Die Autoren danken für die 3D organotypischen Melanom-Sphäroid-Haut-Modell zu etablieren und bietet ausgezeichnete Protokolle Hanna Voersmann. Die Autoren danken auch Silke Busch für wertvolle technische Unterstützung. Die Arbeit wurde unterstützt vom BMBF e: Med Programm "Melanom Sensitivity" 031A423A.

Alle menschlichen Gewebe Arbeiten erfolgte mittels zugelassenen institutionellen Protokolle.
(1) Trennung der Dermis und Epidermis aus der menschlichen Haut (Juvenile Vorhaut von Beschneidung)
<ol><li>Legen Sie die Vorhaut (in der Regel 1 – 2 cm2) in einer Kulturschale nichtklebenden sterile Zelle (Ø 10 cm) und decken Sie es mit 10-12 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung+ (0,5 mM MgCl2, PBS, pH 7,2, 0,9 mM CaCl2= PBS+). Entfernen Sie alle überschüssiges (adipös) Gewebe mit sterilen Skalpell und Pinzette.</li>
	<li>Schneiden Sie die Haut in 3 x 5 mm Stücke mit PBS waschen Sie und übertragen Sie sie auf ein nicht klebendes sterile Zelle Kulturschale (Ø 6 cm). Die Gewebe-Stücke mit ca. 5-7 mL Dispase-Lösung (2 U/mL PBS) zu decken. Versiegeln Sie der Zelle Kulturschale mit Paraffin Film und 16 h bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Einfahren der epidermalen aus dem dermalen Teil mit zwei sterile Pinzetten. Seziert Gewebe Stücke auf Einzelzelle nichtklebenden Kultur Gerichte (Ø 6 cm) übertragen und jeder von ihnen mit PBS+zu decken.</li>
</ol>2. Isolierung der primären Keratinozyten aus der Epidermis
<ol><li>Sorgfältig die PBS+ aus der Zelle Kulturschale mit einer Pasteurpipette entfernen und die epidermalen Gewebe Stücke (Abschnitt 1.3) mit PBS waschen. Schneiden Sie die Epidermis in kleinere Stücke (1 mm2) und sammeln sie in einem 50 mL konische Röhrchen. Fügen Sie 10 mL 1 x Trypsin-EDTA (vorgeheizt auf 37 ° C) und 5 min im Wasserbad bei 37 ° c inkubieren Wirbel der Gewebe-Aufhängung alle 2 min.</li>
	<li>Stoppen Sie die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 1 mL fetalen Kälberserum (FCS). Aufzuwirbeln Sie die Zellen von oben und unten mit einer 10-mL-Kunststoff-Pipette für 4 min. versuchen zur Vermeidung von Luftblasen und Schaum-Bildung pipettieren.</li>
	<li>Pipettieren der Zellsuspension in eine Zelle Sieb (Pore Größe 100 µm), auf eine frische 50 mL konische Rohr platziert, 3 X mit 5 mL PBS spülen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 X g, für 5 min. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2-6 mL Kulturmedium mit 1 % (V/V) Gentamycin. Bestimmen Sie die Zellenzahl manuell durch zählen Zellen in einem Hemocytometer und Samen 6 x 105 Zellen in einer T75 Zelle Kultur Kolben.</li>
</ol>3. Anbau von primären Keratinozyten
<ol><li>Inkubieren Sie primären Keratinozyten in Schritt 2.3 in einer Zelle Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 in Keratinozyten Medium ohne FCS, um 50-70 % Konfluenz isoliert.</li>
	<li>Um die Keratinozyten sorgfältig die passage des Mediums zu entfernen, geben Sie 5 mL PBS-EDTA und die Zellen für 10 min bei 37 ° c inkubieren Überprüfen Sie, ob Zellen begonnen haben, trennen Sie den Kultur-Kolben unter einem Lichtmikroskop (4 X Vergrößerung: Zellen abgerundeten erscheint aber noch befestigt!). Wenn dies nicht der Fall ist, ersetzen Sie alte PBS-EDTA mit frischen PBS-EDTA und erneut für weitere 10 Minuten bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Geben Sie 5 mL 1 X Trypsin-EDTA zu den abgerundeten Zellen noch bedeckt mit 10 mL PBS-EDTA und wieder lang 1-3 min bei 37 ° c inkubieren Die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 1 mL FCS zu stoppen und die freistehenden Zellen in einem 50 mL konische Röhrchen sammeln. Die Zellen bei 200 X g für 5 min zentrifugieren, das Pellet in Keratinozyten Medium und 6 x 105 Samenzellen in einer frischen T75 Zelle Kultur Flasche aufzuwirbeln. Hinweis: Um organotypischen Haut rekonstruiert zu erzeugen, sollte die primären Keratinozyten spätestens 3-4 Durchgang verwendet werden.</li>
</ol>4. Isolierung der primäre Fibroblasten aus der Dermis
<ol><li>Schneiden Sie das Hautgewebe (Abschnitt 1.3) in kleinere Stücke (1 mm2) und übertragen Sie sie in ein 50 mL konische Röhrchen. 10 mL Kollagenase-Lösung (5 U/mL PBS+) hinzufügen und 45 Minuten im Wasserbad bei 37 ° c inkubieren Zentrifugieren Sie die Mischung von Gewebe und Zellen bei 200 X g für 5 min.</li>
	<li>Waschen Sie die Zelle Pellet zweimal mit 10 mL DMEM mit 4,5 g/L Glucose und L-Glutamin, aber ohne L-Pyruvat. Schließlich erneut die Gewebe-Stücke in 2 mL DMEM mit 10 % FCS 1 % (V/V) Gentamycin. In einem T25 Zelle Kultur Kolben übertragen Sie und inkubieren sie über Nacht in einer Zelle Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 . Hinweis: Das geringe Volumen ermöglicht die Fibroblasten, aus dem Gewebe-Schutt zu migrieren und zwingt sie in den Kultur-Kolben befestigen.</li>
	<li>Am nächsten Morgen fügen Sie ein weiteres 6 mL DMEM/Gentamycin/FCS hinzu und 2-3 Tage bei 37 ° C inkubieren Sie, bis die Zellen 80-90 % Konfluenz erreicht haben.</li>
</ol>5. Anbau der primäre Fibroblasten
<ol><li>Durchgang der Fibroblasten, entfernen das Medium und adhärente Zellen mit PBS waschen. Geben Sie 5 mL 1 x Trypsin-EDTA und 3 min bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 5 mL DMEM/FCS zu stoppen und die freistehenden Zellen in einem 50 mL konische Röhrchen sammeln. Die Zellen bei 200 X g für 5 min zentrifugieren, Aufschwemmen das Pellet in DMEM Medium, und Saatgut 6 x 105 Zellen in einer frischen T75 Zelle Kultur Kolben. Hinweis: Um organotypischen Haut rekonstruiert zu erzeugen, sollte die primäre Fibroblasten spätestens 4-6 Gang verwendet werden.</li>
</ol>6. Generation der 3D Melanom Sphäroide über der hängenden-Drop-Methode
<ol><li>Kultur Melanomzellen (z.B., 451-LU oder irgendwelche Melanom-Zell-Linie von Interesse) nach allgemeine Protokolle, mit RPMI mit 10 % FCS15.<ol>
<li>Um Melanom Sphäroide von ähnlicher Größe und Qualität zu erzeugen, waschen Sie die Melanomzellen in PBS, fügen Sie 5 mL 1 X Trypsin-EDTA mit PBS-Puffer für die Zellen in einem T175 Zell-Kultur-Kolben und inkubieren Sie für ca. 3-5 min bei Raumtemperatur (RT). Neutralisieren Sie die Trypsin durch Zugabe von 5 mL RPMI/10% FCS. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 200 X g für 5 min. die Zelle Pellet in RPMI/FCS eine Endkonzentration von 10.000 Zellen/mL als durch auszählen in einem Hemocytometer wieder aussetzen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>40 x 25 µL (= 250 Zellen) der Zellsuspension auf der inneren Oberfläche des Deckels eine sterile nichtklebenden Zelle Kulturschale (Ø 10 cm) mit einer elektronischen Multi-Pipette zu erkennen. Drehen Sie mit einer schnellen aber glatte Bewegung den Deckel um und legen Sie sie auf der jeweiligen Zelle Kulturschale mit 5 mL PBS.<ol>
<li>Kultur "hängenden Tropfen Gerichte" in eine Zelle Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 10-14 Tage, je nach Zelltyp verwendet. Hinweis: Zellen aus der MM-Wachstumsphase in der Regel schneller wachsen und bilden solidere Sphäroide in den hängenden Tropfen gegenüber Melanomzellen RGP oder VGP abgeleitet. Beachten Sie bei individuellen Bewertung Sphäroid Wachstum unter Fernglas oder unter einem Lichtmikroskop (4 X Vergrößerung). Sphäroide werden in der Regel nach 48 h unter Fernglas oder unter einem Lichtmikroskop (4 X Vergrößerung) nachweisbar. Nach 10-14 Tagen sind sie ohne Vergrößerung Gerät sichtbar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 Tage nach dem ersten Tropfen Schmierblutungen hinzufügen 10 µL des frischen RPMI/10% FCS-Medium zu jedem Tropfen. Anschließend tauschen Sie 10 µL Medium jeden zweiten Tag. Die Verwendung von einem elektronischen Dispenser ist sehr hilfreich in diesem Schritt.</li>
	<li>Je nach Zelltyp ernten Sie die Sphäroide (siehe Abschnitt 10) nach 10-15 Tagen durch sanft abspülen des Zelle Kultur Schale Deckels mit PBS. Sammeln sie in einer Kulturschale nichtklebenden Frischzellen. Hinweis: Die Anbau Zeit richtet sich nach der Tumor Wachstumsphase der Melanomzellen Wenn sie zunächst abgeleitet wurden, z.B.Sphäroide abgeleitet von 451-LU Zellen wachsen, um etwa 500 µm im Durchmesser innerhalb von 12 Tagen der Kultivierung in den hängenden Tropfen15 .</li>
</ol>7. Generation von dermalen Abteil des organotypischen voll Haut rekonstruiert
<ol><li>Generieren Sie hautmodelle mit 24 Wohlen Zelle mikroporösen Membran Einsätze (pore Größe 8 µm) in 24-Well Platten gelegt. Hinweis: Stellen Sie sicher, nicht hängend zu verwenden aber ständigen Einsätze, weil sie in einer 6-Well-Platte für den Luft-Flüssigkeit Anbau zu einem späteren Zeitpunkt gestellt werden.</li>
	<li>Bereiten Sie das Gel Neutralisation Lösung (GNL)15sowie die Nährmedien als MM und endothelial Wachstum Medien (EGM)16,17bezeichnet. Um die Gerinnung zu verhindern, laden das Kollagen Typ I (in der Regel von Rattenschwanz, 3,5-4 mg/mL in 0,02 N Essigsäure) auf Eis bis zum Gebrauch, denn es beginnt zu Gelieren bei RT</li>
	<li>Neu 1 x 105 Fibroblasten pro Einsatz in GNL und mischen Sie schnell die Zellsuspension mit Kollagen in einem Verhältnis von 1:3 in einem Endvolumen von 500 µL/einfügen. Mix von sanft pipettieren rauf und runter, um Blasenbildung zu vermeiden, da Luftblasen die Qualität der Haut beeinträchtigt zu rekonstruieren.</li>
	<li>Lassen Sie die einzelnen dermal Gele, indem man sie ohne Medium bei RT für 30 min in einem sterilen Abzug zu begleichen. Decken Sie anschließend jedes Gel mit DMEM mit 4,5 g/L Glukose, 1 % L-Glutamin, 10 % FCS, und ohne L-Pyruvat, und über Nacht bei 37 ° c inkubieren</li>
</ol>8. Generation der epidermalen Abteil des organotypischen voll Haut rekonstruiert
<ol><li>Am nächsten Tag entfernen Sie das Medium aus der dermalen Gele und equilibrate sie mit EGM Medien (10 % FCS, 1 % PenStrep, 10 mg/mL Gentamicin) für 2 h bei 37 ° C. Zurückziehen Sie des Mediums und Samen Sie sorgfältig 1 x 105 Keratinozyten in 100 µL EGM auf die dermale Gel Nukleinsäuretablette.</li>
	<li>Inkubieren Sie rekonstruiert für 1,5 h bei 37 ° C um die Keratinozyten zur Einhaltung der dermalen Kompartiment zu ermöglichen. Hinweis: Während dieser Inkubationszeit beginnt die Gele zu schrumpfen durch Fibroblasten-induzierten Kontraktion und somit zumindest teilweise von den Wänden einfügen lösen.</li>
	<li>Decken Sie die Haut Entsprechungen mit rund 800 µL EGM und entfernen Sie vorsichtig das restliche Gel aus der einfügen-Wand mit einer kleinen (weiß) PIPETTENSPITZE. Die Haut-äquivalente untergetaucht in EGM für 7 Tage in einer Zelle Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2, Kultur und das Medium täglich verändern. Hinweis: Während dieser Zeit werden die Haut Entsprechungen deutlich schrumpfen.</li>
</ol>9. Air-Liquid-Anbau von organotypischen voll Haut rekonstruiert
<ol><li>Am Tag 8 Übertragung jedes stecken Sie in einem einzelnen Brunnen einer 6-Well-Platte. Nur fügen Sie 1,2-1,4 mL MM Medium jedes gut hinzu, so dass die Haut zu rekonstruieren ist mit Medium von der Unterseite des Brunnens geliefert, aber nicht mit Medium fällt. Hinweis: Anbau an der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle ermöglicht Schichtung der epidermalen Teil und Einrichtung einer vollen Hornschicht (Stratum Corneum).</li>
	<li>In den nächsten Tagen von 10-17 verändern Sie das Medium wie in Abschnitt 9,1 jeden zweiten Tag. Während dieser Zeit fügen Sie Drogen oder andere Reize bei Bedarf auf das Medium. Entfernen Sie vorsichtig die volle Haut rekonstruieren aus dem mikroporösen Membran einfügen gebogenen Pinzette für weitere Analysen, z.B.immunhistochemische Analyse (Abbildung 1).</li>
</ol>10. Generation der organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodelle
<ol><li>Melanom Sphäroide in der dermalen Fach des organotypischen volle Haut rekonstruiert zu integrieren, spülen Sie sorgfältig die Sphäroide (nach Schritt 6.4) den Deckel der hängenden Tropfen Zelle Kulturschale mit PBS. Sammeln Sie 10-20 Sphäroide/einfügen in eine sterile Zelle nichtklebenden Kulturschale. Entfernen Sie vorsichtig die übermäßige PBS mit einer Pasteurpipette.</li>
	<li>Aspirieren Sie die Sphäroide in die kleinstmögliche Volumen der EGM. Zu diesem Zeitpunkt beobachten Sie und zählen Sie die Sphäroide mit bloßem Auge, ohne jede weitere Vergrößerung Gerät. Nehmen Sie 10-20 Sphäroide pro Haut Modell/Gel, wie in Schritt 10.1 angegeben.</li>
	<li>Übertragen Sie sie auf die gewünschte Lautstärke GNL mit Fibroblasten (während Schritt 7.3) und mischen mit dem Kollagen Typ ich. Von diesem Schritt auf wie in den Abschnitten 7.3-9.1 beschrieben vorgehen. Hinweis: Tumor Sphäroide werden sichtbar in der dermalen Gel als weiße Flecken (Abbildung 2)</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell hier vorgestellten garantiert neue Erkenntnisse für ein tieferes Verständnis der Intra-Tumor und Tumor-Wirt-Interaktion, und bieten eine erweiterte Screening-Plattform zur Untersuchung von molekularer Mechanismen der Tumorentstehung und Therapieresistenz in der Zukunft.
Um die beste Garantie physiologische und rekonstruiert in Vivo Bedingungen der Haut imitiert, die Qualität der PV-Zellen ist von größter Bedeutung. Wie bereits erwähnt, juvenile oder pränatale Hautzellen zeigen die niedrigsten Differenzierungsgrad und eignen sich daher am besten, voll-dicke Haut Entsprechungen zu generieren. Die erste mögliche Qualitätskontrolle ist das Ausmaß der dermalen Kontraktion am 2. Tag nach der Aussaat der Keratinozyten und äquilibrierung das Gel EGM (Protokoll Abschnitte 8.2 und 8.3). Dermale Gele werden am meisten mit der besten Qualität von Fibroblasten schrumpfen. Auch kann die Integration der zu wenige oder zu viele Fibroblasten dermal Kontraktion und folglich Befestigung der der epidermalen, dermalen Kompartiment beeinträchtigen. Dies beeinträchtigt wiederum epidermalen Differenzierung, weil dieser Prozess eine umfangreiche Übersprechen zwischen den dermalen und epidermalen Zellen erfordert.
Die Qualität von Primärzellen hängt auch die Zelle Konfluenz sowie die Passage der Zellen. Wenn Keratinozyten, ≥80 % Konfluenz angebaut werden sie sofort stoppen, wuchernden und beginnen zu unterscheiden. Es ist daher wichtig Kultur sie zu 40-70 % Konfluenz während passagierung und verwenden Sie sie nicht später als Durchgang 3-4. Fibroblasten sind weniger empfindlich, aber sollte nicht später als 4-6 Durchgang verwendet werden. Bitte beachten Sie, dass alle Primärzellen und Zelllinien zur Erzeugung von organotypischen Melanom Sphäroid hautmodelle kultiviert sind frei von Antibiotika, und daher ist das Kontaminationsrisiko hoch. Aber die Zugabe von Antibiotika ändert sich die Physiologie der einzelnen Zellen und reduziert somit die Qualität der Haut Entsprechungen.
Im Allgemeinen ist Sphäroid Tumorbildung möglich aus fast allen Arten von Tumor-Zell-Linien und auch von Tumorzellen, die frisch von Patientenmaterial isoliert. Die erste Zelle Nummer bzw. Anbau Zeit für die Gewinnung optimaler Sphäroid Größen variieren je nach Zelltyp verwendet. Bis zu einer Größe von 150-200 µm können alle Zellen in einem Sphäroid enthalten noch ausreichend mit Nährstoffen durch einfache Diffusion versorgt werden. Nur Sphäroide mit Größen ≥500 µm zeigen ein hohes Maß der Zelldifferenzierung und typischen Merkmale nicht durchblutet Tumor Gewebe22vertreten.
Die organotypischen Melanom-Sphäroid-Haut-Modell entwickelt, hier eignet sich besonders zur Tumor-Wirt Interaktionen zu untersuchen und für Melanom Drogentests unter in Vivo-Bedingungen15mag. Dennoch ist die Umgebung des Melanoms in Vivo noch komplexer, beherbergen eine Vielzahl von Zelltypen Tumor verbunden sind, einschließlich der Immunzellen und Endothelzellen. Da die Zugabe der richtigen primären Immunzellen Problemen mit Histocompatibility konfrontiert ist, sind diese Modelle noch nicht in der Lage, angemessen zu überwachen, immun-therapeutische Ansätze.
Dennoch, Melanom Sphäroide aus frisch isolierte Patientenmaterial generiert werden und nach in die volle Haut zu rekonstruieren, kann dienen als individuelle Drug screening Plattformen. Auch die Integration der Stücke von Melanom-Metastasen in Haut rekonstruiert ist denkbar, Medikamenten-Kombinationen in einer maßgeschneiderten Therapieansatz zu testen. Einschließlich organotypischen 3D-Modell Haut Melanom in der präklinischen Prüfung dürfte dazu beitragen, dass nur die vielversprechendsten neuartige therapeutische Konzepte in klinischen Tests, vorangebracht werden wodurch die Ausfallrate von potenziellen neuen Behandlungen für diese Krankheit und Erhöhung der Therapieerfolg in klinischen Studien.

Die menschliche Haut besteht aus zwei verschiedenen Fächern, die unterschiedliche Funktionen im Schutz des Körpers vor nachteiligen Auswirkungen auf die Umwelt1dienen. Die untere dermale Fach besteht aus einer Fibro-elastisches Bindegewebe. Es besteht aus lose miteinander verbundenen Kollagen und Elastin-Fasern von Fibroblasten, dient eine mechanische Barrierefunktion synthetisiert. Die Dermis ist von der oberen Epidermis durch die Basallamina getrennt als eine extrazelluläre Matrix durch eine ständige Kommunikation zwischen beiden Kammern der Haut produziert wird. Im Gegensatz zu der Dermis Epidermis ist ein Plattenepithel besteht hauptsächlich aus Keratinozyten und kann in vier Schichten unterschieden werden. Das Stratum Basale besteht aus undifferenzierten basalen Keratinozyten, die ständig aus Vorläuferzellen der Haut durch die Stadien des Stratum Spinosum und Stratum Granulosum in Stratum Corneum stratifiziert , schützen den Körper vor Austrocknung und Infektionen2. Melanozyten sind ausgerichtet auf die Basalmembran und kommunizieren über dendritische Erweiterungen mit mehreren Keratinozyten. Sie produzieren das Pigment Melanin zum Schutz der Haut vor den schädlichen Auswirkungen der UV-Strahlung, wie Hautalterung, Immunsuppression, Entzündung und Induktion von nicht-Melanom-Hautkrebs. UV Strahlungen Beitrag zur Transformation der Melanozyten, malignes Melanom, ist jedoch noch in der Diskussion3.
Melanom Entwicklung differenziert nach verschiedenen Tumorstadien Fortschreiten, und von bestimmten genetischen, morphologischen und histologischen Veränderungen4gekennzeichnet. Sie stammen entweder de Novo oder von einer angeborenen oder erworbenen Nävus aufgrund einer lokalen erhöhen der Melanozyten Proliferation verursachen gutartige Neoplasie. Diese Vorstufe Läsion kann wandeln in strukturell veränderten dysplastische Gewebe werden Zellen, die zu der ersten malignen Phase der radialen Wachstumsphase (RGP) fortsetzen kann. Diese frühen Tumor Progression Phase zeichnet sich durch Zellen vermehren Radial innerhalb der Epidermis, zeigt einige lokal invasive Zellen innerhalb der papillären Dermis. Während der anschließenden vertikales Wachstum Phase (VGP) Melanom zeigen Zellen bereits metastasierendem und invasiven Phänotyp durch das brechen durch die Basallamina, die tieferen Bereiche der Dermis sowie die Unterhaut5zu infiltrieren. Schließlich stellt metastasierendem Melanom (MM) die aggressivste Progression-Bühne mit metastasierenden Zellen systemisch Verbreitung im gesamten System der Blut- und Lymphzirkulation, Organe wie Leber, Lunge und Gehirn6nach distal zu erobern.
Früherkennung, gefolgt von einer Operation bleibt bis heute die effektivste Therapie des malignen Melanoms. Die Prognose bei Patienten mit Fernmetastasen, bleibt allerdings besonders schlecht7, weil klassische Chemotherapie-Regimen nur wenig überleben nutzen8,9übertragen. Allerdings haben die jüngsten Fortschritte in zielgerichtete Therapien nach Jahrzehnten der Stagnation, die Prognose des malignen Melanoms erheblich verbessert.
Dysregulation der zwei wichtige Mitogen aktiviert Signalwege, die RAS-RAF-MEK-ERK und die Signalwege PI3K-AKT-PTEN präsentieren Schlüsselfaktoren der Melanom-Progression, zumal konstitutiv Punktmutationen des Proto-oncogenes BRAFV600 aktivieren und NRB sind vorhanden10. Entsprechend versprach die Erfindung des gezielten Kinase-Inhibitoren therapeutischen Nutzen für Patienten mit metastasierendem Melanom. Eine Vielzahl von klinischen Studien zu diesem Punkt hat erhebliche Vorteile für Patienten mit metastasierendem Melanom nicht erreicht. Fast alle Antworten sind teilweise mit einer Subpopulation von Patienten mit primären Widerstand. Darüber hinaus wurde die Übernahme von sekundären Widerstand bis zum Rezidiv führt in der Mehrzahl der Patienten11,12beobachtet.
Es wird klar, dass Analyse der Mutationsstatus allein nicht ausreichen, um die stärkste therapeutische Strategie zu entwickeln. Neue schnelle und zuverlässige Diagnose-Tools sind notwendig, um systematisch erfassen und analysieren die Reaktionsfähigkeit der einzelnen Krebszellen. Die überwiegende Mehrheit der derzeit verfügbaren Daten zur menschlichen Melanom wurden aus zweidimensionalen (2D) Melanom Zellkulturen gewonnen. Tumorzellen, jedoch gewachsen in 3D ermöglichen interzellulären Übersprechen zwischen differenzierte Krebs Zelle Subpopulationen sowie zwischen Krebszellen und die nicht-transformierten umliegende Wirtsgewebe. Daher wäre es am besten, die 3D-Umgebung zu rekonstruieren, in dem das Melanom entwickelt, als eine präklinische Screening verwendet werden, Modell13,14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="625">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">fetal serum albumin (FCS)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10270106</td>
			<td style="width:167px;">add 10 % to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25300054</td>
			<td>1X dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RPMI</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61870010</td>
			<td style="width:167px;">for cultivation of melanoma cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">41965062</td>
			<td style="width:167px;">for cultivation of primary fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dispase</td>
			<td style="width:123px;">Gibco life technologies&#160;</td>
			<td>17105041</td>
			<td>2U/ml, dissolve in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Collagen type I</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td>354249</td>
			<td style="width:167px;">usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">24-well inserts Nunclon&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Nunc</td>
			<td>140629</td>
			<td style="width:167px;">8 &#181;m pore size; use standing, not hanging inserts!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cell strainer</td>
			<td style="width:123px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352360</td>
			<td>yellow</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gentamycine</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750060</td>
			<td>dissolve in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Keralife keratincyte medium</td>
			<td style="width:123px;">Cell Systems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">do not add FCS or antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase</td>
			<td style="width:123px;">SERVA</td>
			<td>17454</td>
			<td>NB4 standard grade</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">juvenile human keratinocytes</td>
			<td style="width:123px;">Cell Systems</td>
			<td style="width:119px;">FC-0007</td>
			<td style="width:167px;">alternative to own preparation from juvenile foreskin</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">juvenile human fibroblasts</td>
			<td style="width:123px;">Cell Systems</td>
			<td style="width:119px;">FC-0001</td>
			<td style="width:167px;">alternative to own preparation from juvenile foreskin</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">DMEM 
			[+] 4,5 g/l Glucose, 
			[+] L- Glutamine, 
			[-] L- Pyruvate</td>
			<td style="width:123px;">Gibco life technologies</td>
			<td style="width:119px;">41965</td>
			<td style="width:167px;">mix 1:1 with Ham&#180;s F-12 for MM medium;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; mix 3:1 with Ham&#180;s F-12 for EGM medium</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Ham&#180;s F-12 [+] L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Gibco life technologies</td>
			<td style="width:119px;">&#160;21765-029</td>
			<td style="width:167px;">add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EGF&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Gibco life technologies</td>
			<td style="width:119px;">&#160;13247-051</td>
			<td style="width:167px;">add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:123px;">Merck Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">2381</td>
			<td style="width:167px;">add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Selenic acid</td>
			<td style="width:123px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">18851</td>
			<td style="width:167px;">add 53 nM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:123px;">Lilly</td>
			<td style="width:119px;">HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml</td>
			<td style="width:167px;">add 5 &#181;g/ml for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">E-0135</td>
			<td style="width:167px;">add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">P-Ethanolamine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-0503</td>
			<td style="width:167px;">add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Holo-Transferrine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T-0665</td>
			<td style="width:167px;">add 5 &#181;g/ml for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Triiodthyronine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T-6397</td>
			<td style="width:167px;">add 20 pM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H-088816</td>
			<td style="width:167px;">add 0.4 &#181;g/ml for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Progesterone</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-8783</td>
			<td style="width:167px;">add 10 nM only for the generation of EGM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hepes</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H-3784</td>
			<td style="width:167px;">add 15 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Serine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S-4311</td>
			<td style="width:167px;">add 1 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cholinchloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C-7017</td>
			<td style="width:167px;">add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">dFCS</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F-0392 Lot 086K0361</td>
			<td style="width:167px;">add 2 % for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Adenine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-9795</td>
			<td style="width:167px;">add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-42209</td>
			<td style="width:167px;">add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Strontiumchloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">255521</td>
			<td style="width:167px;">add 1 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti cytokeratin 10 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">M7002</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti cytokeratin 14 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-53253</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;anti laminin 5 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-32794</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti filaggrin antibody</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-13440</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti involucrin antibody</td>
			<td style="width:123px;">Acris Antibodies</td>
			<td style="width:119px;">AM33368PU</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled</td>
			<td style="width:123px;">LifeSpan Biosciences</td>
			<td>LS-C153907</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled</td>
			<td style="width:123px;">Jackson Immuno Research</td>
			<td style="width:119px;">115-165-003</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10236276001</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3d organotypic melanoma spheroid skin model

Maligne Transformation der Melanozyten, die Pigmentzellen der menschlichen Haut verursacht Bildung eines Melanoms, einen sehr aggressiven Krebs mit metastasiertem Potenzial. Vor kurzem, Mono-Chemotherapien weiterhin von Melanom spezifische Kombinationstherapien mit gezielten Kinase-Inhibitoren verbessern. Dennoch bleibt metastasierendem Melanom eine lebensbedrohliche Krankheit weil Tumoren primäre Resistenz aufweisen oder entwickeln Resistenz gegen neuartige Therapien, damit wieder tumorigenic Kapazität. Um den therapeutischen Erfolg des malignen Melanoms zu verbessern, ist die Bestimmung der molekularen Mechanismen, die Übertragung der Resistenz gegen herkömmliche Behandlungsansätze notwendig; jedoch braucht es innovative zelluläre in-vitro- Modelle. Hier stellen wir eine in-vitro- dreidimensionale (3D) organotypischen Melanom Sphäroid Modell, das kann die in Vivo -Architektur des malignen Melanoms darzustellen und kann neue Erkenntnisse rechtfertigen Intra-Tumor sowie Tumor-Wirt Interaktionen. Das Modell enthält definierte Anzahl von Reifen und differenzierte Melanom Sphäroide in einem 3D voll Menschenhaut Wiederaufbau Modell bestehend aus primären Hautzellen. Die zelluläre Zusammensetzung und Differenzierung Status des eingebetteten Melanom Sphäroide ähnelt der eines kutanen Melanom Metastasen in Vivo. Mit diesem organotypischen Melanom Sphäroid Modell, wie ein Drogen-screening-Plattform die Identifizierung der Responder zu unterstützen kann Kombinationstherapien, während erspart unnötige Behandlung Belastung für non-Responder, wodurch des Vorteils ausgewählt therapeutische Interventionen.

Erfolgreicher Behandlung von Melanomen Metastasen kann durch das Übersprechen zwischen Tumorzellen sowie zwischen Tumor und nicht-transformierten Wirtszellen beeinflusst werden. Organotypischen Modelle von Krebs in Vitro zu entwickeln soll geeignete präklinische Testsysteme bereitstellen, die die 3D Organisation und Komplexität der menschlichen Melanom rekapitulieren in-vivo. Dies ermöglicht die Untersuchung der therapeutischen Wirkung auf den Tumor innerhalb einer organotypischen Umgebung und die negativen Auswirkungen auf das umliegende Gewebe der primären parallel.
Um die besten organotypischen hautmodelle zu entwickeln, ist die Qualität der PV-Zellen entscheidend. Es ist vorteilhaft, juvenile primäre Fibroblasten und Keratinozyten, zu verwenden, weil sie in der Regel weniger im Vergleich zu Erwachsenen primäre Hautzellen unterscheiden. Juvenile Haut Zellen können entweder isoliert von juvenile Vorhaut wie beschrieben im Abschnitt "Protokoll" 1-5, sondern auch werden von Firmen wie pränatale primäre Fibroblasten und Keratinozyten erworben. Wenn Kauf, ist es notwendig, Bestellung Zellen von verschiedenen Spendern Spender-spezifische Ergebnisse, z.B.für Drogen Empfindlichkeit zu vermeiden. Das gesamte Protokoll wird als ein Schema in Abbildung 3dargestellt.
Qualitätskontrolle von 3D Full-Haut-äquivalenten erfordert immunhistochemische Analyse. Ein erster Eindruck erhalten Sie durch die Hämatoxylin-Eosin (H & E) Färbung von Paraffin eingebettet Abschnitte (3 µm). Detaillierte Analyse der Qualität der epidermalen Differenzierung und Bildung von der Basallamina zwischen Dermis und Epidermis erfordert immunhistochemische Analyse mit spezifischen Antikörpern gegen einen epidermalen Schichtung-Marker. Dies ermöglicht Unterscheidung zwischen undifferenzierte, hoch proliferativen Zellen liegt in der Nähe der Basalmembran und sehr differenziert und keratinized Zellen an das Stratum Corneum durch die Bildung von epidermalen Schichten dazwischen . Dargestellt durch immun-histologische Färbung (Abbildung 4), Differenzierung der Keratinozyten in der Epidermis ähnlich wie normale Haut erzielt werden konnten: vor allem die undifferenzierten Zellen aus den unteren epidermalen Schichten (Schicht Basale und Stratum Spinosum) positiv für Keratin 14, färben, während die differenzierteren Zellen aus den supra basalen Schichten (Stratum Granulosum und Stratum Corneum) 10 und Involucrin positiv für Keratin färben. Dementsprechend konnte die Filaggrin Färbung nur in hoch differenzierten Zellen des Stratum corneumsbeobachtet werden. Am wichtigsten ist, zeigt Laminin 5 Färbung, dass eine Basallamina generiert wurde, um mit dermalen Abteil des kunsthaut rekonstruieren physiologisch der epidermalen verbinden. Dies beweist, dass eine Verbindungstür organotypischen Mikroumgebung Host Melanomzellen oder Sphäroide für physiologische und pathophysiologische Analyse generiert wurde.
Zum Zwecke der Melanom-Drogen-Screening, können einzelne Melanomzellen auch in der Dermis volle Haut äquivalente erlauben de Novo Melanom Nest Bildung18,19integriert werden. Daher sind Melanomzellen kombiniert mit primäre Fibroblasten in einem Verhältnis von 5:1, zusammen mit 200 X g für 5 min zentrifugiert und Nukleinsäuretablette in GNL vor dem Vermischen mit Kollagen. Infolgedessen bilden die Melanom-Zelle-Nester spontan in der dermalen Kompartiment. Unserer Erfahrung nach phase nur Zellen des metastasierten Wachstums Form richtige Nester, im Vergleich zu Melanomzellen RGP oder VGP15. Ein großer Nachteil dieser Art von Modellen die Tatsache, die die Anzahl und Größe der Melanom-Nester gebildet können nicht vorhergesagt werden ist, variieren zwischen den einzelnen Haut rekonstruiert, unabhängig von jeder Behandlung. Zum Beispiel können 1.000 Zellen ausgesät in der dermalen Fach 10 Nester bestehend aus 100 Zellen oder 100 Nester, bestehend aus 10 Zellen jeweils (Abbildung 5) gewinnen. Diese biologischen Variablen präsentieren mit drei Mängel: Erstens die Anzahl und Größe der Melanom-Nester gebildet sind unvorhersehbar; Zweitens die Metastasen in Vivo sind meist größer als Melanom Nester und zeigen vielfältige komplexer Intra-Tumor; und drittens durch die begrenzte Lebensdauer der Tumor-Nest Modelle Behandlung wird frühzeitig eingeleitet, und folglich eher hemmt Tumor Auswuchs statt verursacht Rückbildung von bestehenden Tumor Nester.
Um diese Einschränkungen organotypischen Melanom Sphäroid hautmodelle überwinden kann generiert werden. Durch die Kultivierung 250 metastasierendem Melanom Zellen in einer hängenden für 14 Tage20fallen, werden Sphäroide reproduzierbar erzeugt bestehend aus lebensfähigen Melanom, die Zellen präsentiert einen kompakten Aufbau mit einem Enddurchmesser von etwa 500 µm imitiert nicht durchblutet Tumor-Knoten, Mikro-Metastasen oder Inter Kapillare Mikro Regionen von soliden Tumoren21,22. In der Regel Melanom-Zell-Linie eignet sich für die Generation der Sphäroide über das HÃ ¤ ngen drop-Methode; Allerdings Zellen abgeleitet weiter fortgeschritten metastasiertem Tumor Stadien Form fester Sphäroide verglichen mit Zelllinien aus Fortschreiten Anfangsphase, z. B.die RGP.
Für einige Zellen ist es vorteilhaft für richtige Sphäroid Bildung zur Verbesserung der Viskosität der hängenden Tropfen Kulturmedium. Dies kann durch die Zugabe von 10-50 % Methylcellulose auf dem Kulturmedium erreicht werden. Für die Methylcellulose Stammlösung Autoklaven 1,2 g Methyl-Zellulose zusammen mit einer magnetischen rühren Bar in einer 100 mL-Glasflasche. Hinzufügen von 100 mL vorgewärmten (60 ° C) Medium und rühren für 20 min bei Raumtemperatur und eine weitere 1-2 h bei 4 ° c Die Stammlösung für 2 h bei 5.000 x g zentrifugieren und viskosen Überstand bei 4 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.
Ordnungsgemäße Validierung von volle Haut Melanom Sphäroid Modellen erfolgt durch die Tatsache, dass eine definierte Anzahl von Melanom Sphäroide können - zumindest statistisch gesehen - in der dermalen Fibroblasten/Kollagen integriert werden, die ich am 1. Tag des Haut-Modellbau, Gerüst ermöglicht Sie während der epidermalen Differenzierung für 25-27 Tage gemeinsam zu entwickeln. Die Ausbeute an Sphäroide kann direkt nach der Aussaat, analysiert werden, weil Sphäroide erscheinen als weiße Flecken innerhalb der transparenten dermal gel und ohne Vergrößerung Gerät (Abbildung 2) gesehen werden können. Dadurch entsteht eine 3D Hautmodell, dass Häfen Reife Melanom Sphäroide, die kultivierten in Vitro für insgesamt ca. 42 Tage, zeigt das höchste Niveau der Intra-Tumor war-Differenzierung15 Zell.
H & E Färbung der Haut Melanom Sphäroid Modell zeigt die histologischen Erscheinungsbild und zelluläre Verteilung von Melanom Sphäroide sehr ähnlich dem menschlichen Melanom nicht durchblutet Haut Metastasen in Vivo15 (Abbildung 6 zu ). Zwei Subpopulationen von Melanomzellen sind unter diesen Bedingungen deutlich zu unterscheiden: einer peripheren wuchernden Subpopulation und einer zentralen Subpopulation, hauptsächlich bestehend aus geschrumpft, Apoptotic oder nekrotischen Zellen bilden die so genannte "nekrotische" Zentrum. -Proteins Leben und vermehren Subpopulationen detektiert werden mit Antikörpern gegen die Verbreitung Marker KI-67, während Zellen des nekrotischen Center von TUNEL-Färbung15visualisiert werden können. Diese besondere Verteilung der Tumor Zelle Subpopulationen gerechtfertigt ist durch die Sphäroid Größe (≥500 µm), durch einen Mangel an Nährstoffen und Sauerstoff im zentralen Teil denen katabolen Abfall ansammelt. Nach dem Protokoll, sofern hier die Generierung von eine zuverlässige und reproduzierbare organotypischen erlaubt eingebettet voll Dicke Menschenhaut Modell mit menschlichen Melanom Sphäroide, die menschlichen Melanom Haut Metastasen zu imitieren. Anwendungen von diesem Modell gehören Drogentests, screening von Toxinen, kosmetische Substanzen beeinflussen oder laser-Therapie auf Melanom Auswuchs und Behandlung.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig1.jpg"> Abbildung 1 : Anbau von 3D organotypischen Haut rekonstruiert untergetaucht mit Medium und an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit. Am Tag 0, die primären Keratinozyten auf der Oberseite der dermalen Kompartiment bestehend aus primären Fibroblasten entkernt sind eingebettet in eine Kollagen-Typ ich Matrix. 3D Haut rekonstruiert kultiviert mit EGM für 7 Tage unter Wasser zu bleiben, trennen Sie die Insert-Wand und schrumpft. Am Tag 8 sind die Einsätze auf 6-Brunnen übertragen und an der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle erlauben epidermalen Schichtung kultiviert. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig2.jpg"> Abbildung 2 : Melanom Sphäroide eingebettet in das dermal Fach als weiße Flecken erscheinen. Während der Vorbereitung der dermalen Fachs des 3D Haut rekonstruieren, eine definierte Anzahl von Melanom Sphäroide Fibroblasten Kollagen Typ hinzugefügt werden kann mischen ich. Sobald das dermale Gel gelegt hat, werden Melanom Sphäroide als weiße Flecken sichtbar.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig3.jpg"> Abbildung 3 : Schema der 3D organotypischen Haut Modellbau. Die Hautprobe Fettgewebe entfernen und in kleine Stücke schneiden. Inkubation mit Dispase Lösung über Nacht bei 4 ° C erleichtert die Trennung der Epidermis von der Dermis. Isolierte primäre Fibroblasten und Keratinozyten sollte separat angebaut und zwischen Durchgang 4-6 und 3-4, bzw. verwendet werden. Anschließend kann die Generierung des Modells 3D Haut wie im Protokoll beschrieben vorgehen. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig4.jpg"> Abbildung 4 : 3D organotypischen Haut rekonstruiert zeigen eine Differenzierung Ebene ähnlich wie normale menschliche Haut. Paraffin Abschnitte Haut äquivalente (A) im Vergleich zu normalen menschlicher Haut (B) waren für den Ausdruck der Keratine 14 gefärbt (rot: λex 554 nm; λEm 568 nm) und 10, Involucrin (grün: λex 490 nm; λEm 525 nm ), Filaggrin (grün: λex 490 nm; λEm 525 nm), und Laminin 5 (grün: λex 490 nm; λEm 525 nm), und mit einem konfokale Fluoreszenzmikroskop analysiert. Zellkerne wurden visualisiert durch DAPI-Färbung (blau: λab 340 nm; λEm 488 nm). Immunhistochemische Untersuchung der 3D Full-dicke Haut äquivalente offenbarten richtige epidermalen Schichtung getrennten Schichten der Epidermis bildet, wie in der normalen menschlichen Haut zu sehen. Während Zellen aus den unteren epidermalen Schichten für Keratin 14 positiv gefärbt, unterschieden je mehr Zellen von der supra-Basalschicht zeigte Keratin 10 und Involucrin Färbung. Hoch differenzierte Zellen in der Nähe des Stratum corneums ausgedrückt Filaggrin. Laminin 5 Färbung zeigt, dass eine Basallamina erzeugt wird, um physiologisch der epidermalen dermalen Kompartiment (niedrigste Panel) herstellen. Diese Zahl wurde von Voersmann Et Al. übernommen 15 mit Erlaubnis. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig5.jpg"> Abbildung 5 : Die Anzahl und Größe der spontan gebildeten Melanom Nester können nicht vorhergesagt werden. De Novo Melanom Nest Bildung im dermalen Fach der volle Haut Mittel erreicht werden können, durch Mischen einer definierten Anzahl von Melanom-Zellen mit primäre Fibroblasten zum Einbetten von beiden Zelltypen in Kollagen Typ ich Matrix. Die Anzahl und Größe der spontan gebildeten Melanom Nester können nur von einer Reife 3D Haut rekonstruieren nach ca. 21 Tagen analysiert werden. Wie abgebildet aus zwei Proben (A) und (B), die Zahlen und die Größen der Melanom-Nester variieren zwischen den einzelnen Haut rekonstruiert. Infolgedessen ist es schwierig, diese Modelle zu validieren und die therapeutische Wirkung vorherzusagen. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig6.jpg"> Abbildung 6 : Melanom Sphäroide integriert Haut äquivalente rekapitulieren Hauptmerkmale des menschlichen kutanen Melanom Metastase. H & E gefärbt Paraffin Abschnitte des Tumors Sphäroide eingebettet in Haut äquivalente offenbart Sphäroide Hauptmerkmale mit nicht durchblutet menschlichen kutanen Melanom Metastasen in Vivozu teilen. Zwei Subpopulationen von Zellen sind deutlich erkennbar: eine periphere lebenden Subpopulation und zentrale Subpopulation, hauptsächlich bestehend aus geschrumpft, Apoptotic oder nekrotischen Zellen, die "nekrotische" Zentrum. Diese Verteilung der Tumor Zelle Subpopulationen garantiert der Sphäroid-Größe. Diese Zahl wurde von Voersmann Et Al. modifiziert 15 mit Erlaubnis. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell zu generieren, die sowohl die Architektur rekapituliert und mehrzelligen Komplexität einer Orgel/Tumor in Vivo aber gleichzeitig bietet Platz für systematische experimentelle Intervention.

Ein 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

a-3d-organotypic-melanoma-spheroid-skin-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

15.6K Aufrufe.  TU-Dresden. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine 3D organotypischen Melanom Sphäroid Hautmodell zu generieren, die sowohl die Architektur rekapituliert und mehrzelligen Komplexität einer Orgel/Tumor in Vivo aber gleichzeitig bietet Platz für systematische experimentelle Intervention.

Serie: A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with or without surgery. While platinum-based chemotherapy regimens currently represent the gold standard in terms of efficacy and are given in the vast majority of cases, new chemotherapy regimens, namely immunotherapy are emerging. However, the response rates and therapy resistance mechanisms for either chemo regimen are hard to predict and remain insufficiently understood. Broad variations of chemo and radiation resistance mechanisms are known to date. This study describes the development of a standardized, high-throughput in vitro assay to assess HNSCC cell line&#39;s response to various therapy regimens, and hopefully on primary cells from individual patients as a future tool for personalized tumor therapy. The assay is designed to being integrated into the quality-controlled standard algorithm for HNSCC patients at our tertiary care center; however, this will be subject of future studies. Technical feasibility looks promising for primary cells from tumor biopsies from actual patients. Specimens are then transferred into the laboratory. Biopsies are mechanically separated followed by enzymatic digestion. Cells are then cultured in ultra-low adhesion cell culture vials that promote the reproducible, standardized and spontaneous formation of three-dimensional, spheroid-shaped cell conglomerates. Spheroids are then ready to be exposed to chemo-radiation protocols and immunotherapy protocols as needed. The final cell viability and spheroid size are indicators of therapy susceptibility and therefore could be drawn into consideration in future to assess the patients&#39; likely therapy response. This model could be a valuable, cost-efficient tool towards personalized therapy for head and neck cancer.

We describe the evolution of a spheroid-based, three-dimensional in vitro model that enables us to test the current standard of experimental therapy regimens for head and neck squamous cell carcinoma on cell lines, aiming at evaluating therapy susceptibility and resistance on primary cells from human specimens in the future.

Therapie, die Tests in einem Sphäroid-basierten 3D Kultur Zellmodell für Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Forschung

Krebsforschung

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

Identifikation, histologische Charakterisierung und Dissektion der Maus Prostata Lappen für In-vitro-3D Sphäroid Kultur Modelle

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

Ein Sphäroid Tötung Assay von Auto-T-Zellen

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture vessels versus in vivo in human patients. This is due to the bottleneck selection of clonal populations of melanoma cells that can robustly grow in vitro in the absence of physiological conditions. Further, responses to therapy in two-dimensional tissue cultures overall do not faithfully reflect responses to therapy in melanoma patients, with the majority of clinical trials failing to show the efficacy of therapeutic combinations shown to be effective in vitro. Although xenografting of melanoma cells into mice provides the physiological in vivo context absent from two-dimensional tissue culture assays, the melanoma cells used for engraftment have already undergone bottleneck selection for cells that could grow under two-dimensional conditions when the cell line was established. The irreversible alterations that occur as a consequence of the bottleneck include changes in growth and invasion properties, as well as the loss of specific subpopulations. Therefore, models that better recapitulate the human condition in vivo may better predict therapeutic strategies that effectively increase the overall survival of patients with metastatic melanoma. The patient-derived xenograft (PDX) technique involves the direct implantation of tumor cells from the human patient to a mouse recipient. In this manner, tumor cells are consistently grown under physiological stresses in vivo and never undergo the two-dimensional bottleneck, which preserves the molecular and biological properties present when the tumor was in the human patient. Notable, PDX models derived from organ sites of metastases (i.e., brain) display similar metastatic capacity, while PDX models derived from therapy naive patients and patients with acquired resistance to therapy (i.e., BRAF/MEK inhibitor therapy) display similar sensitivity to therapy.

Patient-derived xenograft (PDX) models more robustly recapitulate melanoma molecular and biological features and are more predictive of therapy response compared to traditional plastic tissue culture-based assays. Here we describe our standard operating protocol for the establishment of new PDX models and the characterization/experimentation of existing PDX models.

Ein melanompatientenabgeleitetes Xenograft-Modell

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

Beurteilung der Zelllebensfähigkeit und des Todes in 3D-Sphäroidkulturen von Krebszellen

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

Ein 3D-Spheroid-Modell als physiologischeres System für krebsassoziierte Fibroblasten Differenzierung und Invasion In Vitro-Studien

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and invasive potential of cancer cells, and consequently the metastatic spread of disease, are being discovered and considered as complementary treatments in highly invasive cancers such as gliomas. Thus, generating data enabling the detailed analyses of cells in a 3D environment following the addition of a drug is required. The methodology described here, combining spheroid invasion assays with high-resolution image capture and data analysis by confocal laser scanning microscopy (CLSM), enabled detailed characterization of the effects of the potential anti-migratory inhibitor MI-192 on glioma cells. Spheroids were generated from cell lines for invasion assays in low adherent 96-well plates and then prepared for CLSM analysis. The described workflow was preferred over other commonly used spheroid-generating techniques due to both ease and reproducibility. This, combined with the enhanced image resolution attained by confocal microscopy compared to conventional wide-field approaches, allowed the identification and analysis of distinct morphological changes in migratory cells in a 3D environment following treatment with the migrastatic drug MI-192.

The effects of migrastatic inhibitors on glioma cancer cell migration in three-dimensional (3D) invasion assays using a histone deacetylase (HDAC) inhibitor are characterized by high-resolution confocal microscopy.

Charakterisierung der Auswirkungen von Migrastatischen Inhibitoren auf die 3D-Tumorsphäroid-Invasion durch hochauflösende Konfokalmikroskopie

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident stem cells are relatively quiescent with niche restraints in adult tissues, they enter the cell cycle in anchor-free three-dimensional (3D) culture and undergo both symmetric and asymmetric cell division, giving rise to both stem and progenitor cells. The latter proliferate rapidly and are the major cell population at various stages of lineage commitment, forming heterogeneous spheroids. Using primary normal human prostate epithelial cells (HPrEC), a spheroid-based, label-retention assay was developed that permits the identification and functional isolation of the spheroid-initiating stem cells at a single cell resolution.
HPrEC or cell lines are two-dimensionally (2D) cultured with BrdU for 10 days to permit its incorporation into the DNA of all dividing cells, including self-renewing stem cells. Wash out commences upon transfer to the 3D culture for 5 days, during which stem cells self-renew through asymmetric division and initiate spheroid formation. While relatively quiescent daughter stem cells retain BrdU-labeled parental DNA, the daughter progenitors rapidly proliferate, losing the BrdU label. BrdU can be substituted with CFSE or Far Red pro-dyes, which permit live stem cell isolation by FACS. Stem cell characteristics are confirmed by in vitro spheroid formation, in vivo tissue regeneration assays, and by documenting their symmetric/asymmetric cell divisions. The isolated label-retaining stem cells can be rigorously interrogated by downstream molecular and biologic studies, including RNA-seq, ChIP-seq, single cell capture, metabolic activity, proteome profiling, immunocytochemistry, organoid formation, and in vivo tissue regeneration. Importantly, this marker-free functional stem cell isolation approach identifies stem-like cells from fresh cancer specimens and cancer cell lines from multiple organs, suggesting wide applicability. It can be used to identify cancer stem-like cell biomarkers, screen pharmaceuticals targeting cancer stem-like cells, and discover novel therapeutic targets in cancers.

Using human primary prostate epithelial cells, we report a novel biomarker-free method of functional characterization of stem-like cells by a spheroid-based label-retention assay. A step-by-step protocol is described for BrdU, CFSE, or Far Red 2D cell labeling; three-dimensional spheroid formation; label-retaining stem-like cell identification by immunocytochemistry; and isolation by FACS.

Isolierung von Stammzellen aus 3-dimensionalen Sphäroidkulturen

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro model in the study of cancer stem/initiating cells, preclinical cancer research, and drug screening. The 3D spheroid models are superior to conventional tumor cell culture and reproduce some important characters of real solid tumors. However, conventional 3D tumor spheroids are made up exclusively of tumor cells. They lack the participation of tumor stromal cells and have insufficient extracellular matrix (ECM) deposition, thus only partially mimicking the in vivo conditions of tumor tissues. We established a new multicellular 3D spheroid model composed of tumor cells and stromal fibroblasts that better mimics the in vivo heterogeneous tumor microenvironment and its native desmoplasia. The formation of spheroids is strictly regulated by the tumor stromal fibroblasts and is determined by the activity of certain crucial intracellular signaling pathways (e.g., Notch signaling) in stromal fibroblasts. In this article, we present the techniques for coculture of tumor cells-stromal fibroblasts, time-lapse imaging to visualize cell-cell interactions, and confocal microscopy to display the 3D architectural features of the spheroids. We also show two examples of the practical application of this 3D spheroid model. This novel multicellular 3D spheroid model offers a useful platform for studying tumor-stroma interaction, elucidating how stromal fibroblasts regulate cancer stem/initiating cells, which determine tumor progression and aggressiveness, and exploring involvement of stromal reaction in cancer drug sensitivity and resistance. This platform can also be a pertinent in vitro model for drug discovery.

A novel three-dimensional spheroid model based on the heterotypic interaction of tumor cells and stromal fibroblasts is established. Here, we present coculture of tumor cells and stromal fibroblasts, time-lapse imaging, and confocal microscopy to visualize the formation of spheroids. This three-dimensional model offers a pertinent platform to study tumor-stroma interactions and test cancer therapeutics.

Ein neuartiges Stromal Fibroblast-moduliertes 3D-Tumor-Sphäroid-Modell zur Untersuchung der Tumor-Stroma-Interaktion und der Arzneimittelforschung

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were developed. These models may be particularly important in the field of neuro-oncology. Indeed, brain tumors have the tendency to invade the healthy brain environment. We describe herein an ideal 3D glioblastoma spheroid-based assay that we developed to study tumor invasion. We provide all technical details and analytical tools to successfully perform this assay.

Here, we describe an easy-to-use invasion assay for glioblastoma. This assay is suitable for glioblastoma stem-like cells. A Fiji macro for easy quantification of invasion, migration, and proliferation is also described.

Ein 3D Spheroid Modell für Glioblastom

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...