생리성 병원체의 돌연변이 도서관 검열 및 전사 연구는 호스트 내부에서 살아남기 위하여 이용되는 관심있는 병원체의 게놈 그리고 규정 적응에 관하여 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 대규모 조사 기술이며 세포 내 수명에 대한 적응에 대한 객관적인 통찰력을 제공한다는 것입니다. 이 기술의 의미는 백신 치료를 위한 잠재적인 표적에 통찰력을 줌으로써 이 질병에 연관되는 Mycobacterium 농양의 치료로 확장됩니다.
75 평방 센티미터 조직 배양 플라스크에서 펩톤 효모 포도당 배지의 30 밀리리터에서 아메바 아칸타모에바 카스텔라니 또는 Ac를 배양하여 시작합니다. 1시간 후에 25 밀리리터 파이펫을 사용하여 상체를 제거하고 세척당 탄소 또는 질소없이 Ac 버퍼 10 밀리리터로 세포를 세 번 씻습니다. 마지막 세척 후, 플라스크 의 바닥에서 아메바를 하나의 격렬한 흔들림으로 분리하고 팔콘 튜브에서 세포를 5회 10일 원당 5개의 아메배 농도로 조정한다.
96웰 플레이트에서 잘 당 4 개의 아메배에 5 번 10 번 시드. 부동 아메바 트로포 -zoites 우물에 부착 할 수 있도록, 흔들리지 않고 1 시간 동안 섭씨 32도에 접시를 배치합니다. 한편, 얼음에 박테리아를 따뜻하게하고, 배양의 끝에 각각 잘 해동 박테리아의 다섯 마이크로 리터를 추가합니다.
섭씨 32도에서 1.5시간 후에는 연기를 후지 아래 멸균된 금속 트레이에 멸균 거즈 더미에 접시를 뒤집어 서판을 버리십시오. 잘 세 번 씻어 200 마이크로 리터의 신선한 Ac 중간 개당. 마지막 세척 후, 2 시간 동안 남아있는 세포 외 균진을 제거하기 위해, 잘 당 amikacin으로 보충 신선한 매체의 20 마이크로 리터와 공동 배양.
그 다음에는 신선한 Ac 매체에 세 번의 세 가지 세가지 세정이 이어졌습니다. 그런 다음, 매질의 200 마이크로리터를 첨가하고, 신선한 아키카신으로 보충한 다음, 7개의 열 불활성 에슈리치아 대장균 균에 5회 10회 첨가하였다. 48시간 후, 10마이크로리터의 10마이크로리터를 음파10% 나트륨 으로 세포로 리세우하고, 섭씨 32도에서 30분 동안, 5%의 양피를 함유한 컬럼비아 아가 플레이트에 용액5마이크로리터를 퍼뜨리고 있다.
또한 각 낙하시에 멸균 수의 25 마이크로 리터를 추가하여 lysates를 희석. 모든 용하가 도금되면 플라스틱 파라핀 필름으로 접시를 밀봉하고 37도에서 3 ~ 4 일 동안 문화를 배양하십시오. 식민지가 접시에 나타날 때, 문화를 촬영하고 세균 성 식민지의 가장 낮은 수의 예금에 의해 세포 내 성장을 위해 손상된 돌연변이를 식별합니다.
세포 내 진균 RNA 추출을 위해, 먼저 120 RPM에서 50 밀리리터 튜브에서 중간 기하급수적인 단계로 글리세롤과 포도당으로 보충된 7H9 배지에서 M.농양을 성장시다. 배양의 끝에서, 세척당 Ac 버퍼10 밀리리터로 박테리아를 두 번 세척하고 O.D.600을 측정하여 박테리아 농도를 추정한다. 다음으로, 8개의 진균에 8.5배 10번을 추가하여 8.5배 10배, 6개의 아메배에 10밀리리터의 신선한 Ac 배지를 1시간 동안 30도, RPM 80°C로 첨가한다.
인큐베이션의 끝에서, 원심 분리에 의해 세포를 수확하고, 동일한 원심 분리 조건하에서 세척 당 신선한 Ac 버퍼의 10 밀리리터에 펠릿을 세 번 세척. 그런 다음 세포 외 균을 제거하기 위해 amikacin으로 보충 된 신선한 Ac 버퍼의 10 밀리리터에서 세포를 다시 중단하고 30 섭씨 및 80 RPM에서 4 시간 동안 세포를 배양한 다음 신선한 Ac 버퍼에서 두 개의 세서히를 넣습니다. 마지막 세척 후, 감염된 아메배는 3밀리리터의 4밀리리터로 다시 중단하여 베타 메르카토에탄올 280마이크로리터로 보충하여 10분 동안 얼음에 아메배를 방해합니다.
인큐베이션의 끝에서, 세포 용액을 원심분리하여 방출된 세포내 박테리아를 펠릿으로 만들고, 감기 용액 3의 1밀리리터에서 세균성 펠릿을 다시 중단한다. 시료를 만들었을 수도 있는 아메바 RNA 또는 프로테아제로 오염을 피하기 위해 모든 상체를 제거하는 것이 중요합니다. 방출된 박테리아를 두 번째 원심분리로 수확하고 추출 버퍼의 1밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.
그런 다음 음의 80도에서 24 시간 동안 배양하십시오. 진균용액을 지르코늄 구슬을 포함하는 2개의 밀리리터 나사 튜브로 500 마이크로리터 그라데이션 마크까지 옮기고, RNA syn 활성화 및 세포 용해를 용이하게 하기 위해 음수 80도에서 24시간 동안 튜브를 저장한다. 분석 당일, 얼음에 샘플을 해동하고, 25초 동안 6000 RPM에서 2라운드 균질화로 세포를 용해시키고, 그 다음에 6000 RPM에서 20초 동안 1라운드 균질화됩니다.
각 균일화 라운드 사이에 RNA 분해를 피하기 위해 얼음에 샘플을 1분 동안 식힙니다. 제3차 균질화 후, 얼음에 샘플을 20분 간 식히고, 각 튜브에 이소아밀 알코올로 희석된 클로로폼 200마이크로리터를 첨가한다. 1 분 동안 소용돌이, 다음 원심 분리 샘플을, 음의 20섭씨에서 2 ~ 3 시간 배양에 대한 수성 단계에 감기 이소 프로파놀의 0.8 밀리리터를 추가합니다.
인큐베이션의 끝에서, 원심 분리시 샘플을 다시, 혼합하지 않고 차가운 70 %의 마이크로 리터의 500 마이크로 리터에 펠릿을 세척. 그런 다음 원심 분리로 에탄올을 즉시 제거합니다. 원심 농축기에서 펠릿을 건조시키기 위한 상퍼를 흡인하고, DNA/RNA 가 없는 물의 100마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단한다.
입증된 바와 같이 균균 MRNA 추출은 영양소와 미네랄의 공급원, 또는 저산소 또는 산성 환경에 제한되는 환경에 대응하는 역할에 따라 유전자를 그룹화하여 유도및 억압된 유전자 가족의 평가를 허용합니다. 산화 및 질산 스트레스에 대한 저항성, 또는 환경 아메바에 대한 응답으로 독성 요인의 발현. 그 절차를 시도하는 동안, 배치 효과를 피하기 위해 동시에 제어 및 감염된 샘플의 배양 및 RNA 절연을 수행하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라, 듀얼 RNA 염기서열 분석 같은 다른 방법은 호스트 병원체 상호 작용에 대 한 추가 질문에 대답 하기 위해 미리 형성 될 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 아메바 호스트 모형에 있는 진균 독성을 향해 미생물학의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다. 아메바와 함께 일하는 것은 절차에 설명된 단계를 따르지 않으면 아메배가 낭종으로 변할 수 있으므로 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.
