يمكن أن يساعد فحص المكتبة المتحولة والدراسات المستنسخة لمسببات الأمراض داخل الخلايا في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول التكيفات الجينومية والتنظيمية لمسببات الأمراض ذات الاهتمام التي تستخدم للبقاء على قيد الحياة داخل المضيف. المزايا الرئيسية لهذه التقنيات هي أنها تقنيات واسعة النطاق التحقيق, وأنها توفر رؤية موضوعية في التكيف مع الحياة داخل الخلايا. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنيات نحو علاج خراج المتفطرة الذي يرتبط بهذا المرض من خلال إعطاء نظرة ثاقبة عن الأهداف المحتملة للعلاج باللقاحات.
تبدأ من خلال زراعة أميبا Acanthamoeba كاستيلاني، أو AC، في 30 ملليلتر من بيبتون الخميرة المتوسط في 75 قارورة زراعة 75 سم مربع النسيج في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة واحدة استخدام ماصة 25 ملليلتر لإزالة افرنح، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع 10 ملليلتر من AC العازلة دون الكربون أو النيتروجين في غسل. بعد الغسيل الأخير، قم بفصل الأميبا من قاع القارورة مع هزة قوية واحدة، وضبط الخلايا في أنبوب فالكون، إلى خمس مرة 10 إلى الأميبا الخمسة لكل ميل تركيز في عازلة AC الطازجة.
البذور خمس مرات 10 إلى الأميبا الأربعة في بئر في لوحة 96-well. ضع اللوحة عند درجة 32 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة دون اهتزاز ، للسماح لـ الأميبا العائمة بالارتباك على الآبار. وفي الوقت نفسه، تدفئة البكتيريا على الجليد، وإضافة خمسة ميكرولترات من البكتيريا المذابة إلى كل بئر في نهاية الحضانة.
بعد 1.5 ساعة في 32 درجة مئوية، والتخلص من المنافق عن طريق عكس لوحة على كومة من الشاش العقيم في علبة معدنية معقمة تحت غطاء الدخان. غسل كل بئر ثلاث مرات مع 200 ميكرولترات من متوسطة Ac الطازجة في البئر. بعد الغسيل الأخير ، احتضان الثقافة المشتركة مع 20 ميكرولترات من المتوسط الطازجة المكملة مع الأميكاسين في البئر ، للقضاء على أي بكتيريا ميكروباتيريا خارج الخلية المتبقية لمدة ساعتين.
تليها ثلاثة يغسل في المتوسط AC الطازجة، كما أظهرت للتو. ثم، إضافة 200 ميكرولترات من المتوسط، تستكمل مع أميكاسين الطازجة إلى كل بئر، تليها إضافة خمسة أضعاف 10 إلى البكتيريا الإشريكية القولونية Escherichia المعطلة الحرارة السبعة. بعد 48 ساعة، lyse الخلايا مع 10 ميكرولترات من 10٪ الصوديوم دوديسيل كبريتات في البئر، لمدة 30 دقيقة في 32 درجة مئوية، ونشر خمسة ميكرولترات من lysate على لوحات كولومبيا أجار التي تحتوي على 5٪ من دم الأغنام.
مزيد من تخفيف lysates بإضافة 25 ميكرولترات من الماء المعقم على كل قطرة. عندما تم مطلي جميع ال ليسات، ختم لوحات مع فيلم البارافين البلاستيك، واحتضان الثقافات لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام في 37 درجة مئوية. عندما تظهر المستعمرات على اللوحات ، تصور الثقافات وتعرف على المسوخ التي تضعف للنمو داخل الخلايا من الرواسب مع أقل عدد من المستعمرات البكتيرية.
لاستخراج الحمض النووي الريبي داخل الخلايا، تنمو أولا M.خراج في 7H9 المتوسطة تكمل مع الجلسرين والجلوكوز إلى مرحلة منتصف الأسية في أنابيب 50 ملليلتر في 120 دورة في الدقيقة. في نهاية الثقافة، وغسل البكتيريا مرتين مع 10 ملليلتر من AC العازلة في غسل، وقياس O.D.600 لتقدير تركيز البكتيريا. بعد ذلك، إضافة 8.5 مرات 10 إلى ثمانية mycobacteria إلى 8.5 مرات 10 إلى الأميبا الستة في 10 ملليلتر من متوسطة Ac الطازجة لاحتضان ساعة واحدة في 30 درجة مئوية و 80 دورة في الدقيقة.
في نهاية الحضانة، حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وغسل بيليه ثلاث مرات في 10 ملليلتر من عازلة AC الطازجة في غسل تحت نفس شروط الطرد المركزي. ثم إعادة تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من المخزن المؤقت AC الطازجة تكملها amikacin للقضاء على أي بكتيريا خارج الخلية، واحتضان الخلايا لمدة أربع ساعات في 30 درجة مئوية و 80 دورة في الدقيقة، تليها اثنين من يغسل في عازلة AC الطازجة. بعد الغسيل الأخير ، إعادة تعليق الأميبا المصابة في أربعة ملليلتر من محلول بارد ثلاثة ، تكملها 280 ميكرولتر من بيتا mercaptoethanol لتعطيل الأميبا على الجليد لمدة 10 دقائق.
في نهاية الحضانة، الطرد المركزي الخلية lysate إلى بيليه البكتيريا داخل الخلايا المنبعثة، وإعادة تعليق بيليه البكتيرية في ملليلتر واحد من محلول بارد ثلاثة. من المهم إزالة جميع المنافقين لتجنب التلوث بالحمض النووي الريبي أو البروتياز الذي قد يكون صنع العينات. حصاد البكتيريا المفرج عنها مع الطرد المركزي الثاني، وإعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من العازلة استخراج.
ثم احتضان لمدة 24 ساعة في درجة مئوية سلبية 80. نقل الحل الفطري في اثنين من أنابيب المسمار ملليلتر التي تحتوي على حبات الزركونيوم تصل إلى 500 ميكرولتر تدرج علامة، وتخزين الأنابيب لمدة 24 ساعة أخرى في درجة مئوية سلبية 80 لتسهيل تنشيط SYN RNA و انحلال الخلية. في يوم التحليل ، ذوبان العينات على الجليد ، وتحلل الخلايا بجولتين من التجانس عند 6000 دورة في الدقيقة لمدة 25 ثانية ، تليها التجانس جولة واحدة عند 6000 دورة في الدقيقة لمدة 20 ثانية.
بين كل جولة من التجانس، تبريد العينات على الجليد لمدة دقيقة واحدة لتجنب تدهور الحمض النووي الريبي. بعد الجولة الثالثة من التجانس، تبريد العينات على الجليد لمدة 20 دقيقة، وإضافة 200 ميكرولترات من الكلوروفورم المخفف في الكحول ايساميل إلى كل أنبوب. دوامة لمدة دقيقة واحدة، ثم الطرد المركزي العينات، وإضافة 0.8 ملليلتر من isopropanol الباردة إلى المرحلة مائي لمدة ساعتين إلى ثلاث حضانة في درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة، الطرد المركزي العينات مرة أخرى، وغسل الكريات في 500 ميكرولترات من الإيثانول البارد 70٪دون خلط. ثم إزالة فورا الإيثانول عن طريق الطرد المركزي. التعرق لتجفيف الكريات في مكثف الطرد المركزي، وإعادة تعليق الكريات في 100 ميكرولترات من الحمض النووي / RNA خالية من المياه.
استخراج MRNA Mycobacterial كما هو موضح، يسمح بتقييم الأسر الجينات المستحثة ومكبوتة عن طريق تجميع الجينات وفقا لأدوارهم في الاستجابة للبيئة محدودة في انها مصدر المواد الغذائية والمعادن، أو إلى نقص الأكسجة أو بيئة حمضية. في مقاومة الإجهاد التأسدي والنيتروسمي ، أو في التعبير عن عوامل الفوعة استجابة لـ الأميبا البيئية. أثناء محاولة تلك الإجراءات، من المهم أن نتذكر أن تؤدي إلى عزل الرنا والثقافة للعينات الخاضعة للرقابة والمصابين في نفس الوقت لتجنب الآثار دفعة.
بعد هذا الإجراء، يمكن أن تكون أساليب أخرى مثل تسلسل الحمض النووي الريبي المزدوج preformed للإجابة على أسئلة إضافية حول التفاعلات المسببة للأمراض المضيف. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الميكروبيولوجيا نحو الفوعة الفطرية في نموذج مضيف الأميبا. لا ننسى أن العمل مع الأميبا قد تكون خطرة للغاية، كما قد تتحول الأميبا إلى الخراجات إذا كنت لا تتبع الخطوات المذكورة في الإجراء.
