Mutantes Bibliotheksscreening und transkriptomische Studien an intrazellulären Krankheitserregern können dabei helfen, wichtige Fragen zu genomischen und regulatorischen Anpassungen von Krankheitserregern zu beantworten, die verwendet werden, um im Inneren des Wirts zu überleben. Die Hauptvorteile dieser Techniken sind, dass sie groß angelegte Untersuchungstechniken sind und einen objektiven Einblick in die Anpassung an das intrazelluläre Leben bieten. Die Implikationen dieser Techniken reichen auf die Therapie von Mycobacterium abscessus, die mit dieser Krankheit in Verbindung gebracht werden, indem sie Einblicke in mögliche Ziele für die Impfstofftherapie geben.
Beginnen Sie mit der Kultivierung von Amöben Acanthamoeba castellani, oder Ac, in 30 Milliliter Peptone Hefe Glukose Medium in 75 Quadratzentimeter Gewebekultur Kolben bei Raumtemperatur. Nach einer Stunde verwenden Sie eine 25 Milliliter Pipette, um den Überstand zu entfernen, und waschen Sie die Zellen dreimal mit 10 Milliliter Ac Puffer ohne Kohlenstoff oder Stickstoff pro Wäsche. Nach der letzten Wäsche die Amöbe mit einem einzigen kräftigen Shake vom Boden des Kolbens lösen und die Zellen in einem Falcon-Rohr auf fünf Mal 10 auf die fünf Amöben pro mil Konzentration in frischem Ac-Puffer einstellen.
Säen Sie fünfmal 10 bis zu den vier Amöben pro Brunnen in einer 96-Well-Platte. Legen Sie die Platte bei 32 Grad Celsius für eine Stunde ohne schütteln, damit die schwimmenden Amöben-Tropho-Zoiten an den Brunnen haften. In der Zwischenzeit erwärmen Sie die Bakterien auf Eis, und fügen Sie fünf Mikroliter der aufgetauten Bakterien zu jedem Brunnen am Ende der Inkubation.
Nach 1,5 Stunden bei 32 Grad Celsius den Überstand entsorgen, indem Sie die Platte auf einen Stapel steriler Gaze in einer sterilisierten Metallschale unter einer Dunstabzugshaube umkehren. Waschen Sie jeden Gut dreimal mit 200 Mikroliter frischeac Medium pro Brunnen. Nach der letzten Wäsche, inkubieren Sie die Co-Kultur mit 20 Mikroliter frisches Medium mit Amikacin pro Brunnen ergänzt, um alle verbleibenden extrazellulären Mykobakterien für zwei Stunden zu beseitigen.
Gefolgt von drei Wärschonungen in frischem Ac-Medium, wie gerade gezeigt wurde. Dann fügen Sie 200 Mikroliter Medium, ergänzt mit frischem Amikacin zu jedem Brunnen, gefolgt von der Zugabe von fünf mal 10 zu den sieben Hitze inaktivierte Escherichia coli Bakterien. Nach 48 Stunden lysieren Sie die Zellen mit 10 Mikrolitern 10% Natriumdodecylsulfat pro Brunnen, für 30 Minuten bei 32 Grad Celsius, und verteilen Sie fünf Mikroliter des Lysats auf Columbia Agar Platten mit 5% Schafblut.
Verdünnen Sie die Lysate weiter, indem Sie 25 Mikroliter steriles Wasser auf jeden Tropfen hinzufügen. Wenn alle Lysate plattiert sind, versiegeln Sie die Platten mit Kunststoffparaffinfolie und bebrüten die Kulturen drei bis vier Tage bei 37 Grad Celsius. Wenn Kolonien auf den Platten erscheinen, fotografieren Sie die Kulturen und identifizieren Sie die Mutanten, die durch die Ablagerungen mit der niedrigsten Anzahl von Bakterienkolonien für das intrazelluläre Wachstum beeinträchtigt sind.
Für intrazelluläre Mykobakterien RNA-Extraktion, zuerst wachsen M.abscessus in 7H9 Medium ergänzt mit Glycerin und Glukose zur mittelexponentiellen Phase in 50 Milliliter-Röhren bei 120 RPM. Am Ende der Kultur, waschen Sie die Bakterien zweimal mit 10 Milliliter Ac Puffer pro Wäsche, und messen Sie die O.D.600, um die Bakterienkonzentration zu schätzen. Als nächstes fügen Sie 8,5 mal 10 zu den acht Mykobakterien zu 8,5 mal 10 zu den sechs Amöben in 10 Milliliter frischem Ac Medium für eine Stunde Inkubation bei 30 Grad Celsius und 80 RPM hinzu.
Am Ende der Inkubation ernten die Zellen durch Zentrifugation und waschen Sie das Pellet dreimal in 10 Milliliter n. Frischer Ac-Puffer pro Wäsche unter den gleichen Zentrifugenbedingungen. Dann suspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter frischen Ac Puffer mit Amikacin ergänzt, um alle extrazellulären Bakterien zu beseitigen, und inkubieren die Zellen für vier Stunden bei 30 Grad Celsius und 80 RPM, gefolgt von zwei Waschungen in frischem Ac-Puffer. Nach der letzten Wäsche die infizierte Amöbe in vier Milliliter kalter Lösung drei wieder aussetzen, ergänzt mit 280 Mikroliter Beta-Mercaptoethanol, um die Amöbe auf Eis für 10 Minuten zu stören.
Am Ende der Inkubation zentrifugieren Sie die Zelle, um die freigesetzten intrazellulären Bakterien zu pellet, und setzen Sie das bakterielle Pellet in einem Milliliter kalter Lösung drei wieder auf. Es ist wichtig, alle Überstand zu entfernen, um eine Kontamination mit Amöben-RNA oder Proteasen zu vermeiden, die die Proben gemacht haben könnten. Ernten Sie die freigesetzten Bakterien mit einer zweiten Zentrifugation, und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter Extraktionspuffer wieder auf.
Dann 24 Stunden bei negativen 80 Grad Celsius inkubieren. Übertragen Sie die mykobakterielle Lösung in zwei Milliliter-Schraubrohre mit Zirkoniumperlen bis zur 500-Mikroliter-Gradationsmarke und lagern Sie die Röhren weitere 24 Stunden bei negativen 80 Grad Celsius, um die RNA-Synaktivierung und Zellauflösung zu erleichtern. Tauen Sie am Tag der Analyse die Proben auf Eis auf und lysen Sie die Zellen mit zwei Homogenisierungsrunden bei 6000 RPM für 25 Sekunden, gefolgt von einer Rundenhomogenisierung bei 6000 RPM für 20 Sekunden.
Zwischen jeder Homogenisierungsrunde die Proben auf Eis für eine Minute abkühlen, um einen RNA-Abbau zu vermeiden. Nach der dritten Homogenisierungsrunde die Proben 20 Minuten auf Eis abkühlen und 200 Mikroliter Chloroform in Isoamylalkohol verdünnt in jedes Rohr geben. Wirbel für eine Minute, dann Zentrifugieren Sie die Proben, und fügen Sie 0,8 Milliliter kalteisopropanol in die wässrige Phase für eine zwei bis drei Stunden Inkubation bei negativen 20 Grad Celsius.
Am Ende der Inkubation die Proben wieder zentrifugieren und die Pellets in 500 Mikroliter kaltem 70%Ethanol ohne Mischen waschen. Dann sofort das Ethanol durch Zentrifugation entfernen. Aspirieren Sie den Überstand zum Trocknen der Pellets in einem Zentrifugalkonzentrator und setzen Sie die Pellets in 100 Mikroliter DNA/RNA-freiem Wasser wieder auf.
Die mykobakterielle MRNA-Extraktion, wie gezeigt, ermöglicht die Bewertung induzierter und unterdrückter Genfamilien, indem die Gene nach ihrer Rolle bei der Reaktion auf eine Umgebung gruppiert werden, die in ihrer Nährstoff- und Mineralquelle oder in einer hypoxischen oder sauren Umgebung begrenzt ist. In der Resistenz gegen oxidativen und nitrosativen Stress, oder in der Expression von Virulenzfaktoren als Reaktion auf UmweltAmöben. Beim Versuch dieser Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Kultur- und RNA-Isolierung der kontrollierten und infizierten Proben gleichzeitig durchzuführen, um Batch-Effekte zu vermeiden.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die duale RNA-Sequenzierung vorgeformt werden, um zusätzliche Fragen zu Wirtspathogen-Wechselwirkungen zu beantworten. Nach der Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Mikrobiologie in Richtung Mykobakterien-Virulenz im Amöben-Wirtsmodell. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Amöben extrem gefährlich sein kann, da sich die Amöbe in Zysten verwandeln könnte, wenn Sie die im Verfahren beschriebenen Schritte nicht befolgen.
