Name: a 3d organotypic melanoma spheroid skin model
Uploaded: 2018-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
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Die Autoren danken für die 3D organotypischen Melanom-Sphäroid-Haut-Modell zu etablieren und bietet ausgezeichnete Protokolle Hanna Voersmann. Die Autoren danken auch Silke Busch für wertvolle technische Unterstützung. Die Arbeit wurde unterstützt vom BMBF e: Med Programm "Melanom Sensitivity" 031A423A.

Alle menschlichen Gewebe Arbeiten erfolgte mittels zugelassenen institutionellen Protokolle.
(1) Trennung der Dermis und Epidermis aus der menschlichen Haut (Juvenile Vorhaut von Beschneidung)
<ol><li>Legen Sie die Vorhaut (in der Regel 1 – 2 cm2) in einer Kulturschale nichtklebenden sterile Zelle (Ø 10 cm) und decken Sie es mit 10-12 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung+ (0,5 mM MgCl2, PBS, pH 7,2, 0,9 mM CaCl2= PBS+). Entfernen Sie alle überschüssiges (adipös) Gewebe mit sterilen Skalpell und Pinzette.</li>
	<li>Schneiden Sie die Haut in 3 x 5 mm Stücke mit PBS waschen Sie und übertragen Sie sie auf ein nicht klebendes sterile Zelle Kulturschale (Ø 6 cm). Die Gewebe-Stücke mit ca. 5-7 mL Dispase-Lösung (2 U/mL PBS) zu decken. Versiegeln Sie der Zelle Kulturschale mit Paraffin Film und 16 h bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Einfahren der epidermalen aus dem dermalen Teil mit zwei sterile Pinzetten. Seziert Gewebe Stücke auf Einzelzelle nichtklebenden Kultur Gerichte (Ø 6 cm) übertragen und jeder von ihnen mit PBS+zu decken.</li>
</ol>2. Isolierung der primären Keratinozyten aus der Epidermis
<ol><li>Sorgfältig die PBS+ aus der Zelle Kulturschale mit einer Pasteurpipette entfernen und die epidermalen Gewebe Stücke (Abschnitt 1.3) mit PBS waschen. Schneiden Sie die Epidermis in kleinere Stücke (1 mm2) und sammeln sie in einem 50 mL konische Röhrchen. Fügen Sie 10 mL 1 x Trypsin-EDTA (vorgeheizt auf 37 ° C) und 5 min im Wasserbad bei 37 ° c inkubieren Wirbel der Gewebe-Aufhängung alle 2 min.</li>
	<li>Stoppen Sie die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 1 mL fetalen Kälberserum (FCS). Aufzuwirbeln Sie die Zellen von oben und unten mit einer 10-mL-Kunststoff-Pipette für 4 min. versuchen zur Vermeidung von Luftblasen und Schaum-Bildung pipettieren.</li>
	<li>Pipettieren der Zellsuspension in eine Zelle Sieb (Pore Größe 100 µm), auf eine frische 50 mL konische Rohr platziert, 3 X mit 5 mL PBS spülen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 X g, für 5 min. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2-6 mL Kulturmedium mit 1 % (V/V) Gentamycin. Bestimmen Sie die Zellenzahl manuell durch zählen Zellen in einem Hemocytometer und Samen 6 x 105 Zellen in einer T75 Zelle Kultur Kolben.</li>
</ol>3. Anbau von primären Keratinozyten
<ol><li>Inkubieren Sie primären Keratinozyten in Schritt 2.3 in einer Zelle Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 in Keratinozyten Medium ohne FCS, um 50-70 % Konfluenz isoliert.</li>
	<li>Um die Keratinozyten sorgfältig die passage des Mediums zu entfernen, geben Sie 5 mL PBS-EDTA und die Zellen für 10 min bei 37 ° c inkubieren Überprüfen Sie, ob Zellen begonnen haben, trennen Sie den Kultur-Kolben unter einem Lichtmikroskop (4 X Vergrößerung: Zellen abgerundeten erscheint aber noch befestigt!). Wenn dies nicht der Fall ist, ersetzen Sie alte PBS-EDTA mit frischen PBS-EDTA und erneut für weitere 10 Minuten bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Geben Sie 5 mL 1 X Trypsin-EDTA zu den abgerundeten Zellen noch bedeckt mit 10 mL PBS-EDTA und wieder lang 1-3 min bei 37 ° c inkubieren Die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 1 mL FCS zu stoppen und die freistehenden Zellen in einem 50 mL konische Röhrchen sammeln. Die Zellen bei 200 X g für 5 min zentrifugieren, das Pellet in Keratinozyten Medium und 6 x 105 Samenzellen in einer frischen T75 Zelle Kultur Flasche aufzuwirbeln. Hinweis: Um organotypischen Haut rekonstruiert zu erzeugen, sollte die primären Keratinozyten spätestens 3-4 Durchgang verwendet werden.</li>
</ol>4. Isolierung der primäre Fibroblasten aus der Dermis
<ol><li>Schneiden Sie das Hautgewebe (Abschnitt 1.3) in kleinere Stücke (1 mm2) und übertragen Sie sie in ein 50 mL konische Röhrchen. 10 mL Kollagenase-Lösung (5 U/mL PBS+) hinzufügen und 45 Minuten im Wasserbad bei 37 ° c inkubieren Zentrifugieren Sie die Mischung von Gewebe und Zellen bei 200 X g für 5 min.</li>
	<li>Waschen Sie die Zelle Pellet zweimal mit 10 mL DMEM mit 4,5 g/L Glucose und L-Glutamin, aber ohne L-Pyruvat. Schließlich erneut die Gewebe-Stücke in 2 mL DMEM mit 10 % FCS 1 % (V/V) Gentamycin. In einem T25 Zelle Kultur Kolben übertragen Sie und inkubieren sie über Nacht in einer Zelle Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 . Hinweis: Das geringe Volumen ermöglicht die Fibroblasten, aus dem Gewebe-Schutt zu migrieren und zwingt sie in den Kultur-Kolben befestigen.</li>
	<li>Am nächsten Morgen fügen Sie ein weiteres 6 mL DMEM/Gentamycin/FCS hinzu und 2-3 Tage bei 37 ° C inkubieren Sie, bis die Zellen 80-90 % Konfluenz erreicht haben.</li>
</ol>5. Anbau der primäre Fibroblasten
<ol><li>Durchgang der Fibroblasten, entfernen das Medium und adhärente Zellen mit PBS waschen. Geben Sie 5 mL 1 x Trypsin-EDTA und 3 min bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 5 mL DMEM/FCS zu stoppen und die freistehenden Zellen in einem 50 mL konische Röhrchen sammeln. Die Zellen bei 200 X g für 5 min zentrifugieren, Aufschwemmen das Pellet in DMEM Medium, und Saatgut 6 x 105 Zellen in einer frischen T75 Zelle Kultur Kolben. Hinweis: Um organotypischen Haut rekonstruiert zu erzeugen, sollte die primäre Fibroblasten spätestens 4-6 Gang verwendet werden.</li>
</ol>6. Generation der 3D Melanom Sphäroide über der hängenden-Drop-Methode
<ol><li>Kultur Melanomzellen (z.B., 451-LU oder irgendwelche Melanom-Zell-Linie von Interesse) nach allgemeine Protokolle, mit RPMI mit 10 % FCS15.<ol>
<li>Um Melanom Sphäroide von ähnlicher Größe und Qualität zu erzeugen, waschen Sie die Melanomzellen in PBS, fügen Sie 5 mL 1 X Trypsin-EDTA mit PBS-Puffer für die Zellen in einem T175 Zell-Kultur-Kolben und inkubieren Sie für ca. 3-5 min bei Raumtemperatur (RT). Neutralisieren Sie die Trypsin durch Zugabe von 5 mL RPMI/10% FCS. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 200 X g für 5 min. die Zelle Pellet in RPMI/FCS eine Endkonzentration von 10.000 Zellen/mL als durch auszählen in einem Hemocytometer wieder aussetzen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>40 x 25 µL (= 250 Zellen) der Zellsuspension auf der inneren Oberfläche des Deckels eine sterile nichtklebenden Zelle Kulturschale (Ø 10 cm) mit einer elektronischen Multi-Pipette zu erkennen. Drehen Sie mit einer schnellen aber glatte Bewegung den Deckel um und legen Sie sie auf der jeweiligen Zelle Kulturschale mit 5 mL PBS.<ol>
<li>Kultur "hängenden Tropfen Gerichte" in eine Zelle Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 10-14 Tage, je nach Zelltyp verwendet. Hinweis: Zellen aus der MM-Wachstumsphase in der Regel schneller wachsen und bilden solidere Sphäroide in den hängenden Tropfen gegenüber Melanomzellen RGP oder VGP abgeleitet. Beachten Sie bei individuellen Bewertung Sphäroid Wachstum unter Fernglas oder unter einem Lichtmikroskop (4 X Vergrößerung). Sphäroide werden in der Regel nach 48 h unter Fernglas oder unter einem Lichtmikroskop (4 X Vergrößerung) nachweisbar. Nach 10-14 Tagen sind sie ohne Vergrößerung Gerät sichtbar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 Tage nach dem ersten Tropfen Schmierblutungen hinzufügen 10 µL des frischen RPMI/10% FCS-Medium zu jedem Tropfen. Anschließend tauschen Sie 10 µL Medium jeden zweiten Tag. Die Verwendung von einem elektronischen Dispenser ist sehr hilfreich in diesem Schritt.</li>
	<li>Je nach Zelltyp ernten Sie die Sphäroide (siehe Abschnitt 10) nach 10-15 Tagen durch sanft abspülen des Zelle Kultur Schale Deckels mit PBS. Sammeln sie in einer Kulturschale nichtklebenden Frischzellen. Hinweis: Die Anbau Zeit richtet sich nach der Tumor Wachstumsphase der Melanomzellen Wenn sie zunächst abgeleitet wurden, z.B.Sphäroide abgeleitet von 451-LU Zellen wachsen, um etwa 500 µm im Durchmesser innerhalb von 12 Tagen der Kultivierung in den hängenden Tropfen15 .</li>
</ol>7. Generation von dermalen Abteil des organotypischen voll Haut rekonstruiert
<ol><li>Generieren Sie hautmodelle mit 24 Wohlen Zelle mikroporösen Membran Einsätze (pore Größe 8 µm) in 24-Well Platten gelegt. Hinweis: Stellen Sie sicher, nicht hängend zu verwenden aber ständigen Einsätze, weil sie in einer 6-Well-Platte für den Luft-Flüssigkeit Anbau zu einem späteren Zeitpunkt gestellt werden.</li>
	<li>Bereiten Sie das Gel Neutralisation Lösung (GNL)15sowie die Nährmedien als MM und endothelial Wachstum Medien (EGM)16,17bezeichnet. Um die Gerinnung zu verhindern, laden das Kollagen Typ I (in der Regel von Rattenschwanz, 3,5-4 mg/mL in 0,02 N Essigsäure) auf Eis bis zum Gebrauch, denn es beginnt zu Gelieren bei RT</li>
	<li>Neu 1 x 105 Fibroblasten pro Einsatz in GNL und mischen Sie schnell die Zellsuspension mit Kollagen in einem Verhältnis von 1:3 in einem Endvolumen von 500 µL/einfügen. Mix von sanft pipettieren rauf und runter, um Blasenbildung zu vermeiden, da Luftblasen die Qualität der Haut beeinträchtigt zu rekonstruieren.</li>
	<li>Lassen Sie die einzelnen dermal Gele, indem man sie ohne Medium bei RT für 30 min in einem sterilen Abzug zu begleichen. Decken Sie anschließend jedes Gel mit DMEM mit 4,5 g/L Glukose, 1 % L-Glutamin, 10 % FCS, und ohne L-Pyruvat, und über Nacht bei 37 ° c inkubieren</li>
</ol>8. Generation der epidermalen Abteil des organotypischen voll Haut rekonstruiert
<ol><li>Am nächsten Tag entfernen Sie das Medium aus der dermalen Gele und equilibrate sie mit EGM Medien (10 % FCS, 1 % PenStrep, 10 mg/mL Gentamicin) für 2 h bei 37 ° C. Zurückziehen Sie des Mediums und Samen Sie sorgfältig 1 x 105 Keratinozyten in 100 µL EGM auf die dermale Gel Nukleinsäuretablette.</li>
	<li>Inkubieren Sie rekonstruiert für 1,5 h bei 37 ° C um die Keratinozyten zur Einhaltung der dermalen Kompartiment zu ermöglichen. Hinweis: Während dieser Inkubationszeit beginnt die Gele zu schrumpfen durch Fibroblasten-induzierten Kontraktion und somit zumindest teilweise von den Wänden einfügen lösen.</li>
	<li>Decken Sie die Haut Entsprechungen mit rund 800 µL EGM und entfernen Sie vorsichtig das restliche Gel aus der einfügen-Wand mit einer kleinen (weiß) PIPETTENSPITZE. Die Haut-äquivalente untergetaucht in EGM für 7 Tage in einer Zelle Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2, Kultur und das Medium täglich verändern. Hinweis: Während dieser Zeit werden die Haut Entsprechungen deutlich schrumpfen.</li>
</ol>9. Air-Liquid-Anbau von organotypischen voll Haut rekonstruiert
<ol><li>Am Tag 8 Übertragung jedes stecken Sie in einem einzelnen Brunnen einer 6-Well-Platte. Nur fügen Sie 1,2-1,4 mL MM Medium jedes gut hinzu, so dass die Haut zu rekonstruieren ist mit Medium von der Unterseite des Brunnens geliefert, aber nicht mit Medium fällt. Hinweis: Anbau an der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle ermöglicht Schichtung der epidermalen Teil und Einrichtung einer vollen Hornschicht (Stratum Corneum).</li>
	<li>In den nächsten Tagen von 10-17 verändern Sie das Medium wie in Abschnitt 9,1 jeden zweiten Tag. Während dieser Zeit fügen Sie Drogen oder andere Reize bei Bedarf auf das Medium. Entfernen Sie vorsichtig die volle Haut rekonstruieren aus dem mikroporösen Membran einfügen gebogenen Pinzette für weitere Analysen, z.B.immunhistochemische Analyse (Abbildung 1).</li>
</ol>10. Generation der organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodelle
<ol><li>Melanom Sphäroide in der dermalen Fach des organotypischen volle Haut rekonstruiert zu integrieren, spülen Sie sorgfältig die Sphäroide (nach Schritt 6.4) den Deckel der hängenden Tropfen Zelle Kulturschale mit PBS. Sammeln Sie 10-20 Sphäroide/einfügen in eine sterile Zelle nichtklebenden Kulturschale. Entfernen Sie vorsichtig die übermäßige PBS mit einer Pasteurpipette.</li>
	<li>Aspirieren Sie die Sphäroide in die kleinstmögliche Volumen der EGM. Zu diesem Zeitpunkt beobachten Sie und zählen Sie die Sphäroide mit bloßem Auge, ohne jede weitere Vergrößerung Gerät. Nehmen Sie 10-20 Sphäroide pro Haut Modell/Gel, wie in Schritt 10.1 angegeben.</li>
	<li>Übertragen Sie sie auf die gewünschte Lautstärke GNL mit Fibroblasten (während Schritt 7.3) und mischen mit dem Kollagen Typ ich. Von diesem Schritt auf wie in den Abschnitten 7.3-9.1 beschrieben vorgehen. Hinweis: Tumor Sphäroide werden sichtbar in der dermalen Gel als weiße Flecken (Abbildung 2)</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell hier vorgestellten garantiert neue Erkenntnisse für ein tieferes Verständnis der Intra-Tumor und Tumor-Wirt-Interaktion, und bieten eine erweiterte Screening-Plattform zur Untersuchung von molekularer Mechanismen der Tumorentstehung und Therapieresistenz in der Zukunft.
Um die beste Garantie physiologische und rekonstruiert in Vivo Bedingungen der Haut imitiert, die Qualität der PV-Zellen ist von größter Bedeutung. Wie bereits erwähnt, juvenile oder pränatale Hautzellen zeigen die niedrigsten Differenzierungsgrad und eignen sich daher am besten, voll-dicke Haut Entsprechungen zu generieren. Die erste mögliche Qualitätskontrolle ist das Ausmaß der dermalen Kontraktion am 2. Tag nach der Aussaat der Keratinozyten und äquilibrierung das Gel EGM (Protokoll Abschnitte 8.2 und 8.3). Dermale Gele werden am meisten mit der besten Qualität von Fibroblasten schrumpfen. Auch kann die Integration der zu wenige oder zu viele Fibroblasten dermal Kontraktion und folglich Befestigung der der epidermalen, dermalen Kompartiment beeinträchtigen. Dies beeinträchtigt wiederum epidermalen Differenzierung, weil dieser Prozess eine umfangreiche Übersprechen zwischen den dermalen und epidermalen Zellen erfordert.
Die Qualität von Primärzellen hängt auch die Zelle Konfluenz sowie die Passage der Zellen. Wenn Keratinozyten, ≥80 % Konfluenz angebaut werden sie sofort stoppen, wuchernden und beginnen zu unterscheiden. Es ist daher wichtig Kultur sie zu 40-70 % Konfluenz während passagierung und verwenden Sie sie nicht später als Durchgang 3-4. Fibroblasten sind weniger empfindlich, aber sollte nicht später als 4-6 Durchgang verwendet werden. Bitte beachten Sie, dass alle Primärzellen und Zelllinien zur Erzeugung von organotypischen Melanom Sphäroid hautmodelle kultiviert sind frei von Antibiotika, und daher ist das Kontaminationsrisiko hoch. Aber die Zugabe von Antibiotika ändert sich die Physiologie der einzelnen Zellen und reduziert somit die Qualität der Haut Entsprechungen.
Im Allgemeinen ist Sphäroid Tumorbildung möglich aus fast allen Arten von Tumor-Zell-Linien und auch von Tumorzellen, die frisch von Patientenmaterial isoliert. Die erste Zelle Nummer bzw. Anbau Zeit für die Gewinnung optimaler Sphäroid Größen variieren je nach Zelltyp verwendet. Bis zu einer Größe von 150-200 µm können alle Zellen in einem Sphäroid enthalten noch ausreichend mit Nährstoffen durch einfache Diffusion versorgt werden. Nur Sphäroide mit Größen ≥500 µm zeigen ein hohes Maß der Zelldifferenzierung und typischen Merkmale nicht durchblutet Tumor Gewebe22vertreten.
Die organotypischen Melanom-Sphäroid-Haut-Modell entwickelt, hier eignet sich besonders zur Tumor-Wirt Interaktionen zu untersuchen und für Melanom Drogentests unter in Vivo-Bedingungen15mag. Dennoch ist die Umgebung des Melanoms in Vivo noch komplexer, beherbergen eine Vielzahl von Zelltypen Tumor verbunden sind, einschließlich der Immunzellen und Endothelzellen. Da die Zugabe der richtigen primären Immunzellen Problemen mit Histocompatibility konfrontiert ist, sind diese Modelle noch nicht in der Lage, angemessen zu überwachen, immun-therapeutische Ansätze.
Dennoch, Melanom Sphäroide aus frisch isolierte Patientenmaterial generiert werden und nach in die volle Haut zu rekonstruieren, kann dienen als individuelle Drug screening Plattformen. Auch die Integration der Stücke von Melanom-Metastasen in Haut rekonstruiert ist denkbar, Medikamenten-Kombinationen in einer maßgeschneiderten Therapieansatz zu testen. Einschließlich organotypischen 3D-Modell Haut Melanom in der präklinischen Prüfung dürfte dazu beitragen, dass nur die vielversprechendsten neuartige therapeutische Konzepte in klinischen Tests, vorangebracht werden wodurch die Ausfallrate von potenziellen neuen Behandlungen für diese Krankheit und Erhöhung der Therapieerfolg in klinischen Studien.

Die menschliche Haut besteht aus zwei verschiedenen Fächern, die unterschiedliche Funktionen im Schutz des Körpers vor nachteiligen Auswirkungen auf die Umwelt1dienen. Die untere dermale Fach besteht aus einer Fibro-elastisches Bindegewebe. Es besteht aus lose miteinander verbundenen Kollagen und Elastin-Fasern von Fibroblasten, dient eine mechanische Barrierefunktion synthetisiert. Die Dermis ist von der oberen Epidermis durch die Basallamina getrennt als eine extrazelluläre Matrix durch eine ständige Kommunikation zwischen beiden Kammern der Haut produziert wird. Im Gegensatz zu der Dermis Epidermis ist ein Plattenepithel besteht hauptsächlich aus Keratinozyten und kann in vier Schichten unterschieden werden. Das Stratum Basale besteht aus undifferenzierten basalen Keratinozyten, die ständig aus Vorläuferzellen der Haut durch die Stadien des Stratum Spinosum und Stratum Granulosum in Stratum Corneum stratifiziert , schützen den Körper vor Austrocknung und Infektionen2. Melanozyten sind ausgerichtet auf die Basalmembran und kommunizieren über dendritische Erweiterungen mit mehreren Keratinozyten. Sie produzieren das Pigment Melanin zum Schutz der Haut vor den schädlichen Auswirkungen der UV-Strahlung, wie Hautalterung, Immunsuppression, Entzündung und Induktion von nicht-Melanom-Hautkrebs. UV Strahlungen Beitrag zur Transformation der Melanozyten, malignes Melanom, ist jedoch noch in der Diskussion3.
Melanom Entwicklung differenziert nach verschiedenen Tumorstadien Fortschreiten, und von bestimmten genetischen, morphologischen und histologischen Veränderungen4gekennzeichnet. Sie stammen entweder de Novo oder von einer angeborenen oder erworbenen Nävus aufgrund einer lokalen erhöhen der Melanozyten Proliferation verursachen gutartige Neoplasie. Diese Vorstufe Läsion kann wandeln in strukturell veränderten dysplastische Gewebe werden Zellen, die zu der ersten malignen Phase der radialen Wachstumsphase (RGP) fortsetzen kann. Diese frühen Tumor Progression Phase zeichnet sich durch Zellen vermehren Radial innerhalb der Epidermis, zeigt einige lokal invasive Zellen innerhalb der papillären Dermis. Während der anschließenden vertikales Wachstum Phase (VGP) Melanom zeigen Zellen bereits metastasierendem und invasiven Phänotyp durch das brechen durch die Basallamina, die tieferen Bereiche der Dermis sowie die Unterhaut5zu infiltrieren. Schließlich stellt metastasierendem Melanom (MM) die aggressivste Progression-Bühne mit metastasierenden Zellen systemisch Verbreitung im gesamten System der Blut- und Lymphzirkulation, Organe wie Leber, Lunge und Gehirn6nach distal zu erobern.
Früherkennung, gefolgt von einer Operation bleibt bis heute die effektivste Therapie des malignen Melanoms. Die Prognose bei Patienten mit Fernmetastasen, bleibt allerdings besonders schlecht7, weil klassische Chemotherapie-Regimen nur wenig überleben nutzen8,9übertragen. Allerdings haben die jüngsten Fortschritte in zielgerichtete Therapien nach Jahrzehnten der Stagnation, die Prognose des malignen Melanoms erheblich verbessert.
Dysregulation der zwei wichtige Mitogen aktiviert Signalwege, die RAS-RAF-MEK-ERK und die Signalwege PI3K-AKT-PTEN präsentieren Schlüsselfaktoren der Melanom-Progression, zumal konstitutiv Punktmutationen des Proto-oncogenes BRAFV600 aktivieren und NRB sind vorhanden10. Entsprechend versprach die Erfindung des gezielten Kinase-Inhibitoren therapeutischen Nutzen für Patienten mit metastasierendem Melanom. Eine Vielzahl von klinischen Studien zu diesem Punkt hat erhebliche Vorteile für Patienten mit metastasierendem Melanom nicht erreicht. Fast alle Antworten sind teilweise mit einer Subpopulation von Patienten mit primären Widerstand. Darüber hinaus wurde die Übernahme von sekundären Widerstand bis zum Rezidiv führt in der Mehrzahl der Patienten11,12beobachtet.
Es wird klar, dass Analyse der Mutationsstatus allein nicht ausreichen, um die stärkste therapeutische Strategie zu entwickeln. Neue schnelle und zuverlässige Diagnose-Tools sind notwendig, um systematisch erfassen und analysieren die Reaktionsfähigkeit der einzelnen Krebszellen. Die überwiegende Mehrheit der derzeit verfügbaren Daten zur menschlichen Melanom wurden aus zweidimensionalen (2D) Melanom Zellkulturen gewonnen. Tumorzellen, jedoch gewachsen in 3D ermöglichen interzellulären Übersprechen zwischen differenzierte Krebs Zelle Subpopulationen sowie zwischen Krebszellen und die nicht-transformierten umliegende Wirtsgewebe. Daher wäre es am besten, die 3D-Umgebung zu rekonstruieren, in dem das Melanom entwickelt, als eine präklinische Screening verwendet werden, Modell13,14.

<table><tbody><tr><td>fetal serum albumin (FCS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>add 10 % to cell culture medium</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td>1X dilute in PBS</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61870010</td><td>for cultivation of melanoma cell lines</td></tr><tr><td>DMEM&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965062</td><td>for cultivation of primary fibroblasts</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco life technologies&amp;nbsp;</td><td>17105041</td><td>2U/ml, dissolve in PBS</td></tr><tr><td>Collagen type I</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td>usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml</td></tr><tr><td>24-well inserts Nunclon&amp;nbsp;</td><td>Nunc</td><td>140629</td><td>8 &amp;micro;m pore size; use standing, not hanging inserts!</td></tr><tr><td>cell strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>yellow</td></tr><tr><td>Gentamycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15750060</td><td>dissolve in PBS</td></tr><tr><td>Keralife keratincyte medium</td><td>Cell Systems</td><td></td><td>do not add FCS or antibiotics</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td>NB4 standard grade</td></tr><tr><td>juvenile human keratinocytes</td><td>Cell Systems</td><td>FC-0007</td><td>alternative to own preparation from juvenile foreskin</td></tr><tr><td>juvenile human fibroblasts</td><td>Cell Systems</td><td>FC-0001</td><td>alternative to own preparation from juvenile foreskin</td></tr><tr><td>DMEM&lt;br/&gt; [+] 4,5 g/l Glucose,&lt;br/&gt; [+] L- Glutamine,&lt;br/&gt; [-] L- Pyruvate</td><td>Gibco life technologies</td><td>41965</td><td>mix 1:1 with Ham&amp;acute;s F-12 for MM medium;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; mix 3:1 with Ham&amp;acute;s F-12 for EGM medium</td></tr><tr><td>Ham&amp;acute;s F-12 [+] L-Glutamine</td><td>Gibco life technologies</td><td>&amp;nbsp;21765-029</td><td>add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15)</td></tr><tr><td>EGF&amp;nbsp;</td><td>Gibco life technologies</td><td>&amp;nbsp;13247-051</td><td>add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Merck Chemicals</td><td>2381</td><td>add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium</td></tr><tr><td>Selenic acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>18851</td><td>add 53 nM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Lilly</td><td>HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml</td><td>add 5 &amp;micro;g/ml for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>E-0135</td><td>add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>P-Ethanolamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-0503</td><td>add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Holo-Transferrine</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T-0665</td><td>add 5 &amp;micro;g/ml for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Triiodthyronine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6397</td><td>add 20 pM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-088816</td><td>add 0.4 &amp;micro;g/ml for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8783</td><td>add 10 nM only for the generation of EGM medium</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3784</td><td>add 15 mM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Serine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4311</td><td>add 1 mM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Cholinchloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C-7017</td><td>add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>dFCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-0392 Lot 086K0361</td><td>add 2 % for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A-9795</td><td>add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>PromoCell</td><td>C-42209</td><td>add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>Strontiumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255521</td><td>add 1 mM for the generation of EGM and MM medium</td></tr><tr><td>anti cytokeratin 10 antibody</td><td>Dako</td><td>M7002</td><td>1:50</td></tr><tr><td>anti cytokeratin 14 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53253</td><td>1:200</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;anti laminin 5 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32794</td><td>1:50</td></tr><tr><td>anti filaggrin antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-13440</td><td>1:50</td></tr><tr><td>anti involucrin antibody</td><td>Acris Antibodies</td><td>AM33368PU</td><td>1:50</td></tr><tr><td>secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-C153907</td><td>1:50</td></tr><tr><td>secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-165-003</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10236276001</td><td>1:100</td></tr></tbody></table>

a 3d organotypic melanoma spheroid skin model

Maligne Transformation der Melanozyten, die Pigmentzellen der menschlichen Haut verursacht Bildung eines Melanoms, einen sehr aggressiven Krebs mit metastasiertem Potenzial. Vor kurzem, Mono-Chemotherapien weiterhin von Melanom spezifische Kombinationstherapien mit gezielten Kinase-Inhibitoren verbessern. Dennoch bleibt metastasierendem Melanom eine lebensbedrohliche Krankheit weil Tumoren primäre Resistenz aufweisen oder entwickeln Resistenz gegen neuartige Therapien, damit wieder tumorigenic Kapazität. Um den therapeutischen Erfolg des malignen Melanoms zu verbessern, ist die Bestimmung der molekularen Mechanismen, die Übertragung der Resistenz gegen herkömmliche Behandlungsansätze notwendig; jedoch braucht es innovative zelluläre in-vitro- Modelle. Hier stellen wir eine in-vitro- dreidimensionale (3D) organotypischen Melanom Sphäroid Modell, das kann die in Vivo -Architektur des malignen Melanoms darzustellen und kann neue Erkenntnisse rechtfertigen Intra-Tumor sowie Tumor-Wirt Interaktionen. Das Modell enthält definierte Anzahl von Reifen und differenzierte Melanom Sphäroide in einem 3D voll Menschenhaut Wiederaufbau Modell bestehend aus primären Hautzellen. Die zelluläre Zusammensetzung und Differenzierung Status des eingebetteten Melanom Sphäroide ähnelt der eines kutanen Melanom Metastasen in Vivo. Mit diesem organotypischen Melanom Sphäroid Modell, wie ein Drogen-screening-Plattform die Identifizierung der Responder zu unterstützen kann Kombinationstherapien, während erspart unnötige Behandlung Belastung für non-Responder, wodurch des Vorteils ausgewählt therapeutische Interventionen.

Erfolgreicher Behandlung von Melanomen Metastasen kann durch das Übersprechen zwischen Tumorzellen sowie zwischen Tumor und nicht-transformierten Wirtszellen beeinflusst werden. Organotypischen Modelle von Krebs in Vitro zu entwickeln soll geeignete präklinische Testsysteme bereitstellen, die die 3D Organisation und Komplexität der menschlichen Melanom rekapitulieren in-vivo. Dies ermöglicht die Untersuchung der therapeutischen Wirkung auf den Tumor innerhalb einer organotypischen Umgebung und die negativen Auswirkungen auf das umliegende Gewebe der primären parallel.
Um die besten organotypischen hautmodelle zu entwickeln, ist die Qualität der PV-Zellen entscheidend. Es ist vorteilhaft, juvenile primäre Fibroblasten und Keratinozyten, zu verwenden, weil sie in der Regel weniger im Vergleich zu Erwachsenen primäre Hautzellen unterscheiden. Juvenile Haut Zellen können entweder isoliert von juvenile Vorhaut wie beschrieben im Abschnitt "Protokoll" 1-5, sondern auch werden von Firmen wie pränatale primäre Fibroblasten und Keratinozyten erworben. Wenn Kauf, ist es notwendig, Bestellung Zellen von verschiedenen Spendern Spender-spezifische Ergebnisse, z.B.für Drogen Empfindlichkeit zu vermeiden. Das gesamte Protokoll wird als ein Schema in Abbildung 3dargestellt.
Qualitätskontrolle von 3D Full-Haut-äquivalenten erfordert immunhistochemische Analyse. Ein erster Eindruck erhalten Sie durch die Hämatoxylin-Eosin (H & E) Färbung von Paraffin eingebettet Abschnitte (3 µm). Detaillierte Analyse der Qualität der epidermalen Differenzierung und Bildung von der Basallamina zwischen Dermis und Epidermis erfordert immunhistochemische Analyse mit spezifischen Antikörpern gegen einen epidermalen Schichtung-Marker. Dies ermöglicht Unterscheidung zwischen undifferenzierte, hoch proliferativen Zellen liegt in der Nähe der Basalmembran und sehr differenziert und keratinized Zellen an das Stratum Corneum durch die Bildung von epidermalen Schichten dazwischen . Dargestellt durch immun-histologische Färbung (Abbildung 4), Differenzierung der Keratinozyten in der Epidermis ähnlich wie normale Haut erzielt werden konnten: vor allem die undifferenzierten Zellen aus den unteren epidermalen Schichten (Schicht Basale und Stratum Spinosum) positiv für Keratin 14, färben, während die differenzierteren Zellen aus den supra basalen Schichten (Stratum Granulosum und Stratum Corneum) 10 und Involucrin positiv für Keratin färben. Dementsprechend konnte die Filaggrin Färbung nur in hoch differenzierten Zellen des Stratum corneumsbeobachtet werden. Am wichtigsten ist, zeigt Laminin 5 Färbung, dass eine Basallamina generiert wurde, um mit dermalen Abteil des kunsthaut rekonstruieren physiologisch der epidermalen verbinden. Dies beweist, dass eine Verbindungstür organotypischen Mikroumgebung Host Melanomzellen oder Sphäroide für physiologische und pathophysiologische Analyse generiert wurde.
Zum Zwecke der Melanom-Drogen-Screening, können einzelne Melanomzellen auch in der Dermis volle Haut äquivalente erlauben de Novo Melanom Nest Bildung18,19integriert werden. Daher sind Melanomzellen kombiniert mit primäre Fibroblasten in einem Verhältnis von 5:1, zusammen mit 200 X g für 5 min zentrifugiert und Nukleinsäuretablette in GNL vor dem Vermischen mit Kollagen. Infolgedessen bilden die Melanom-Zelle-Nester spontan in der dermalen Kompartiment. Unserer Erfahrung nach phase nur Zellen des metastasierten Wachstums Form richtige Nester, im Vergleich zu Melanomzellen RGP oder VGP15. Ein großer Nachteil dieser Art von Modellen die Tatsache, die die Anzahl und Größe der Melanom-Nester gebildet können nicht vorhergesagt werden ist, variieren zwischen den einzelnen Haut rekonstruiert, unabhängig von jeder Behandlung. Zum Beispiel können 1.000 Zellen ausgesät in der dermalen Fach 10 Nester bestehend aus 100 Zellen oder 100 Nester, bestehend aus 10 Zellen jeweils (Abbildung 5) gewinnen. Diese biologischen Variablen präsentieren mit drei Mängel: Erstens die Anzahl und Größe der Melanom-Nester gebildet sind unvorhersehbar; Zweitens die Metastasen in Vivo sind meist größer als Melanom Nester und zeigen vielfältige komplexer Intra-Tumor; und drittens durch die begrenzte Lebensdauer der Tumor-Nest Modelle Behandlung wird frühzeitig eingeleitet, und folglich eher hemmt Tumor Auswuchs statt verursacht Rückbildung von bestehenden Tumor Nester.
Um diese Einschränkungen organotypischen Melanom Sphäroid hautmodelle überwinden kann generiert werden. Durch die Kultivierung 250 metastasierendem Melanom Zellen in einer hängenden für 14 Tage20fallen, werden Sphäroide reproduzierbar erzeugt bestehend aus lebensfähigen Melanom, die Zellen präsentiert einen kompakten Aufbau mit einem Enddurchmesser von etwa 500 µm imitiert nicht durchblutet Tumor-Knoten, Mikro-Metastasen oder Inter Kapillare Mikro Regionen von soliden Tumoren21,22. In der Regel Melanom-Zell-Linie eignet sich für die Generation der Sphäroide über das HÃ ¤ ngen drop-Methode; Allerdings Zellen abgeleitet weiter fortgeschritten metastasiertem Tumor Stadien Form fester Sphäroide verglichen mit Zelllinien aus Fortschreiten Anfangsphase, z. B.die RGP.
Für einige Zellen ist es vorteilhaft für richtige Sphäroid Bildung zur Verbesserung der Viskosität der hängenden Tropfen Kulturmedium. Dies kann durch die Zugabe von 10-50 % Methylcellulose auf dem Kulturmedium erreicht werden. Für die Methylcellulose Stammlösung Autoklaven 1,2 g Methyl-Zellulose zusammen mit einer magnetischen rühren Bar in einer 100 mL-Glasflasche. Hinzufügen von 100 mL vorgewärmten (60 ° C) Medium und rühren für 20 min bei Raumtemperatur und eine weitere 1-2 h bei 4 ° c Die Stammlösung für 2 h bei 5.000 x g zentrifugieren und viskosen Überstand bei 4 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.
Ordnungsgemäße Validierung von volle Haut Melanom Sphäroid Modellen erfolgt durch die Tatsache, dass eine definierte Anzahl von Melanom Sphäroide können - zumindest statistisch gesehen - in der dermalen Fibroblasten/Kollagen integriert werden, die ich am 1. Tag des Haut-Modellbau, Gerüst ermöglicht Sie während der epidermalen Differenzierung für 25-27 Tage gemeinsam zu entwickeln. Die Ausbeute an Sphäroide kann direkt nach der Aussaat, analysiert werden, weil Sphäroide erscheinen als weiße Flecken innerhalb der transparenten dermal gel und ohne Vergrößerung Gerät (Abbildung 2) gesehen werden können. Dadurch entsteht eine 3D Hautmodell, dass Häfen Reife Melanom Sphäroide, die kultivierten in Vitro für insgesamt ca. 42 Tage, zeigt das höchste Niveau der Intra-Tumor war-Differenzierung15 Zell.
H & E Färbung der Haut Melanom Sphäroid Modell zeigt die histologischen Erscheinungsbild und zelluläre Verteilung von Melanom Sphäroide sehr ähnlich dem menschlichen Melanom nicht durchblutet Haut Metastasen in Vivo15 (Abbildung 6 zu ). Zwei Subpopulationen von Melanomzellen sind unter diesen Bedingungen deutlich zu unterscheiden: einer peripheren wuchernden Subpopulation und einer zentralen Subpopulation, hauptsächlich bestehend aus geschrumpft, Apoptotic oder nekrotischen Zellen bilden die so genannte "nekrotische" Zentrum. -Proteins Leben und vermehren Subpopulationen detektiert werden mit Antikörpern gegen die Verbreitung Marker KI-67, während Zellen des nekrotischen Center von TUNEL-Färbung15visualisiert werden können. Diese besondere Verteilung der Tumor Zelle Subpopulationen gerechtfertigt ist durch die Sphäroid Größe (≥500 µm), durch einen Mangel an Nährstoffen und Sauerstoff im zentralen Teil denen katabolen Abfall ansammelt. Nach dem Protokoll, sofern hier die Generierung von eine zuverlässige und reproduzierbare organotypischen erlaubt eingebettet voll Dicke Menschenhaut Modell mit menschlichen Melanom Sphäroide, die menschlichen Melanom Haut Metastasen zu imitieren. Anwendungen von diesem Modell gehören Drogentests, screening von Toxinen, kosmetische Substanzen beeinflussen oder laser-Therapie auf Melanom Auswuchs und Behandlung.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig1.jpg"> Abbildung 1 : Anbau von 3D organotypischen Haut rekonstruiert untergetaucht mit Medium und an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit. Am Tag 0, die primären Keratinozyten auf der Oberseite der dermalen Kompartiment bestehend aus primären Fibroblasten entkernt sind eingebettet in eine Kollagen-Typ ich Matrix. 3D Haut rekonstruiert kultiviert mit EGM für 7 Tage unter Wasser zu bleiben, trennen Sie die Insert-Wand und schrumpft. Am Tag 8 sind die Einsätze auf 6-Brunnen übertragen und an der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle erlauben epidermalen Schichtung kultiviert. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig2.jpg"> Abbildung 2 : Melanom Sphäroide eingebettet in das dermal Fach als weiße Flecken erscheinen. Während der Vorbereitung der dermalen Fachs des 3D Haut rekonstruieren, eine definierte Anzahl von Melanom Sphäroide Fibroblasten Kollagen Typ hinzugefügt werden kann mischen ich. Sobald das dermale Gel gelegt hat, werden Melanom Sphäroide als weiße Flecken sichtbar.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig3.jpg"> Abbildung 3 : Schema der 3D organotypischen Haut Modellbau. Die Hautprobe Fettgewebe entfernen und in kleine Stücke schneiden. Inkubation mit Dispase Lösung über Nacht bei 4 ° C erleichtert die Trennung der Epidermis von der Dermis. Isolierte primäre Fibroblasten und Keratinozyten sollte separat angebaut und zwischen Durchgang 4-6 und 3-4, bzw. verwendet werden. Anschließend kann die Generierung des Modells 3D Haut wie im Protokoll beschrieben vorgehen. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig4.jpg"> Abbildung 4 : 3D organotypischen Haut rekonstruiert zeigen eine Differenzierung Ebene ähnlich wie normale menschliche Haut. Paraffin Abschnitte Haut äquivalente (A) im Vergleich zu normalen menschlicher Haut (B) waren für den Ausdruck der Keratine 14 gefärbt (rot: λex 554 nm; λEm 568 nm) und 10, Involucrin (grün: λex 490 nm; λEm 525 nm ), Filaggrin (grün: λex 490 nm; λEm 525 nm), und Laminin 5 (grün: λex 490 nm; λEm 525 nm), und mit einem konfokale Fluoreszenzmikroskop analysiert. Zellkerne wurden visualisiert durch DAPI-Färbung (blau: λab 340 nm; λEm 488 nm). Immunhistochemische Untersuchung der 3D Full-dicke Haut äquivalente offenbarten richtige epidermalen Schichtung getrennten Schichten der Epidermis bildet, wie in der normalen menschlichen Haut zu sehen. Während Zellen aus den unteren epidermalen Schichten für Keratin 14 positiv gefärbt, unterschieden je mehr Zellen von der supra-Basalschicht zeigte Keratin 10 und Involucrin Färbung. Hoch differenzierte Zellen in der Nähe des Stratum corneums ausgedrückt Filaggrin. Laminin 5 Färbung zeigt, dass eine Basallamina erzeugt wird, um physiologisch der epidermalen dermalen Kompartiment (niedrigste Panel) herstellen. Diese Zahl wurde von Voersmann Et Al. übernommen 15 mit Erlaubnis. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig5.jpg"> Abbildung 5 : Die Anzahl und Größe der spontan gebildeten Melanom Nester können nicht vorhergesagt werden. De Novo Melanom Nest Bildung im dermalen Fach der volle Haut Mittel erreicht werden können, durch Mischen einer definierten Anzahl von Melanom-Zellen mit primäre Fibroblasten zum Einbetten von beiden Zelltypen in Kollagen Typ ich Matrix. Die Anzahl und Größe der spontan gebildeten Melanom Nester können nur von einer Reife 3D Haut rekonstruieren nach ca. 21 Tagen analysiert werden. Wie abgebildet aus zwei Proben (A) und (B), die Zahlen und die Größen der Melanom-Nester variieren zwischen den einzelnen Haut rekonstruiert. Infolgedessen ist es schwierig, diese Modelle zu validieren und die therapeutische Wirkung vorherzusagen. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig6.jpg"> Abbildung 6 : Melanom Sphäroide integriert Haut äquivalente rekapitulieren Hauptmerkmale des menschlichen kutanen Melanom Metastase. H & E gefärbt Paraffin Abschnitte des Tumors Sphäroide eingebettet in Haut äquivalente offenbart Sphäroide Hauptmerkmale mit nicht durchblutet menschlichen kutanen Melanom Metastasen in Vivozu teilen. Zwei Subpopulationen von Zellen sind deutlich erkennbar: eine periphere lebenden Subpopulation und zentrale Subpopulation, hauptsächlich bestehend aus geschrumpft, Apoptotic oder nekrotischen Zellen, die "nekrotische" Zentrum. Diese Verteilung der Tumor Zelle Subpopulationen garantiert der Sphäroid-Größe. Diese Zahl wurde von Voersmann Et Al. modifiziert 15 mit Erlaubnis. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell zu generieren, die sowohl die Architektur rekapituliert und mehrzelligen Komplexität einer Orgel/Tumor in Vivo aber gleichzeitig bietet Platz für systematische experimentelle Intervention.

Ein 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

a-3d-organotypic-melanoma-spheroid-skin-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

15.6K Aufrufe.  TU-Dresden. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell zu generieren, die sowohl die Architektur rekapituliert und mehrzelligen Komplexität einer Orgel/Tumor in Vivo aber gleichzeitig bietet Platz für systematische experimentelle Intervention.

Serie: A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells behave differently when they are grown within a 3D extra-cellular matrix and also interact with other cells (1-5). Mouse models have been broadly utilized to study tissue morphogenesis in vivo. However mouse and human skin have significant differences in cellular architecture and physiology, which makes it difficult to extrapolate mouse studies to humans. Since melanocytes in mouse skin are mostly localized in hair follicles, they have distinct biological properties from those of humans, which locate primarily at the basal layer of the epidermis. The recent development of 3D human skin reconstruct models has enabled the field to investigate cell-matrix and cell-cell interactions between different cell types. The reconstructs consist of a "dermis" with fibroblasts embedded in a collagen I matrix, an "epidermis", which is comprised of stratified, differentiated keratinocytes and a functional basement membrane, which separates epidermis from dermis. Collagen provides scaffolding, nutrient delivery, and potential for cell-to-cell interaction. The 3D skin models incorporating melanocytic cells recapitulate natural features of melanocyte homeostasis and melanoma progression in human skin. As in vivo, melanocytes in reconstructed skin are localized at the basement membrane interspersed with basal layer keratinocytes. Melanoma cells exhibit the same characteristics reflecting the original tumor stage (RGP, VGP and metastatic melanoma cells) in vivo. Recently, dermal stem cells have been identified in the human dermis (6). These multi-potent stem cells can migrate to the epidermis and differentiate to melanocytes.

In this report, we describe the three-dimensional skin reconstruct model which mimics human skin in architecture and composition. Melanocyte physiology, melanoma progression and the fate of dermal stem cells have been investigated using the skin reconstruct model. The model is also useful as a preclinical tool for drug assessment.

Die dreidimensionalen humanen Haut Rekonstruieren Modell: ein Tool für normale Haut und Melanom Progression Study

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Forschung

Biotechnik

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture vessels versus in vivo in human patients. This is due to the bottleneck selection of clonal populations of melanoma cells that can robustly grow in vitro in the absence of physiological conditions. Further, responses to therapy in two-dimensional tissue cultures overall do not faithfully reflect responses to therapy in melanoma patients, with the majority of clinical trials failing to show the efficacy of therapeutic combinations shown to be effective in vitro. Although xenografting of melanoma cells into mice provides the physiological in vivo context absent from two-dimensional tissue culture assays, the melanoma cells used for engraftment have already undergone bottleneck selection for cells that could grow under two-dimensional conditions when the cell line was established. The irreversible alterations that occur as a consequence of the bottleneck include changes in growth and invasion properties, as well as the loss of specific subpopulations. Therefore, models that better recapitulate the human condition in vivo may better predict therapeutic strategies that effectively increase the overall survival of patients with metastatic melanoma. The patient-derived xenograft (PDX) technique involves the direct implantation of tumor cells from the human patient to a mouse recipient. In this manner, tumor cells are consistently grown under physiological stresses in vivo and never undergo the two-dimensional bottleneck, which preserves the molecular and biological properties present when the tumor was in the human patient. Notable, PDX models derived from organ sites of metastases (i.e., brain) display similar metastatic capacity, while PDX models derived from therapy naive patients and patients with acquired resistance to therapy (i.e., BRAF/MEK inhibitor therapy) display similar sensitivity to therapy.

Patient-derived xenograft (PDX) models more robustly recapitulate melanoma molecular and biological features and are more predictive of therapy response compared to traditional plastic tissue culture-based assays. Here we describe our standard operating protocol for the establishment of new PDX models and the characterization/experimentation of existing PDX models.

Ein melanompatientenabgeleitetes Xenograft-Modell

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Krebsforschung

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro model in the study of cancer stem/initiating cells, preclinical cancer research, and drug screening. The 3D spheroid models are superior to conventional tumor cell culture and reproduce some important characters of real solid tumors. However, conventional 3D tumor spheroids are made up exclusively of tumor cells. They lack the participation of tumor stromal cells and have insufficient extracellular matrix (ECM) deposition, thus only partially mimicking the in vivo conditions of tumor tissues. We established a new multicellular 3D spheroid model composed of tumor cells and stromal fibroblasts that better mimics the in vivo heterogeneous tumor microenvironment and its native desmoplasia. The formation of spheroids is strictly regulated by the tumor stromal fibroblasts and is determined by the activity of certain crucial intracellular signaling pathways (e.g., Notch signaling) in stromal fibroblasts. In this article, we present the techniques for coculture of tumor cells-stromal fibroblasts, time-lapse imaging to visualize cell-cell interactions, and confocal microscopy to display the 3D architectural features of the spheroids. We also show two examples of the practical application of this 3D spheroid model. This novel multicellular 3D spheroid model offers a useful platform for studying tumor-stroma interaction, elucidating how stromal fibroblasts regulate cancer stem/initiating cells, which determine tumor progression and aggressiveness, and exploring involvement of stromal reaction in cancer drug sensitivity and resistance. This platform can also be a pertinent in vitro model for drug discovery.

A novel three-dimensional spheroid model based on the heterotypic interaction of tumor cells and stromal fibroblasts is established. Here, we present coculture of tumor cells and stromal fibroblasts, time-lapse imaging, and confocal microscopy to visualize the formation of spheroids. This three-dimensional model offers a pertinent platform to study tumor-stroma interactions and test cancer therapeutics.

Ein neuartiges Stromal Fibroblast-moduliertes 3D-Tumor-Sphäroid-Modell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Interaktion und der Arzneimittelforschung

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

Brustepithel- und Endothelzell-Sphäroide als potenzielles funktionelles In-vitro-Modell für die Brustkrebsforschung

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

<meta charset="utf8"></head><body>Vom Patienten stammende Melanom-Organoide: Eine Grenze in der Krebsimmuntherapie

Unveiling Therapeutic Opportunities with Melanoma Patient-derived Organoid Models

With the development of immunotherapy, there is an ongoing need to develop models that can recapitulate the tumor microenvironment of native tumors. While traditional two- and three-dimensional models can offer insights into cancer development and progression, these lack crucial aspects that hinder a faithful mimic of native tumors. An alternative model that has gained a lot of attention is the patient-derived organoid. The development of these organoids recapitulates the complex intercellular communication, tumor microenvironment, and histoarchitecture of tumors. This paper describes the protocol for establishing melanoma patient-derived organoid (MPDO) models. To validate these models, we assessed the immune cell composition, including the expression levels of T-cell activation markers, to confirm the cellular heterogeneity of the organoids. Additionally, to describe the potential utility of MPDOs in cellular therapies, we evaluated the cytotoxic capabilities of treating the organoids with &#947;&#948; T-cells. In conclusion, the MPDO models offer promising avenues for understanding tumor complexity, validating therapeutic strategies, and potentially advancing personalized treatment.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Nachbildung der Melanomkomplexität mit patienteneigenen Organoiden für die Bewertung von Immuntherapien

Here, we present a protocol to generate melanoma patient-derived organoids by culturing disassociated cell suspensions from fresh melanoma tissues. These organoids faithfully recapitulate patient-specific tumors in vitro, offering an innovative approach to exploring tumor immunosuppressive mechanisms, drug screening, drug resistance mechanisms, and cancer surveillance approaches.

Aufdeckung therapeutischer Möglichkeiten mit Organoidmodellen von Melanom-Patienten

With the development of immunotherapy, there is an ongoing need to develop models that can recapitulate the tumor microenvironment of native tumors. While ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Imaging- und Durchflusszytometrie-basierte Analyse von Zellposition und den Zellzyklus in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Medizin

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Kultivierung einer dreidimensional rekonstruierten menschlichen Epidermis im großen Maßstab

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

<meta charset="utf8"></head><body>Effiziente 3D-Hautmodelle für flexible Forschungsanwendungen

Building Up Skin Models for Numerous Applications - from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical industries. In the European Union, there has been a total ban on testing cosmetic products and their ingredients on animals. In the case of medicine and pharmaceuticals, this possibility is also constantly limited. In accordance with the 3Rs principle, it is becoming more and more common to test individual compounds as well as entire formulations on artificially created models. The cheapest and most widely used are the 2D models, which consist of a cell monolayer but do not reflect the real interactions between the cells in the tissue. Although the commercially available 3D models provide a better representation of the tissue, they are not used on a large scale. This is because they are expensive, the waiting time is quite long, and the available models are frequently limited to only those typically used. 
In order to move the conducted research to a higher level, we have optimized the procedures of various 3D skin model preparations. The described procedures are cheap and simple to prepare as they can be applied in numerous laboratories and by researchers with different experiences in cell culture.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Verbesserung der Vielfalt von Hautmodellen mit kostengünstigen 3D-Zellmodellen

Here, we present inexpensive and simple procedures to introduce various 3D skin models for routine research in a cell culture laboratory. Researchers can create models tailored to their needs without relying on commercially available models.

Aufbau von Hautmodellen für zahlreiche Anwendungen - von der zweidimensionalen (2D) Monokultur bis zur dreidimensionalen (3D) Multikultur

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical ...

Ein 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Die dreidimensionalen humanen Haut Rekonstruieren Modell: ein Tool für normale Haut und Melanom Progression Study

Ein melanompatientenabgeleitetes Xenograft-Modell

Ein neuartiges Stromal Fibroblast-moduliertes 3D-Tumor-Sphäroid-Modell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Interaktion und der Arzneimittelforschung

Brustepithel- und Endothelzell-Sphäroide als potenzielles funktionelles In-vitro-Modell für die Brustkrebsforschung

Aufdeckung therapeutischer Möglichkeiten mit Organoidmodellen von Melanom-Patienten

Aufdeckung therapeutischer Möglichkeiten mit Organoidmodellen von Melanom-Patienten

Aufdeckung therapeutischer Möglichkeiten mit Organoidmodellen von Melanom-Patienten

Imaging- und Durchflusszytometrie-basierte Analyse von Zellposition und den Zellzyklus in 3D Melanoma Spheroids

Kultivierung einer dreidimensional rekonstruierten menschlichen Epidermis im großen Maßstab

Aufbau von Hautmodellen für zahlreiche Anwendungen - von der zweidimensionalen (2D) Monokultur bis zur dreidimensionalen (3D) Multikultur