Los autores agradecen a Hanna Voersmann para establecer el 3D organotypic melanoma-esferoide-piel-modelo y protocolos excelentes. Los autores también agradecen a Silke Busch por valioso apoyo técnico. El trabajo fue apoyado por BMBF e: programa Med 031A423A "Sensibilidad del Melanoma".

Todos los trabajos de tejido humano se realizan mediante protocolos institucionales aprobados.
1. separación de la Dermis y la Epidermis de la piel humana (prepucio juvenil de la circuncisión)
<ol><li>Colocar el prepucio (generalmente 1-2 cm2) en una placa de cultivo celular estéril no adhesiva (Ø 10 cm) y cubrirla con 10-12 mL de solución salina con tampón fosfato+ (PBS, pH 7.2, 0,5 mM MgCl2, 0,9 mM CaCl2= PBS+). Retire todo exceso de tejido (adiposo) uso pinzas y bisturí estéril.</li>
	<li>Cortar la piel en trozos de 3 x 5 mm, lavar con PBS y transferirlas a una placa de cultivo celular estéril no adhesiva (Ø 6 cm). Cubrir las piezas de tejido con 5-7 mL de solución dispase (2 U/mL en PBS). Sellar la placa de cultivo celular con la película de parafina e incube por 16 h a 4 ° C.</li>
	<li>Repliegue de la epidermis de la parte dérmica con dos pinzas estériles. Transferir las piezas diseca el tejido a los platos de la cultura de célula individual no adhesiva (Ø 6 cm) y cubra cada uno con PBS+.</li>
</ol>2. aislamiento de queratinocitos primarios de la Epidermis
<ol><li>Con cuidado retire el PBS+ de la placa de cultivo de células utilizando una pipeta Pasteur y lave las piezas de tejido epidérmico (sección 1.3) con PBS. Corte de la epidermis en trozos más pequeños (1 mm2) y recoger en un tubo cónico de 50 mL. Añadir 10 mL 1 x tripsina-EDTA (precalentado a 37 ° C) e incubar por 5 min en un baño de agua a 37 ° C. Vórtice de la suspensión de tejido cada 2 minutos.</li>
	<li>Detener la reacción enzimática añadiendo 1 mL de suero de ternero fetal (FCS). Resuspender las células por arriba y abajo el pipeteo con una pipeta de plástico de 10 mL para 4 minutos tratar de evitar las burbujas y la formación de espuma.</li>
	<li>Pipetear la suspensión celular en un colador de célula (poro tamaño 100 μm), colocado encima de un tubo cónico de 50 mL fresco y enjuagar 3 veces con 5 mL de PBS. Centrifugar las células a 200 x g por 5 min Resuspender el precipitado de células en 2-6 mL medio de cultivo que contiene gentamicina 1% (v/v). Determinar el número de células manualmente por contar las células en un hemocitómetro y semilla 6 x 105 células en un frasco de cultivo celular T75.</li>
</ol>3. cultivo de queratinocitos primarios
<ol><li>Incubar los queratinocitos primarios aislados en el paso 2.3 en un incubador de células a 37 ° C y 5% de CO2 en medio de queratinocitos sin FCS, a 50-70% de confluencia.</li>
	<li>Al paso de los queratinocitos con cuidado quitarlo del medio, añadir 5 mL de PBS-EDTA e incube las células durante 10 min a 37 ° C. Comprobar si las células han comenzado a separar del frasco de cultivo bajo un microscopio de luz (4 aumentos: las células aparecerán redondeadas pero todavía están conectadas!). Si no, sustituir viejos PBS-EDTA con PBS-EDTA fresco y volver a incubar durante otros 10 minutos a 37 ° C.</li>
	<li>Añadir 5 mL 1 x tripsina-EDTA a las células redondeadas aún cubiertos con 10 mL de PBS-EDTA y volver a los Incube por 1-3 min a 37 ° C. Detener la reacción enzimática añadiendo 1 mL FCS y recoger las células separadas en un tubo cónico de 50 mL. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min, Resuspender el precipitado en medio del keratinocyte y semilla 6 x 105 células en un frasco de cultura de célula T75 fresco. Nota: Para generar organotypic piel reconstruye, los queratinocitos primarios deben utilizar no más adelante que paso 3-4.</li>
</ol>4. aislamiento de fibroblastos primarios de la Dermis
<ol><li>Cortar el tejido cutáneo (sección 1.3) en trozos más pequeños (1 mm2) y transferir a un tubo cónico de 50 mL. Añadir 10 mL solución de colagenasa (5 U/mL en PBS+) e incubar durante 45 min en un baño de agua a 37 ° C. Centrifugar la mezcla de piezas de tejido y células a 200 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Lavar el precipitado de células dos veces con 10 mL DMEM que contiene 4,5 g/L glucosa y L-glutamina, pero sin L-piruvato. Finalmente resuspender las piezas de tejido en 2 mL de DMEM que contiene gentamicina 1% (v/v) y 10% FCS. Transferir a un matraz de cultivo celular T25 e incubar en una incubadora de la célula a 37 ° C y 5% de CO2 durante la noche. Nota: El escaso volumen permite a los fibroblastos migrar de los restos de tejido y los obliga a colocar en el matraz de la cultura.</li>
	<li>A la mañana siguiente, añadir otros 6 mL DMEM/gentamicina/FCS e incubar durante 2-3 días a 37 ° C hasta que las células hayan alcanzado el 80-90% de confluencia.</li>
</ol>5. cultivo de fibroblastos primarios
<ol><li>Paso de los fibroblastos, quitarlo del medio y lavar las células adherentes con PBS. Añadir 5 mL 1 x tripsina-EDTA e incubar 3 min a 37 ° C.</li>
	<li>Detener la reacción enzimática añadiendo 5 mL DMEM/FCS y recoger las células separadas en un tubo cónico de 50 mL. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min, Resuspender el precipitado en medio DMEM y 6 x 105 células de la semilla en un frasco de cultura de célula T75 fresco. Nota: Para generar organotypic piel reconstruye, los fibroblastos primarios deben utilizar no más adelante que paso 4-6.</li>
</ol>6. generación de Melanoma 3D esferoides mediante el método de la gota colgante
<ol><li>Cultura las células del melanoma (p. ej., 451-LU o cualquier línea celular de melanoma de interés) según protocolos generales, con RPMI con 10% FCS15.<ol>
<li>Para generar esferoides de melanoma de tamaño y calidad similares, lave las células de melanoma en PBS, añadir 5 mL de 1 x de tripsina-EDTA en PBS a las células en un T175 matraz de cultivo de células e incubar durante 3-5 min a temperatura ambiente (RT). Neutralizar la tripsina añadiendo 5 mL RPMI/10% FCS. Cosecha de que las células por centrifugación a 200 x g durante 5 min Resuspenda el precipitado de células en RPMI/FCS a una concentración final de 10.000 células/mL, determinado por el recuento en un hemocitómetro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Punto 40 x 25 μl (= 250 células) de la suspensión celular sobre la superficie interna de la tapa de una placa de cultivo estéril no adhesivo celular (Ø 10 cm) con una pipeta múltiple electrónica. Con un movimiento rápido pero suave, vuelta la tapa y coloque en el plato de cultura de célula respectiva que contiene 5 mL de PBS.<ol>
<li>Cultura "platos de gota colgante" en un incubador de células a 37 ° C y 5% de CO2 por 10-14 días, dependiendo del tipo de célula utilizada. Nota: Las células de la fase de crecimiento MM típicamente crecen más rápido y forman esferoides más sólidos en la gota de la suspensión en comparación con las células del melanoma se deriva de la RGP o VGP. Para la evaluación individual, observar crecimiento de esferoide bajo un par de binoculares o un microscopio óptico (4 aumentos). Esferoides se convierten generalmente detectables después de 48 h en un par de binoculares o un microscopio óptico (4 aumentos). Después de 10-14 días, son visibles sin ningún dispositivo de aumento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 días después de la caída inicial manchado, añadir 10 μl de medio fresco de RPMI/10% FCS a cada gota. Posteriormente, intercambiar 10 μl de medio día. El uso de un dispensador electrónico es muy útil en este paso.</li>
	<li>Dependiendo del tipo de célula, de la cosecha los esferoides (ver sección 10 para más detalles) después de 10-15 días enjuagándolas suavemente de la tapa de plato de cultura de célula con PBS. Recogerlos en una placa de cultivo celular no adhesivo fresco. Nota: El período de cultivo depende de la fase de crecimiento del tumor de las células del melanoma cuando que inicialmente fueron derivados, por ejemplo, esferoides, derivados de células 451-LU crecen aproximadamente 500 μm de diámetro dentro de 12 días de cultivo en la gota colgante15 .</li>
</ol>7. generación del compartimiento cutáneo de piel completo Organotypic reconstruye
<ol><li>Generar modelos de piel mediante célula de 24 pocillos microporosa membrana insertos (tamaño 8 μm de poro) en placas de 24 pocillos. Nota: Asegúrese de no utilizar colgantes pero insertos, porque colocaron en una placa de 6 pozos de aire-líquido de cultivo en una etapa posterior.</li>
	<li>Preparar el gel neutralización solución (GNL)15, así como los medios de cultivo denominados m y crecimiento endotelial de16,de medios (EGM)17. Para prevenir la coagulación, tienda el colágeno tipo I (generalmente de cola de rata, 3.5-4 mg/mL en 0.02 N de ácido acético) en hielo hasta su uso, ya que se inicia al gel a TA.</li>
	<li>Vuelva a suspender 1 x 105 fibroblastos por insertar en GNL y rápidamente mezclar la suspensión de células con el colágeno en una proporción de 1:3 en un volumen final de 500 μl/insertar. Mezclar mediante pipeteo suavemente hacia arriba y hacia abajo para evitar formación de burbujas, las burbujas pueden perjudicar la calidad de la piel reconstruir.</li>
	<li>Permita que los geles cutáneos individuales resolver por mantenerlos sin medio a temperatura ambiente por 30 min en una capucha estéril. Posteriormente cubrir el gel con DMEM que contenía glucosa 4,5 g/L, de 1% L-glutamina, 10% FCS y sin L-piruvato e incubar toda la noche a 37 ° C.</li>
</ol>8. generación del compartimiento epidérmico de piel completo Organotypic reconstruye
<ol><li>Al día siguiente Retire el medio de los geles cutáneos y equilibrar con medios EGM (10% FCS, 1% PenStrep, gentamicina 10 mg/mL) durante 2 h a 37 ° C. Retirar el medio y con cuidado la semilla 1 x 105 queratinocitos resuspendió en 100 μl de EGM en la parte superior del gel dérmico.</li>
	<li>Incubar la reconstruye durante 1,5 h a 37 ° C para permitir que los queratinocitos se adhieran al compartimiento cutáneo. Nota: Durante este tiempo de incubación, los geles comenzará a reducir debido a la contracción inducida por el fibroblasto y así, al menos parcialmente se desprenda de las paredes del inserto.</li>
	<li>Cubrir los equivalentes de piel con aproximadamente 800 μl de EGM y retire con cuidado el gel residual de la pared del parte movible con una pequeña pipeta (blanco). Los equivalentes de piel sumergidos en EGM para 7 días en una incubadora de la célula a 37 ° C, 5% CO2, de la cultura y cambiar el medio día. Nota: Durante este tiempo los equivalentes de piel se reducirá significativamente.</li>
</ol>9. aire-líquido cultivo de piel Organotypic completa reconstruye
<ol><li>Día 8 traslado cada Inserte un pozo individual de una placa de 6 pozos. Sólo añadir 1.2-1.4 mL de medio m a cada pozo, para que la piel reconstruir se suministra con medio de la parte inferior del pozo pero no está cubierto con medio. Nota: Cultivo en la interfase aire-líquido permite la estratificación de la parte epidérmica y el establecimiento de una completa capa cornified (estrato córneo).</li>
	<li>Durante los próximos días 10-17, cambiar el medio como se indica en la sección 9,1 cada día. Durante este período, añadir drogas u otros estímulos como sea necesario para el medio. Retire con cuidado el reconstruir de piel completo del compartimento de membrana microporosa con unas pinzas curvas para su posterior análisis, por ejemplo, el análisis de immunohistochemical (figura 1).</li>
</ol>10. generación de los modelos de piel Organotypic Melanoma esferoide
<ol><li>Para integrar los esferoides de melanoma en el compartimiento cutáneo de la reconstruye de organotypic llena de la piel, enjuagar cuidadosamente los esferoides (después paso 6.4) de la tapa de las que cuelgan gota placa de cultivo de células con PBS. Recoger 10-20 esferoides/insertar en una placa de cultivo estéril no adhesivo celular. Retire con cuidado excesivo PBS con una pipeta Pasteur.</li>
	<li>Aspire los esferoides en el posible más pequeño del volumen de EGM. En este punto observar y contar los esferoides con el ojo desnudo, sin ningún otro dispositivo de aumento. Tomar 10-20 esferoides por modelo/gel de la piel, como se indica en el paso 10.1.</li>
	<li>Transferencia para el volumen de GNL que contiene fibroblastos (durante el paso 7.3) y mezclar con el colágeno de tipo I. De este paso en proceder como se describe en las secciones 7.3 9.1. Nota: Esferoides tumorales se hacen visibles en el gel cutáneo como manchas blancas (figura 2)</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boulais, N., Misery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermis:+a+sensory+tissue.">The epidermis: a sensory tissue.</a> Eur. J. Dermatol. 18 (2), 119-127 (2008).</li><li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+homeostasis:+a+balancing+act+of+stem+cells+in+the+skin.">Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin.</a> Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 10 (3), 207-217 (2009).</li><li>Shain, A. H., Bastian, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+melanocytes+to+melanomas.">From melanocytes to melanomas.</a> Nat. Rev. Cancer. 16 (6), 345-358 (2016).</li><li>Clark, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cutaneous+malignant+melanoma+as+a+model+for+cancer.">Human cutaneous malignant melanoma as a model for cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 10 (2), 83-88 (1991).</li><li>Hsu, M. Y., Meier, F., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+development+and+progression:+a+conspiracy+between+tumor+and+host.">Melanoma development and progression: a conspiracy between tumor and host.</a> Differentiation. 70 (9-10), 522-536 (2002).</li><li>Miller, A. J., Mihm, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma.">Melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 355 (1), 51-65 (2006).</li><li>Balch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Final+version+of+2009+AJCC+melanoma+staging+and+classification.">Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification.</a> J. Clin. Oncol. 27 (36), 6199-6206 (2009).</li><li>Eigentler, T. K., Caroli, U. M., Radny, P., Garbe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palliative+therapy+of+disseminated+malignant+melanoma:+a+systematic+review+of+41+randomised+clinical+trials.">Palliative therapy of disseminated malignant melanoma: a systematic review of 41 randomised clinical trials.</a> Lancet Oncol. 4 (12), 748-759 (2003).</li><li>Kim, T., Amaria, R. N., Spencer, C., Reuben, A., Cooper, Z. A., Wargo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+targeted+therapy+and+immune+checkpoint+inhibitors+in+the+treatment+of+metastatic+melanoma.">Combining targeted therapy and immune checkpoint inhibitors in the treatment of metastatic melanoma.</a> Cancer Biol. Med. 11 (4), 237-246 (2014).</li><li>Lawrence, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+heterogeneity+in+cancer+and+the+search+for+new+cancer-associated+genes.">Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes.</a> Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).</li><li>Flaherty, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mutated,+activated+BRAF+in+metastatic+melanoma.">Inhibition of mutated, activated BRAF in metastatic melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 363 (9), 809-819 (2010).</li><li>Rauschenberg, R., Garzarolli, M., Dietrich, U., Beissert, S., Meier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+therapy+of+metastatic+melanoma.">Systemic therapy of metastatic melanoma.</a> J. Dtsch. Dermatol. Ges. 13 (12), 1223-1235 (2015).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening:+the+multicellular+spheroid+model.">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model.</a> J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Vorsmann, H., Groeber, F., Walles, H., Busch, S., Beissert, S., Walczak, H., Kulms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+human+three-dimensional+organotypic+skin-melanoma+spheroid+model+for+in+vitro+drug+testing.">Development of a human three-dimensional organotypic skin-melanoma spheroid model for in vitro drug testing.</a> Cell Death. Dis. 4, e719 (2013).</li><li>Chen, C. S., Lavker, R. M., Rodeck, U., Risse, B., Jensen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+serum-free+epidermal+culture+model+to+show+deleterious+effects+of+epidermal+growth+factor+on+morphogenesis+and+differentiation.">Use of a serum-free epidermal culture model to show deleterious effects of epidermal growth factor on morphogenesis and differentiation.</a> J. Invest. Dermatol. 104 (1), 107-112 (1995).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs+:+biological+significance+of+bFGF.">Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF.</a> Am. J. Pathol. 156 (1), 193-200 (2000).</li><li>Sinnberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PI3K-AKT-mTOR+signaling+sensitizes+melanoma+cells+to+cisplatin+and+temozolomide.">Inhibition of PI3K-AKT-mTOR signaling sensitizes melanoma cells to cisplatin and temozolomide.</a> J. Invest. Dermatol. 29 (6), 1500-1515 (2009).</li><li>Niessner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+farnesyl+transferase+inhibitor+lonafarnib+inhibits+mTOR+signaling+and+enforces+sorafenib-induced+apoptosis+in+melanoma+cells.">The farnesyl transferase inhibitor lonafarnib inhibits mTOR signaling and enforces sorafenib-induced apoptosis in melanoma cells.</a> J. Invest. Dermatol. 131 (2), 468-479 (2011).</li><li>Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).</li><li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+an+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol. J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Organotypic melanoma esferoide piel modelo introducido aquí garantiza nuevas perspectivas para una comprensión más profunda de intra tumoral y la interacción del tumor-host y puede proporcionar una plataforma de investigación avanzados para estudiar los mecanismos moleculares del desarrollo del tumor y resistencia de la terapia en el futuro.
Para garantizar el mejor fisiológica y reconstruye en vivo imitando las condiciones de la piel, la calidad de las células primarias es de suma importancia. Como se indicó anteriormente, las células de la piel juvenil o prenatal muestran el menor grado de diferenciación y por lo tanto son más adecuadas generar equivalentes de piel de grosor total. El primer posible control de calidad es el grado de contracción cutánea en el día 2 después de la siembra de los queratinocitos y equilibrando el gel a EGM (secciones 8.2 y 8.3 del Protocolo). Geles cutáneos reducirá al máximo con la mejor calidad de los fibroblastos. Además, la integración de los fibroblastos muy pocos o demasiados puede perjudicar la contracción cutánea y por consiguiente fijación de la epidermis del compartimiento cutáneo. Esto a su vez afectarán la diferenciación epidérmica, ya que este proceso requiere una extensa Charla cruzada entre las células dérmicas y epidérmicas.
La calidad de células primarias también críticamente depende de la confluencia celular así como el paso de las células. Si keratinocytes cultivados a ≥80% confluencia inmediatamente detener la proliferación y empezar a distinguir. Por lo tanto es importante a la cultura les a confluencia de 40-70% en pases y utilizar no más adelante que paso 3-4. Los fibroblastos son menos sensibles pero no deben ser utilizados más adelante que paso 4-6. Tenga en cuenta que todas las células primarias y líneas celulares utilizadas para generar modelos de piel organotypic melanoma esferoide se cultivan libres de antibióticos, y por lo tanto el riesgo de contaminación es alto. Sin embargo, la adición de antibióticos cambia la fisiología de las células individuales y por lo tanto reduce la calidad de los equivalentes de piel.
En general, formación esferoide del tumor es posible de casi todo tipo de líneas celulares tumorales y de células tumorales recién aisladas de paciente material. El tiempo inicial de la célula número o cultivo para obtener tamaños de esferoide óptima puede variar dependiendo del tipo de célula utilizado. Hasta un tamaño de 150-200 μm, todas las celdas incluidas en un esferoide pueden todavía ser suficientemente provistas de nutrientes por difusión simple. Sólo esferoides con tamaños ≥500 μm muestran un alto grado de diferenciación celular y representan características típicas del tumor no vascularizado tejido22.
El organotypic melanoma-esferoide-piel-modelo desarrollado aquí es particularmente conveniente para el estudio de las interacciones del tumor-host y fármaco melanoma pruebas en vivo-como condiciones15. Aún así, el ambiente de melanoma en vivo es aún más complejo, que alberga una gran variedad de tipos de células de tumor asociado, incluyendo las células inmunes y células endoteliales. Puesto que la adición de células inmunes primarias apropiadas enfrenta problemas de histocompatibilidad, estos modelos no son aún capaces de controlar adecuadamente enfoques terapéuticos inmune.
Sin embargo, esferoides de melanoma pueden generarse material paciente recién aislado y una vez incluido en el reconstruir de piel completo, puede servir como medicamento individual investigación plataformas. Incluso la integración de piezas de metástasis de melanoma en piel reconstruye es concebible para probar combinaciones de fármacos en un acercamiento terapéutico a la medida. Incluyendo el modelo 3D de piel-melanoma organotypic en ensayos preclínicos es probable ayudar a asegurar que sólo los más prometedores nuevos conceptos terapéuticos llevan adelante en ensayos clínicos, reduciendo así la tasa de deserción de potenciales nuevos tratamientos para esto enfermedad y aumentar la tasa de éxito terapéutico en los ensayos clínicos.

La piel humana se compone de dos compartimentos distintos que sirven a diferentes funciones de proteger el cuerpo contra los efectos ambientales adversos1. El compartimiento cutáneo inferior consta de un fibro-elástica del tejido conectivo. Se compone de fibras de colágeno y elastina libremente conectadas sintetizadas por fibroblastos, sirviendo una función de barrera mecánica. La dermis está separada de la epidermis superior de la lámina basal que se produce como una matriz extracelular debido a una comunicación constante entre ambos compartimientos de la piel. A diferencia de la dermis, la epidermis es un epitelio escamoso que se compone principalmente de queratinocitos y pueden diferenciarse en cuatro capas. Consiste en el estrato basal de queratinocitos basales indiferenciadas que constantemente derivan de células progenitoras de piel estratificación a través de las etapas del estrato espinoso y estrato granuloso en el corneum del estrato para proteger el cuerpo contra deshidratación e infecciones2. Melanocitos se alinean en la membrana basal y comunican a través de extensiones dendríticas con múltiples queratinocitos. Que producen la melanina de pigmento para proteger el tejido de la piel de los efectos adversos de la radiación UV, como el envejecimiento de la piel, inmunosupresión, inflamación e inducción de cáncer de piel no melanoma. Aporte de radiaciones UV para la transformación de los melanocitos en melanoma maligno, sin embargo, está aún bajo debate3.
Desarrollo de melanoma es diferenciado en etapas de progresión del tumor diferentes y se caracteriza por ciertos cambios genéticos, morfológicos y histologic4. Se originan ya sea de novo o de un nevo innato o adquirido debido a un local aumento de proliferación de melanocitos causando neoplasia benigna. Esta lesión precursora se puede convertir en tejido displásico estructuralmente modificado que contienen células atípica, que pueden seguir a la primera etapa mala, la fase de crecimiento radial (RGP). Esta fase temprana de la progresión de tumor se caracteriza por células proliferando radialmente dentro de la epidermis, que muestra pocas células localmente invasoras dentro de la dermis papilar. En el melanoma de fase (VGP) crecimiento vertical posterior las células ya muestran un fenotipo invasivo y metastático rompiéndose a través de la lámina basal para infiltrarse en las partes más profundas de la dermis y el tejido subcutáneo5. Por último, el melanoma metastásico (MM) representa la etapa de progresión más agresiva con las células metastásicas separarse sistémicamente a través del sistema sanguíneo y linfático distal invadir órganos como hígado, pulmón y cerebro6.
Hasta la fecha, el diagnóstico precoz seguido de cirugía sigue siendo el tratamiento más eficaz del melanoma malo. El pronóstico para los pacientes con metástasis a distancia, sin embargo, sigue siendo particularmente pobres7, porque los regímenes de quimioterapia clásica confieren sólo poca supervivencia beneficio8,9. Sin embargo, después de décadas de estancamiento, los recientes avances en terapias dirigidas han mejorado considerablemente el pronóstico del melanoma maligno.
Dysregulation de dos vías principales mitógeno activada, RAS-RAF-MEK-ERK y las vías de señalización de PI3K-AKT-PTEN, presentan motores clave de la progresión del melanoma, especialmente cuando está constitutivamente activando mutaciones puntuales de los proto-oncogenes BRAFV600 y ANR están presentes10. En consecuencia, la invención de los inhibidores de la quinasa específica prometió beneficios terapéuticos para pacientes con melanoma metastásico. Una multitud de ensayos clínicos realizados a este punto no ha logrado un beneficio significativo para los pacientes con melanoma metastásico. Casi todas las respuestas son parciales, con una subpoblación de pacientes que muestran resistencia primaria. Por otra parte, la adquisición de resistencia secundaria, conduce a la recidiva se observó en la mayoría de los pacientes11,12.
Queda claro que análisis de la situación de mutación solamente no son suficiente para desarrollar la estrategia terapéutica más potente. Nuevas herramientas de diagnóstico rápidos y fiables son necesarias para registrar y analizar la capacidad de respuesta de las células cancerosas individuales sistemáticamente. La gran mayoría de los datos actualmente disponibles en melanoma humano ha sido obtenida de cultivos celulares de dos dimensiones (2D) melanoma. Las células del tumor, sin embargo, crecidas en 3D permiten interferencia intercelular entre cáncer diferenciado subpoblaciones celulares así como entre las células cancerosas y el tejido circundante host no transformado. Por lo tanto, lo mejor sería reconstruir el entorno 3D en el que el melanoma desarrollado para ser utilizado como una investigación preclínica modelo13,14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="625">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">fetal serum albumin (FCS)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10270106</td>
			<td style="width:167px;">add 10 % to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25300054</td>
			<td>1X dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RPMI</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61870010</td>
			<td style="width:167px;">for cultivation of melanoma cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">41965062</td>
			<td style="width:167px;">for cultivation of primary fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dispase</td>
			<td style="width:123px;">Gibco life technologies&#160;</td>
			<td>17105041</td>
			<td>2U/ml, dissolve in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Collagen type I</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td>354249</td>
			<td style="width:167px;">usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">24-well inserts Nunclon&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Nunc</td>
			<td>140629</td>
			<td style="width:167px;">8 &#181;m pore size; use standing, not hanging inserts!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cell strainer</td>
			<td style="width:123px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352360</td>
			<td>yellow</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gentamycine</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750060</td>
			<td>dissolve in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Keralife keratincyte medium</td>
			<td style="width:123px;">Cell Systems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">do not add FCS or antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase</td>
			<td style="width:123px;">SERVA</td>
			<td>17454</td>
			<td>NB4 standard grade</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">juvenile human keratinocytes</td>
			<td style="width:123px;">Cell Systems</td>
			<td style="width:119px;">FC-0007</td>
			<td style="width:167px;">alternative to own preparation from juvenile foreskin</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">juvenile human fibroblasts</td>
			<td style="width:123px;">Cell Systems</td>
			<td style="width:119px;">FC-0001</td>
			<td style="width:167px;">alternative to own preparation from juvenile foreskin</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">DMEM 
			[+] 4,5 g/l Glucose, 
			[+] L- Glutamine, 
			[-] L- Pyruvate</td>
			<td style="width:123px;">Gibco life technologies</td>
			<td style="width:119px;">41965</td>
			<td style="width:167px;">mix 1:1 with Ham&#180;s F-12 for MM medium;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; mix 3:1 with Ham&#180;s F-12 for EGM medium</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Ham&#180;s F-12 [+] L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Gibco life technologies</td>
			<td style="width:119px;">&#160;21765-029</td>
			<td style="width:167px;">add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EGF&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Gibco life technologies</td>
			<td style="width:119px;">&#160;13247-051</td>
			<td style="width:167px;">add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:123px;">Merck Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">2381</td>
			<td style="width:167px;">add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Selenic acid</td>
			<td style="width:123px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">18851</td>
			<td style="width:167px;">add 53 nM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:123px;">Lilly</td>
			<td style="width:119px;">HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml</td>
			<td style="width:167px;">add 5 &#181;g/ml for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">E-0135</td>
			<td style="width:167px;">add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">P-Ethanolamine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-0503</td>
			<td style="width:167px;">add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Holo-Transferrine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T-0665</td>
			<td style="width:167px;">add 5 &#181;g/ml for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Triiodthyronine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T-6397</td>
			<td style="width:167px;">add 20 pM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H-088816</td>
			<td style="width:167px;">add 0.4 &#181;g/ml for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Progesterone</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-8783</td>
			<td style="width:167px;">add 10 nM only for the generation of EGM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hepes</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H-3784</td>
			<td style="width:167px;">add 15 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Serine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S-4311</td>
			<td style="width:167px;">add 1 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cholinchloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C-7017</td>
			<td style="width:167px;">add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">dFCS</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F-0392 Lot 086K0361</td>
			<td style="width:167px;">add 2 % for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Adenine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-9795</td>
			<td style="width:167px;">add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-42209</td>
			<td style="width:167px;">add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Strontiumchloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">255521</td>
			<td style="width:167px;">add 1 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti cytokeratin 10 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">M7002</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti cytokeratin 14 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-53253</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;anti laminin 5 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-32794</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti filaggrin antibody</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-13440</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti involucrin antibody</td>
			<td style="width:123px;">Acris Antibodies</td>
			<td style="width:119px;">AM33368PU</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled</td>
			<td style="width:123px;">LifeSpan Biosciences</td>
			<td>LS-C153907</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled</td>
			<td style="width:123px;">Jackson Immuno Research</td>
			<td style="width:119px;">115-165-003</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10236276001</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3d organotypic melanoma spheroid skin model

Transformación maligna de los melanocitos, las células del pigmento de la piel humana, provoca la formación del melanoma, un cáncer muy agresivo con mayor potencial metastásico. Recientemente, mono quimioterapia continúa mejorando por terapias de combinación específica de melanoma con inhibidores de la quinasa específica. Todavía, melanoma metastásico sigue siendo una enfermedad mortal porque tumores exhiben resistencia primaria o desarrollan resistencia a nuevas terapias, así recuperando capacidad tumorigénica. Para mejorar el éxito terapéutico del melanoma maligno, la determinación de los mecanismos moleculares que confieren resistencia a tratamientos convencionales es necesaria; sin embargo, requiere modelos innovadores celulares en vitro . Aquí, presentamos un en vitro tridimensional (3D) organotypic esferoide modelo de melanoma que puede retratar la arquitectura en vivo de melanoma maligno y puede justificar nuevas penetraciones en intra tumoral así como de las interacciones del tumor-host. El modelo incorpora números definidos de esferoides de melanoma maduro y diferenciado en un modelo de reconstrucción llena de la piel humano 3D consisten en células primarias de la piel. El estado de diferenciación y composición celular de los esferoides de melanoma incrustado es similar a la de metástasis de melanoma cutáneo en vivo. Utilizando este modelo de esferoide organotypic melanoma como una droga de investigación plataforma puede apoyar la identificación de respondedores a seleccionado tratamientos combinados, mientras que ahorra la carga de tratamiento innecesario para los no respondedores, aumentando así el beneficio de intervenciones terapéuticas.

Tratamiento acertado de la metástasis de melanoma puede verse afectado por la interferencia entre las células del tumor, así como entre tumor y las células del huésped no transformado. El propósito de desarrollar modelos organotypic de cáncer en vitro es proporcionar sistemas de test preclínicos adecuados que recapitulan la organización 3D y la complejidad de melanoma humano en vivo. Esto permite el estudio de los efectos terapéuticos sobre el tumor dentro de un entorno organotypic y los efectos adversos sobre el tejido circundante primario en paralelo.
Para desarrollar los mejores modelos de piel organotypic, reviste la calidad de las células primarias. Es ventajoso utilizar juveniles primarios fibroblastos y queratinocitos, porque por lo general menos se diferencian en comparación con las células epiteliales primarias adultos. Juvenil piel células pueden ya sea aislarse de prepucio juvenil como se describe en las secciones del protocolo 1-5, pero también pueden adquirirse en empresas como queratinocitos y los fibroblastos primarios pre-natales. Si compras, es necesario a las células del orden de diferentes donantes para evitar resultados específicos del donante, por ejemplo, para la sensibilidad de la droga. El protocolo entero aparece como un esquema en la figura 3.
Control de calidad de equivalentes de piel completo 3D requiere el análisis de immunohistochemical. Una primera impresión puede obtenerse de la Hematoxylin-eosina (H & E) manchas de parafina incorporado secciones (3 μm). Análisis detallado de la calidad de la diferenciación epidérmica y formación de la lámina basal entre el dermis y la epidermis requieren el análisis de immunohistochemical usando los anticuerpos específicos contra un marcador de estratificación epidérmico. Esto permite distinguir entre las células no diferenciadas, altamente proliferativas situado cerca de la membrana basal y altamente diferenciados y queratinizado células en el estrato córneo a través de la formación de diferentes capas epidérmicas entre . Como se muestra por la coloración histológica inmune (figura 4), diferenciación de los queratinocitos en la epidermis puede lograrse similar a la piel normal: principalmente las células indiferenciadas de las capas inferiores de la epidermis (estrato basal y spinosum del estrato) tinción positiva para la queratina 14, mientras que las células más diferenciadas de las capas supra basal (estrato granuloso y estrato córneo) tinción positiva para la queratina 10 y involucrin. Por consiguiente, filaggrin tinción sólo se pudo observar en las células altamente diferenciadas del corneum del estrato. Lo más importante, laminina 5 tinción revela que una lámina basal fue generada para conectar fisiológicamente el epidérmico del compartimiento cutáneo de la piel artificial reconstruir. Esto demuestra que se ha generado un microambiente organotypic comunican a las células del melanoma host o esferoides para análisis fisiológico y patofisiológico.
Con el fin de detección de drogas de melanoma, células de melanoma solo pueden integrarse también en la dermis de los equivalentes de piel completo para permitir de nuevo melanoma nido formación18,19. Por lo tanto, las células del melanoma se combinan con fibroblastos primarios en una proporción de 5:1, centrifugada a 200 x g durante 5 minutos y resuspendió en GNL antes de mezclarse con el colágeno. Como resultado, los nidos de células de melanoma espontáneamente se forman en el compartimiento cutáneo. Según nuestra experiencia, sólo las células del crecimiento metastático fase nidos adecuada forma, en comparación con las células del melanoma de la RGP o VGP15. Un gran inconveniente de este tipo de modelos es el hecho de que el número y tamaño de nidos de melanoma formado no se puede predecir y varían entre individual piel reconstruye, independientemente de cualquier tratamiento. Por ejemplo, 1.000 células sembradas en el compartimiento cutáneo pueden ganar 10 nidos de 100 células o 100 nidos que consta de 10 células cada uno (figura 5). Estas variables biológicas presentan tres deficiencias: en primer lugar, el número y tamaño de melanoma nidos formados son impredecibles; en segundo lugar, la metástasis en vivo son generalmente más grandes que nidos de melanoma y exhiben una diversidad intra tumoral más compleja; y en tercer lugar, debido a la limitada vida de modelos de tumor-nido, tratamiento se inicia temprano y por lo tanto algo inhibe la extensión del tumor en lugar de causar la regresión de los nidos tumorales.
Para superar estos limitaciones organotypic melanoma esferoide piel los modelos puede ser generados. Por melanoma metastásico 250 cultivo células en una suspensión de la gota para días 1420, esferoides se generan reproducible de melanoma viable las células que presentan una estructura compacta con un diámetro final de aproximadamente 500 μm mímico no vascularizadas nodos, micro metástasis, o entre capilar micro regiones del tumor tumores sólidos21,22. En general, cualquier línea celular de melanoma es adecuado para la generación de esferoides mediante el colgante gota método; sin embargo, células derivadas de la más avanzada forma de tumor metastático etapas esferoides más sólidas frente a líneas celulares derivadas de progresión las etapas iniciales, por ejemplo, la RGP.
Para algunas células, es ventajoso para la formación del esferoide adecuada mejorar la viscosidad de la suspensión la gota de medio de cultivo. Esto puede lograrse mediante la adición de 10-50% metil-celulosa al medio de cultivo. Para la solución madre de metil-celulosa, autoclave 1.2 g metil-celulosa, junto con una barra de agitación magnética en una botella de vidrio de 100 mL. Añadir 100 mL precalentado (60 ° C) medio y revuelva durante 20 min a temperatura ambiente y otro 1-2 h a 4 ° C. Centrifugue la solución por 2 h a 5.000 x g y guarde el sobrenadante viscoso a 4 ° C hasta su uso.
Correcta validación de modelos de esferoide de melanoma de piel completo es proporcionado por el hecho de que un número definido de melanoma esferoides pueden - por lo menos estadísticamente - integrarse en el colágeno del fibroblasto dérmico andamio en el día 1 de la construcción de modelo de piel, lo que permite les a desarrollar durante la diferenciación epidérmica por 25-27 días. El rendimiento de esferoides puede ser analizado directamente después de la siembra, porque esferoides aparecen como manchas blancas dentro de la transparencia cutáneas gel y pueden ser vistos sin ningún dispositivo de aumento (figura 2). Como resultado, se genera un modelo 3D de la piel que esferoides de melanoma maduro de puertos, que habían sido cultivado en vitro para un total de aproximadamente 42 días, que muestra el nivel más alto de intra tumoral celular diferenciación15.
H & E tinción del modelo de esferoide de melanoma de piel revela el aspecto histológico y la distribución celular de esferoides de melanoma muy similar a del melanoma humano no vascularizada piel metástasis en vivo15 (figura 6 ). Dos subpoblaciones de células de melanoma son claramente distinguibles en esas condiciones: una subpoblación proliferación periférica y una subpoblación central consistiendo en principalmente encogido, apoptóticas o necróticas células, formando el supuesto "necrótico" Centro. Immunohistochemically, viven y proliferan las subpoblaciones se puede detectar usando los anticuerpos contra el marcador de proliferación KI-67, mientras que las células del centro necrótico se pueden visualizar por tinción TUNEL15. Esta particular distribución de las subpoblaciones de células de tumor está garantizada por el tamaño del esferoide (≥500 μm), resultante de una falta de nutrientes y oxígeno en la parte central donde se acumulan residuos catabólicos. Siguiendo el protocolo proporcionado aquí permitirá la generación de un confiable y reproducible organotypic modelo de piel humana de espesor completo con había incrustado esferoides de melanoma humano que mímico metástasis del melanoma humano piel. Aplicaciones de este modelo incluyen las pruebas de drogas, detección de toxinas, la influencia de compuestos cosméticos o terapia en consecuencia de melanoma y el tratamiento con láser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig1.jpg"> Figura 1 : Cultivo de organotypic 3D piel reconstruye sumergido con medio y en la interfase aire-líquido. En el día 0 queratinocitos primarios se siembran en la parte superior del compartimiento cutáneo compuesto por fibroblastos primarios encaja en un tipo de colágeno I matriz. Piel 3D reconstruye permanecer cultivada sumergido con EGM durante 7 días, separarlo de la pared del parte movible y empezar a encogerse. En el día 8 los insertos son transferidos a 6 pozos y cultivados en la interfase aire-líquido para permitir la estratificación epidérmico. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig2.jpg"> Figura 2 : Esferoides de melanoma encajados el compartimiento cutáneo aparecen como manchas blancas. Mientras preparar el compartimiento cutáneo de la reconstruir piel 3D, un número definido de esferoides de melanoma puede añadirse el tipo de colágeno del fibroblasto que mezclar. Una vez que ha colocado el gel cutáneo, esferoides de melanoma se hacen visibles como manchas blancas.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig3.jpg"> Figura 3 : Esquema de la construcción del modelo 3D organotypic piel. Eliminar el tejido adiposo de la muestra de la piel y cortarlo en trozos más pequeños. Incubación con solución dispase durante la noche a 4 º C facilita la separación de la epidermis de la dermis. Queratinocitos y los fibroblastos primarios aislados deben ser cultivado por separado y utilizado entre paso 4-6 y 3-4, respectivamente. Posteriormente, la generación del modelo 3D de la piel puede proceder como se describe en el protocolo. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig4.jpg"> Figura 4 : 3D organotypic piel reconstruye muestra un nivel de diferenciación similar a la piel humana normal. Secciones de los equivalentes de piel de parafina (A) piel humana comparada con normales (B) fueron manchadas para la expresión de queratinas 14 (rojo: λex 554 nm; λem 568 nm) y involucrin 10, (verde: λex 490 nm; λem 525 nm ), filaggrin (verde: λex 490 nm; λem 525 nanómetro) y laminina 5 (verde: λex 490 nm; λem 525 nanómetro) y se analizaron con un microscopio de fluorescencia confocal. Los núcleos de célula fueron visualizados por tinción DAPI (azul: λex 340 nm; λem 488 nm). Examinación de Immunohistochemical del 3D full grueso de piel equivalentes reveló apropiada epidérmico estratificación formando distintas capas de la epidermis en piel humana normal. Mientras que las células de las capas epidérmicas inferiores mancharon el positivas para la queratina 14, más células diferenciadas de la capa basal supra demostrada queratina 10 y la coloración de involucrin. Las células altamente diferenciadas cerca del estrato córneo expresan filaggrin. Laminin 5 tinción muestra que se genera una lámina basal para conectar fisiológicamente el epidérmico del compartimiento cutáneo (panel inferior). Esta figura ha sido tomada de Voersmann et al. 15 con permiso. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig5.jpg"> Figura 5 : No se puede predecir el número y tamaño de los nidos de melanoma espontáneamente formados. Formación de nido de melanoma de novo en el compartimiento cutáneo de piel completo equivalentes se logra mezclando un número definido de melanoma células con fibroblastos primarios para incorporar ambos tipos de células en el colágeno de tipo I matriz. El número y tamaño de los nidos de melanoma espontáneamente formados pueden ser analizadas sólo desde un reconstruir piel 3D madura después de 21 días. Como se muestra de dos muestras (A) y (B), los números y los tamaños de los nidos de melanoma pueden variar entre reconstruye la piel individual. En consecuencia, es difícil validar estos modelos y para predecir el impacto terapéutico. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig6.jpg"> Figura 6 : Esferoides de melanoma integrados en equivalentes de piel recapitulan las características clave de la metástasis de melanoma cutáneo humano. H & E tinción de secciones de la parafina de esferoides tumorales embebidos en equivalentes de piel revelaron esferoides que comparte características clave con las metástasis de melanoma cutáneo humano no vascularizado en vivo. Dos subpoblaciones de células son claramente discernibles: una subpoblación de vida periférica y central subpoblación que consiste en principalmente encogido, apoptóticas o necróticas células, formando el centro "necrótico". Esta distribución de las subpoblaciones de células de tumor está garantizada por el tamaño del esferoide. Esta figura ha sido modificada de Voersmann et al. 15 con permiso. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model at JoVE.com

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Aquí, presentamos un protocolo para generar un modelo 3D organotypic melanoma esferoide piel que recapitula la arquitectura y complejidad multicelular de un órgano, tumor en vivo pero al mismo tiempo acomoda sistemático experimental intervención.

Un modelo de piel Organotypic Melanoma 3D esferoide

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

a-3d-organotypic-melanoma-spheroid-skin-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

15.6K vistas.  TU-Dresden. Aquí, presentamos un protocolo para generar un modelo 3D organotypic melanoma esferoide piel que recapitula la arquitectura y complejidad multicelular de un órgano, tumor en vivo pero al mismo tiempo acomoda sistemático experimental intervención.

Video: A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with or without surgery. While platinum-based chemotherapy regimens currently represent the gold standard in terms of efficacy and are given in the vast majority of cases, new chemotherapy regimens, namely immunotherapy are emerging. However, the response rates and therapy resistance mechanisms for either chemo regimen are hard to predict and remain insufficiently understood. Broad variations of chemo and radiation resistance mechanisms are known to date. This study describes the development of a standardized, high-throughput in vitro assay to assess HNSCC cell line&#39;s response to various therapy regimens, and hopefully on primary cells from individual patients as a future tool for personalized tumor therapy. The assay is designed to being integrated into the quality-controlled standard algorithm for HNSCC patients at our tertiary care center; however, this will be subject of future studies. Technical feasibility looks promising for primary cells from tumor biopsies from actual patients. Specimens are then transferred into the laboratory. Biopsies are mechanically separated followed by enzymatic digestion. Cells are then cultured in ultra-low adhesion cell culture vials that promote the reproducible, standardized and spontaneous formation of three-dimensional, spheroid-shaped cell conglomerates. Spheroids are then ready to be exposed to chemo-radiation protocols and immunotherapy protocols as needed. The final cell viability and spheroid size are indicators of therapy susceptibility and therefore could be drawn into consideration in future to assess the patients&#39; likely therapy response. This model could be a valuable, cost-efficient tool towards personalized therapy for head and neck cancer.

We describe the evolution of a spheroid-based, three-dimensional in vitro model that enables us to test the current standard of experimental therapy regimens for head and neck squamous cell carcinoma on cell lines, aiming at evaluating therapy susceptibility and resistance on primary cells from human specimens in the future.

Terapia de prueba en un modelo de cultivo celular 3D basado en el esferoide para cabeza y cuello de células escamosas

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

Identificación, caracterización histológica y disección de ratón próstata lóbulos para modelos In Vitro esferoide 3D cultura

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

Un ensayo de la matanza de esferoide por las células de T automóvil

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture vessels versus in vivo in human patients. This is due to the bottleneck selection of clonal populations of melanoma cells that can robustly grow in vitro in the absence of physiological conditions. Further, responses to therapy in two-dimensional tissue cultures overall do not faithfully reflect responses to therapy in melanoma patients, with the majority of clinical trials failing to show the efficacy of therapeutic combinations shown to be effective in vitro. Although xenografting of melanoma cells into mice provides the physiological in vivo context absent from two-dimensional tissue culture assays, the melanoma cells used for engraftment have already undergone bottleneck selection for cells that could grow under two-dimensional conditions when the cell line was established. The irreversible alterations that occur as a consequence of the bottleneck include changes in growth and invasion properties, as well as the loss of specific subpopulations. Therefore, models that better recapitulate the human condition in vivo may better predict therapeutic strategies that effectively increase the overall survival of patients with metastatic melanoma. The patient-derived xenograft (PDX) technique involves the direct implantation of tumor cells from the human patient to a mouse recipient. In this manner, tumor cells are consistently grown under physiological stresses in vivo and never undergo the two-dimensional bottleneck, which preserves the molecular and biological properties present when the tumor was in the human patient. Notable, PDX models derived from organ sites of metastases (i.e., brain) display similar metastatic capacity, while PDX models derived from therapy naive patients and patients with acquired resistance to therapy (i.e., BRAF/MEK inhibitor therapy) display similar sensitivity to therapy.

Patient-derived xenograft (PDX) models more robustly recapitulate melanoma molecular and biological features and are more predictive of therapy response compared to traditional plastic tissue culture-based assays. Here we describe our standard operating protocol for the establishment of new PDX models and the characterization/experimentation of existing PDX models.

Un modelo de xenoinjerto derivado del paciente de melanoma

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

Evaluación de la viabilidad celular y la muerte en cultivos esferoides 3D de células cancerosas

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Un modelo de esferoides 3D como un sistema más fisiológico para la diferenciación de fibroblastos asociados al cáncer y estudios de invasión in Vitro

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and invasive potential of cancer cells, and consequently the metastatic spread of disease, are being discovered and considered as complementary treatments in highly invasive cancers such as gliomas. Thus, generating data enabling the detailed analyses of cells in a 3D environment following the addition of a drug is required. The methodology described here, combining spheroid invasion assays with high-resolution image capture and data analysis by confocal laser scanning microscopy (CLSM), enabled detailed characterization of the effects of the potential anti-migratory inhibitor MI-192 on glioma cells. Spheroids were generated from cell lines for invasion assays in low adherent 96-well plates and then prepared for CLSM analysis. The described workflow was preferred over other commonly used spheroid-generating techniques due to both ease and reproducibility. This, combined with the enhanced image resolution attained by confocal microscopy compared to conventional wide-field approaches, allowed the identification and analysis of distinct morphological changes in migratory cells in a 3D environment following treatment with the migrastatic drug MI-192.

The effects of migrastatic inhibitors on glioma cancer cell migration in three-dimensional (3D) invasion assays using a histone deacetylase (HDAC) inhibitor are characterized by high-resolution confocal microscopy.

Caracterización de los efectos de los inhibidores migratorios en la invasión de esferoides de tumores 3D por microscopía confocal de alta resolución

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident stem cells are relatively quiescent with niche restraints in adult tissues, they enter the cell cycle in anchor-free three-dimensional (3D) culture and undergo both symmetric and asymmetric cell division, giving rise to both stem and progenitor cells. The latter proliferate rapidly and are the major cell population at various stages of lineage commitment, forming heterogeneous spheroids. Using primary normal human prostate epithelial cells (HPrEC), a spheroid-based, label-retention assay was developed that permits the identification and functional isolation of the spheroid-initiating stem cells at a single cell resolution.
HPrEC or cell lines are two-dimensionally (2D) cultured with BrdU for 10 days to permit its incorporation into the DNA of all dividing cells, including self-renewing stem cells. Wash out commences upon transfer to the 3D culture for 5 days, during which stem cells self-renew through asymmetric division and initiate spheroid formation. While relatively quiescent daughter stem cells retain BrdU-labeled parental DNA, the daughter progenitors rapidly proliferate, losing the BrdU label. BrdU can be substituted with CFSE or Far Red pro-dyes, which permit live stem cell isolation by FACS. Stem cell characteristics are confirmed by in vitro spheroid formation, in vivo tissue regeneration assays, and by documenting their symmetric/asymmetric cell divisions. The isolated label-retaining stem cells can be rigorously interrogated by downstream molecular and biologic studies, including RNA-seq, ChIP-seq, single cell capture, metabolic activity, proteome profiling, immunocytochemistry, organoid formation, and in vivo tissue regeneration. Importantly, this marker-free functional stem cell isolation approach identifies stem-like cells from fresh cancer specimens and cancer cell lines from multiple organs, suggesting wide applicability. It can be used to identify cancer stem-like cell biomarkers, screen pharmaceuticals targeting cancer stem-like cells, and discover novel therapeutic targets in cancers.

Using human primary prostate epithelial cells, we report a novel biomarker-free method of functional characterization of stem-like cells by a spheroid-based label-retention assay. A step-by-step protocol is described for BrdU, CFSE, or Far Red 2D cell labeling; three-dimensional spheroid formation; label-retaining stem-like cell identification by immunocytochemistry; and isolation by FACS.

Aislamiento de células similares a tallos de cultivos esferoides tridimensionales

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro model in the study of cancer stem/initiating cells, preclinical cancer research, and drug screening. The 3D spheroid models are superior to conventional tumor cell culture and reproduce some important characters of real solid tumors. However, conventional 3D tumor spheroids are made up exclusively of tumor cells. They lack the participation of tumor stromal cells and have insufficient extracellular matrix (ECM) deposition, thus only partially mimicking the in vivo conditions of tumor tissues. We established a new multicellular 3D spheroid model composed of tumor cells and stromal fibroblasts that better mimics the in vivo heterogeneous tumor microenvironment and its native desmoplasia. The formation of spheroids is strictly regulated by the tumor stromal fibroblasts and is determined by the activity of certain crucial intracellular signaling pathways (e.g., Notch signaling) in stromal fibroblasts. In this article, we present the techniques for coculture of tumor cells-stromal fibroblasts, time-lapse imaging to visualize cell-cell interactions, and confocal microscopy to display the 3D architectural features of the spheroids. We also show two examples of the practical application of this 3D spheroid model. This novel multicellular 3D spheroid model offers a useful platform for studying tumor-stroma interaction, elucidating how stromal fibroblasts regulate cancer stem/initiating cells, which determine tumor progression and aggressiveness, and exploring involvement of stromal reaction in cancer drug sensitivity and resistance. This platform can also be a pertinent in vitro model for drug discovery.

A novel three-dimensional spheroid model based on the heterotypic interaction of tumor cells and stromal fibroblasts is established. Here, we present coculture of tumor cells and stromal fibroblasts, time-lapse imaging, and confocal microscopy to visualize the formation of spheroids. This three-dimensional model offers a pertinent platform to study tumor-stroma interactions and test cancer therapeutics.

Un novedoso modelo de esferoides de tumor 3D modulado por fibroblastos para el estudio de la interacción tumor-Stroma y el descubrimiento de fármacos

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were developed. These models may be particularly important in the field of neuro-oncology. Indeed, brain tumors have the tendency to invade the healthy brain environment. We describe herein an ideal 3D glioblastoma spheroid-based assay that we developed to study tumor invasion. We provide all technical details and analytical tools to successfully perform this assay.

Here, we describe an easy-to-use invasion assay for glioblastoma. This assay is suitable for glioblastoma stem-like cells. A Fiji macro for easy quantification of invasion, migration, and proliferation is also described.

Un modelo de esferoides 3D para Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...