con unas pinzas curvas finas, retire con cuidado los pelos, tejidos adiposos y los tejidos conectivos. Mantener la piel húmeda con PBS.</li>
</ol>2. la coloración de Immunohistochemical de whole-mount de piel de oreja de ratón
Nota: Todos los experimentos en las secciones siguientes se realizaron según las pautas de seguridad del laboratorio de NIH.
<ol><li>Preparar la solución amortiguadora de bloqueo. Filtro inactivado por calor 10% de suero de cabra (HIGS) había diluido en PBS con Tritón 0.2% solución amortiguadora de bloqueo X-100 (TX-100), o 10% de suero de burro (DS) había diluido en PBS con 0.2% solución amortiguadora de bloqueo TX-100, con una unidad de filtro de 0.45 μm.</li>
	<li>Transferencia de la parte posterior y anterior piel 24 bien placa que contiene 1 mL de solución amortiguadora de bloqueo de HIGS de 10% o 10% DS solución amortiguadora de bloqueo por pozo. Incubar la piel por 30 min con suave mezcla en un mezclador a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar la solución de anticuerpo primario por dilución de los anticuerpos primarios (Tabla de materiales) en solución amortiguadora de bloqueo (ya sea 10% HIGS o 10% DS). Nota: Mout todo el análisis de immunohistochemical de la piel de oreja adulto con anticuerpos a la clase de neurona específica marcador neuronal pan III β-tubulina (Tuj1, conejo policlonales IgG o ratón monocloncal IgG2a, dilución 1: 500 en la concentración final de 2 μg/mL), molécula de adhesión de células endoteliales pan marcador plaquetas célula endotelial 1 (PECAM-1, hámster monoclonal IgG, 1:300 dilución en la concentración final de 3.3 μg/mL), proteína básica de mielina de marcador de vaina de mielina (MBP, conejo IgG policlonal, dilución 1: 200 en el concentración final de 5 μg/mL) y el marcador inflamatorio células mieloides CD11b (Rat IgG2b monoclonal, 1:50 dilución en la concentración final de 20 μg/mL) se muestra en la figura 1 y figura 2. La piel se incubó con el anticuerpo conjugado con Cy3 para músculo liso vascular células marcador α actinia del músculo liso (αSMA) junto con anticuerpos secundarios (2.6). Los anticuerpos primarios probados por nosotros mismos se enumeran en la Tabla de materiales. Varios anticuerpos primarios derivados de diferentes especies se pueden mezclar al mismo tiempo.</li>
	<li>Traslado la piel anterior y posterior al nuevo pozo que contiene 150 μL de la solución de anticuerpos primarios. Incubar la piel con la suave mezcla en un mezclador a 4 ° C durante la noche.</li>
	<li>Al día siguiente, la piel posterior y anterior de transferencia a nuevos pozos en la placa de la pozo 24 o aspire la solución amortiguadora de bloqueo con anticuerpos primarios. Añadir 1 mL de o 2% HIGS diluido en PBS con tampón de lavado de TX-100 0.2% o 2% DS diluido en PBS con tampón de lavado 0.2% TX-100. Lave la piel con 3 cambios de la solución de lavado cada 15 minutos con suaves se mezclan en un mezclador a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar la solución de anticuerpo secundario (Tabla de materiales). Diluir los anticuerpos secundarios en la solución amortiguadora de bloqueo (ya sea 10% HIGS o 10% DS) y el filtro de la solución amortiguadora de bloqueo que contiene anticuerpos secundarios a través de un 0.22 μm del polivinilideno (PVDF) de difluoruro jeringa filtro de membrana conectada a una jeringa de 1 mL. Nota: Alexa 488 o 633-conjugado de cabra anti-conejo IgG (H+L) o ratón IgG2a para Tuj1, hamster contra cabra 647 Alexa Conjugado IgG (H+L) de PECAM-1, conjugados con Alexa 488 cabra anti-conejo IgG (H+L) de MBP, y se utilizaron conjugados con Alexa 594 rat IgG (H+L) de CD11b con dilución 1: 250 en la concentración final de 8 μg/mL. La piel se incubó con el anticuerpo αSMA conjugado con Cy3 (dilución 1: 500 en la concentración final de 2-3 μg/mL) en combinación con estos anticuerpos secundarios.</li>
	<li>Centrifugue la solución a 13.000 x g por 10 min eliminar las partículas agregadas de los anticuerpos secundarios de la solución amortiguadora de bloqueo. Nota: Diversos anticuerpos secundarios conjugados fluorescentes derivados de diferentes especies se pueden mezclar al mismo tiempo.</li>
	<li>Traslado la piel posterior y anterior al bien que contiene 150 μL de la solución de anticuerpos secundarios. Envolver la placa 24 bien en papel aluminio para evitar la luz e incubar la piel durante 1 h con suaves se mezclan en un mezclador a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfiera la piel anterior y posterior al nuevos pozos en la placa de la pozo 24 o aspirar la solución de anticuerpo secundario por pipeta completamente. Añadir 1 mL de tampón de lavado 2% HIGS o tampón de lavado 2% DS.</li>
	<li>Envolver la placa de la pozo 24 en papel de aluminio y lavar con 3 cambios de la solución de lavado cada 15 minutos con suaves se mezclan en un mezclador a temperatura ambiente.</li>
</ol>3. la piel de la oreja de montaje en portaobjetos
<ol><li>Colocar la piel en la parte inferior de 35 x 10 mm2 caja de Petri. Retire con cuidado los pelos, tejido adiposo, tejidos conectivos, polvos y fibras desde el interior de la piel utilizando fórceps curvado fino bajo Estereomicroscopio con iluminación baja para minimizar la foto amplia de blanqueo. Mantener la piel húmeda con PBS.</li>
	<li>Transferencia de la piel a un adhesivo portaobjetos usando pinzas. Coloca la piel anterior y posterior con la parte interior hacia arriba en la diapositiva. Aplanar la piel con unas pinzas.</li>
	<li>Montaje de la piel en un medio líquido montaje anti-fade para evitar fotoblanqueo y preservar las señales fluorescentes. Asegúrese de que no hay burbujas de aire en o alrededor de la piel.</li>
	<li>Cubrir con cubreobjetos sobre las muestras de piel con cuidado y guardar las diapositivas de muestra de piel montada en la oscura noche a temperatura ambiente para permitir que los medios de montaje conseguir la firmes. Sellar el cubreobjetos a la diapositiva con esmalte de uñas y almacenar a 4 ° C para almacenamiento a largo plazo.</li>
</ol>4. confocal microscopio
<ol><li>Configurar láser apropiada para fluoróforos. Un microscopio confocal con tres fuentes de láser (argón 488 nm, DPSS 561 nm y HeNe 633 nanómetro) se utiliza en este experimento.</li>
	<li>Utilice la herramienta de exploración secuencial, que excita al mismo tiempo muestras de triple tinción, para evitar y reducir cualquier superposición. Nota: Se tomarán imágenes de manera secuencial utilizando el modo de exploración secuencial.</li>
	<li>Imagen bajo un objetivo de X 10. Utilice la herramienta de exploración de azulejo para capturar la piel de la oreja entera. Conjunto Z-stack y asegúrese de que la posición de z abarca todo el espesor de la piel del oído.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensory+nerves+determine+the+pattern+of+arterial+differentiation+and+blood+vessel+branching+in+the+skin.">Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin.</a> Cell. 109, 693-705 (2002).</li><li>Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+confocal+microscopy+for+vascular+branching+morphogenesis.">Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).</li><li>Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunohistochemical+analysis+for+embryonic+limb+skin+vasculature:+a+model+system+to+study+vascular+branching+morphogenesis+in+embryo.">Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Myeloid+Progenitors+Differentiate+into+Pericytes+through+TGF-beta+Signaling+in+Developing+Skin+Vasculature.">Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature.</a> Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).</li><li>Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vessel-dependent+recruitment+of+sympathetic+axons:+looking+for+innervation+in+all+the+right+places.">Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places.</a> J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+nerve-derived+CXCL12+and+VEGF-A+regulate+the+patterning+of+arterial+vessel+branching+in+developing+limb+skin.">Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin.</a> Dev Cell. 24, 359-371 (2013).</li><li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology.">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> J Vis Exp. , e51749 (2014).</li><li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+Whole+Mount:+A+Novel+Processing+and+Imaging+Protocol+for+Thick,+Three-dimensional+Tissue+Cross-sections+of+Skin.">Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin.</a> J Vis Exp. , (2017).</li><li>Liakath-Ali, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+skin+phenotypes+revealed+by+a+genome-wide+mouse+reverse+genetic+screen.">Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen.</a> Nat Commun. 5, 3540 (2014).</li><li>Gunawan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methyltransferase+Ezh2+controls+cell+adhesion+and+migration+through+direct+methylation+of+the+extranuclear+regulatory+protein+talin.">The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin.</a> Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).</li><li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery.">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).</li><li>Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+atopic+dermatitis.">Animal models of atopic dermatitis.</a> J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).</li><li>Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoriasis:+what+we+have+learned+from+mouse+models.">Psoriasis: what we have learned from mouse models.</a> Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).</li><li>Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+challenges+of+chronic+wounds:+searching+for+an+optimal+animal+model+to+recapitulate+their+complexity.">Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity.</a> Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).</li><li>O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+diabetic+neuropathy.">Mouse models of diabetic neuropathy.</a> ILAR J. 54, 259-272 (2014).</li><li>Yamazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-Mount+Adult+Ear+Skin+Imaging+Reveals+Defective+Neuro-Vascular++Branching+Morphogenesis+in+Obese+and+Type+2+Diabetic+Mouse+Models.">Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models.</a> Sci Rep. 8, (2018).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe la imagen de conjunto-Monte immunonohistochemical de piel de oreja adulto para el análisis de estructuras neuro-vasculares y la distribución de células inmunitarias. Creemos que este método tiene numerosas ventajas experimentales para investigadores para el estudio de ramificación de la morfogénesis y los patrones de los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como la distribución tridimensional de los componentes de la piel incluyendo el pelo y las células inmunes folículos. Los r...

Piel se compone de tres capas: la epidermis, la dermis y la hipodermis. Se ha utilizado como sistema modelo para estudiar el mantenimiento de la célula de vástago, la diferenciación y la morfogénesis en el desarrollo así como la regeneración, tumorogénesis e inflamación en adulto. Piel es ricamente vascularizada e inervada de tal manera que el desarrollo del sistema vascular y sistema nervioso periférico es bien coordinado.
Previamente hemos demostrado una técnica de imagen de piel embrionaria todo Monte con etiquetas múltiples para el estudio de los nervios periféricos intactos y los vasos sanguíneos incluyendo sus componentes celulares1,2,3, 4: axones sensoriales, axones simpáticos, las células en los nervios de Schwann, células endoteliales, pericitos y células musculares lisas vasculares (VSMCs) en los vasos sanguíneos. Durante la angiogénesis, una red capilar primaria experimenta intensivo remodelado vascular y se convierte en una red jerárquica de ramificación vascular. En la dermis/hipodermis en vías de desarrollo, las arterias ramifican junto a los nervios sensoriales periféricos y venas entonces forman adyacentes a las arterias. Después de la red vascular jerárquica está bien cubierta con VSMCs, los nervios simpáticos se extienden a lo largo e inervan los vasos sanguíneos de gran diámetro1,5,6. A pesar de la importancia de la estrecha asociación entre los sistemas nerviosos y vasculares en desarrollo, ha sido una cuestión importante abordar lo que ocurre con las redes neuro-vasculares en diferentes situaciones patológicas en adultos. Una proyección de imagen de alta resolución tridimensional es necesario apreciar la patogenesia, junto con morfogénesis ramificación anatómica reconocible y patrones.
Morfogénesis neuronal y vascular en piel de ratón adulto se analizan comúnmente por tejido sección coloración. Otros estudios han utilizado proyección de imagen de conjunto de montaje de la piel para visualizar los nervios periféricos y vasos sanguíneos, además de los folículos pilosos, glándulas sebáceas y del arrector pili músculos7,8,9. Sin embargo, el grueso de la piel adulta ha hecho difícil analizar la piel en toda su profundidad.
En el presente estudio, hemos desarrollado una novela alta resolución montaje en toda la proyección de imagen de piel de oreja adulto para superar estos desafíos. Piel del oído es fácilmente accesible para la disección y posterior montaje de toda la proyección de imagen de la piel en toda su profundidad. Por lo tanto, es un método simple y altamente reproducible que puede aplicarse para comparar la arquitectura tridimensional de los sistemas nerviosos y vasculares periféricos en la piel, con las medidas de cuantificación integral. Hemos demostrado que la alineación de los nervios periféricos sensoriales y simpáticas con los vasos sanguíneos de gran diámetro se conserva en la piel adulta. El objetivo de este protocolo es visualizar la ramificación de la morfogénesis y los patrones de los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como la distribución de células inmune a nivel celular en modelos de ratón adulto en varias condiciones tales como la inflamación y regeneración.

<table><tbody><tr><td>10 x Phosphate Buffered Saline</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3210</td><td>PBS, without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>HBSS, with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>PFA, fixative, diluted in PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td>Component of blocking/washing buffer</td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson Immuno research</td><td>017-000-121</td><td>Component of blocking/washing buffer</td></tr><tr><td>Curved fine tweezers</td><td>Dumont</td><td>RS-5047</td><td></td></tr><tr><td>Curved tweezers</td><td>Integra Miltex Vantage</td><td>V918-782, V918-784</td><td></td></tr><tr><td>Filter Unit 0.45 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>157-0045</td><td>For filtration</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Coviden</td><td>8881501400</td><td>For filtration</td></tr><tr><td>Syringe filter Unit 0.22 mm</td><td>Millex-GV</td><td>SLGVR04NL</td><td>For filtration</td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36934</td><td>Anti-fade mounting medium</td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td>For sealing</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>Graphics editor software</td></tr><tr><td>Illustrator CC 2017</td><td>Adobe</td><td></td><td>Graphics editor software</td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td>Image processing software</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31) antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB1398Z</td><td>Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-PECAM-1 (CD31) antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553369</td><td>Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#945;SMA antibody conjugated with cy-3</td><td>Sigma</td><td>C6198</td><td>Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-EphB1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9319</td><td>Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-neuron-specific Class III &amp;#946;-tubulin (Tuj1)</td><td>Abcam</td><td>AB18207</td><td>Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Tuj1 antibody</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-MBP antibody</td><td>Abcam</td><td>AB40390</td><td>Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200</td></tr><tr><td>Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody</td><td>Chemicon</td><td>AB152</td><td>Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Peripherin antibody</td><td>Chemicon</td><td>AB1530</td><td>Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-CD11b antibody</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA74G</td><td>Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50</td></tr><tr><td>Anti-CD45 antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0451-85</td><td>Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-CD3 antibody</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1477T</td><td>Rat IgG1, immune cell marker, 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD45R (B220) antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-0452</td><td>Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200</td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11122</td><td>Rabbit polyclonal, 1:300</td></tr><tr><td>Anti-GFP antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab13970</td><td>Chicken polyclonal, 1:500</td></tr><tr><td>Anti-&amp;#946;-gal antibody</td><td>Cappel</td><td>55976</td><td>Rabbit polyclonal, 1:5000</td></tr><tr><td>Anti-RFP antibody</td><td>Abcam</td><td>Ab62341</td><td>Rabbit polyclonal, 1:300</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647</td><td>Jackson Immuno research</td><td>127-605-160</td><td>Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594</td><td>Jackson Immuno research</td><td>112-585-167</td><td>Rat polyclonal secondary antibody, 1:250</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21136</td><td>Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250</td></tr></tbody></table>

whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution

Aquí, presentamos un protocolo de una piel de oreja adulto todo montaje de técnica para estudiar la completa morfogénesis tridimensional de ramificación neuro-vascular y patrones, así como distribución de célula inmune a nivel celular. El análisis de estructuras anatómicas del nervio y los vasos sanguíneos periféricos en tejidos adultos proporciona algunas perspectivas en la comprensión del cableado neuro-vasculares funcional y degeneración neuro-vascular en condiciones patológicas como la cicatrización de heridas. Como un sistema modelo muy informativo, nos hemos centrado nuestros estudios en piel de oreja adulto, que es fácilmente accesible para la disección. Nuestro protocolo simple y reproducible proporciona una descripción exacta de los componentes celulares de la piel entera, tales como los nervios periféricos (axones sensoriales, axones simpáticos y células de Schwann), los vasos sanguíneos (células endoteliales y células musculares lisas vasculares ) y células inflamatorias. Creemos que este protocolo allanará el camino para investigar anormalidades morfológicas en los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como la inflamación en la piel de oreja adulto bajo diferentes condiciones patológicas.

Ratón adulto posterior oído piel (figura 1A) y anterior de la oreja (figura 1B) immunostained con anticuerpos αSMA (rojo), Tuj1 (verde) y PECAM-1 (azul). Piel posterior era immunostained para estudiar la distribución de neuro-inmune con anticuerpos CD11b (rojo) y MBP (verde), junto con Tuj1 (azul) (figura 2A). Distribución de CD11b+ las células inflamatorias, incluyendo macrófagos f...

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Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Aquí, describimos un método imagenológico de alta resolución Monte todo en la piel de oreja de ratón adulto entero, que nos permite visualizar la ramificación de la morfogénesis y el patrón de los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como distribución de células inmunes.

Whole-mount Microscopía Confocal para el oído adulto piel: un sistema modelo para el estudio de morfogénesis Neuro-vascular de ramificación y distribución de células inmunes

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

whole-mount-confocal-microscopy-for-adult-ear-skin-model-system-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.1K vistas.  National Institutes of Health. Aquí, describimos un método imagenológico de alta resolución Monte todo en la piel de oreja de ratón adulto entero, que nos permite visualizar la ramificación de la morfogénesis y el patrón de los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como distribución de células inmunes.

Video: Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Flat Mount Imaging of Mouse Skin and Its Application to the Analysis of Hair Follicle Patterning and Sensory Axon Morphology

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel cell clusters), sebaceous glands, nerves and nerve endings, and capillaries. The spatial arrangement of these structures is tightly controlled on a microscopic scale - as seen, for example, in the orderly arrangement of cell types within a single hair follicle - and on a macroscopic scale - as seen by the nearly identical orientations of thousands of hair follicles within a local region of skin. Visualizing these structures without physically sectioning the skin is possible because of the 2-dimensional geometry of this organ. In this protocol, we show that mouse skin can be dissected, fixed, permeabilized, stained, and clarified as an intact two dimensional object, a flat mount. The protocol allows for easy visualization of skin structures in their entirety through the full thickness of large areas of skin by optical sectioning and reconstruction. Images of these structures can also be integrated with information about position and orientation relative to the body axes.

Mammalian skin contains a diverse array of structures - such as hair follicles and nerve endings - that exhibit distinctive patterns of spatial organization. Analyzing skin as a flat mount takes advantage of the 2-dimensional geometry of this tissue to produce full-thickness high-resolution images of skin structures.

Flat Mount Imaging de ratón de la piel y su aplicación al análisis del folículo del pelo Patrones y sensorial Axon Morfología

Skin is a highly heterogeneous tissue. Intra-dermal structures include hair follicles, arrector pili muscles, epidermal specializations (such as Merkel ...

Investigación

Neurociencias

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

La migración de células T CD4 obtener imágenes intersticial en la dermis inflamadas

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Inmunología e Infección

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Todo el montaje La disección y de inmunofluorescencia del Adulto ratón cóclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Todo el montaje El análisis inmunohistoquímico de la piel del miembro Vasculatura embrionarias: un sistema modelo para estudiar la morfogénesis vascular ramificación en embriones

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Biología

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

Seguimiento óptico del nervio terminal de estar etiquetado en folículo piloso lanceoladas Los finales de la<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Piel de la oreja de ratón

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

Criosección e inmunotinción de tejido del oído interno de ratón: desde la etapa embrionaria hasta la adulta

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Biología del Desarrollo

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

This protocol describes the induction of an ischemia-reperfusion (IR) model on mouse ear skin using magnet clamping. Using a custom-built intravital imaging model, we study in vivo inflammatory responses post-reperfusion. The rationale behind the development of this technique is to extend the understanding of how leukocytes respond to skin IR injury.

La inducción de la lesión por isquemia-reperfusión en la piel de la oreja del ratón para intravital n fotones de imágenes de la respuesta inmune

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Medicina

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo, imágenes confocales y reconstrucción 3D del nódulo sinoauricular y auriculoventricular en el ratón

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Microdisección de estrías vasculares para secuenciación de un solo núcleo o inmunotinción

Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell mechanotransduction and ultimately hearing. Pathologies of the stria vascularis can result in a decreased hearing. Dissection of the adult stria vascularis allows for focused single-nucleus capture and subsequent single-nucleus sequencing and immunostaining. These techniques are used to study stria vascularis pathophysiology at the single-cell level. 
Single-nucleus sequencing can be used in the setting of transcriptional analysis of the stria vascularis. Meanwhile, immunostaining continues to be useful in identifying specific populations of cells. Both methods require proper stria vascularis dissection as a prerequisite, which can prove to be technically challenging.

Autor destacado: Disección de estrias vasculares de ratones adultos para secuenciación de un solo núcleo o inmunotinción  

The stria vascularis is vital to the generation of endocochlear potential. Here, we present the dissection of the adult mouse stria vascularis for single-nucleus sequencing or immunostaining.

Whole-mount Microscopía Confocal para el oído adulto piel: un sistema modelo para el estudio de morfogénesis Neuro-vascular de ramificación y distribución de células inmunes

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