والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تعكس نشاط RNA بوليميراز II بقياس مرنا المركبة حديثاً والتي لا تتأثر بتدهور الحمض النووي الريبي. وقد وصف هذا البروتوكول في الأصل باستخدام التهجين microarray، ولكن يمكن بسهولة اعتمادها إلى تسلسل عالية في جميع أنحاء من مرنا حديثا. ومن خلال هذا الإجراء، سيكون تياغو بابتيستا، وهو طالب سابق في الدراسات العليا من مختبرنا.
بعد تلقيح الخلايا S.cerevisiae، تنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع الانفعالات المستمرة في 150 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي، قياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر. تمييع الثقافة إلى OD600 من حوالي 0.1 في 100 ملليلتر من YPD المتوسطة.
يكبر الخلايا حتى OD600 حوالي 0.8. بعد ذلك، قياس OD600 من ثقافة بين عشية وضحاها S.pombe. تمييع هذه الثقافة إلى OD600 من حوالي 0.1 في 500 ملليلتر من ياس المتوسطة والسماح لها أن تنمو حتى OD600 هو تقريبا 0.8.
أولاً، أعد حلاً جديداً من اثنين من المول أربعة thiouracil. حافظ على الحل المعد في درجة حرارة الغرفة ومحميًا من الضوء. أضف حل أربعة-thiouracil إلى S.cerevisiae و S.pombe الثقافات بحيث التركيز النهائي هو خمسة ميليمولار.
احتضان S.cerevisiae و S.pombe الثقافات في 30 درجة مئوية و 32 درجة مئوية على التوالي مع الانفعالات المستمرة لمدة ست دقائق. بعد ذلك، إزالة aliquot صغيرة من كل ثقافة وعد الخلايا باستخدام إما عداد خلية تلقائية أو غرفة Neubauer. أجهزة الطرد المركزي في 2،500 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق لجمع الخلايا.
تجاهل الماثر وغسل الخلايا مع الجليد البارد مرة واحدة برنامج تلفزيوني. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 2،500 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، إعادة تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من الجليد البارد مرة واحدة برنامج تلفزيوني.
خلط الخلايا S.cerevisiae وS.pombe بنسبة ثلاثة إلى واحد. أجهزة الطرد المركزي العينات المختلطة في 2،500 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم إزالة برنامج تلفزيوني وفلاش تجميد الخلايا في النيتروجين السائل.
تخزين العينة في درجة مئوية سلبية 80 حتى جاهزة للاستخدام. عندما تكون جاهزة للمتابعة، ذاب الخلايا على الجليد لمدة 20 إلى 30 دقيقة تقريبا. استخدام الخميرة RNA طقم استخراج RNA لاستخراج RNA كما هو موضح في بروتوكول النص.
بعد ذلك، قم بنقل خرطوشة التصفية إلى أنبوب التجميع النهائي. Elute الجيش الملكي النيبالي مع 50 ميكرولترات من المياه المعالجة DEPC RNase الخالية التي كانت محمّلة إلى 100 درجة مئوية. جهاز طرد مركزي في 16،000 مرات ز لمدة دقيقة واحدة.
ثم استخدام 50 ميكروليتر من المياه المعالجة مسبقا DEPC RNase المعالجة ل elute الجيش الملكي النيبالي مرة أخرى إلى نفس الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي في 16،000 مرات ز لمدة دقيقة واحدة للتأكد من أن حجم العينة بأكمله قد مرت من خلال مرشح. وإذا لم يحدث ذلك، فإن الطرد المركزي مرة أخرى لفترة أطول من الزمن.
عند الانتهاء، وتحديد والتحقق من نقاء العينة باستخدام المعدات المناسبة. استخدام DEPC المعالجة الخالية من النيوكلاز المياه لضبط تركيز الحمض النووي الريبي المكتسبة سابقا إلى اثنين ملليغرام لكل ملليلتر. Aliquot 200 ميكروغرام من مجموع الحمض النووي الريبي وتسخينه في 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
على الفور البرد على الجليد لمدة دقيقتين. أضف 600 ميكروليتر من المياه الخالية من RNase المعالجة من DEPC. إضافة 100 ميكرولترات من العازلة biotinylation ثم إضافة 200 ميكرولترات من HPDP الحيوي.
إذا كان حل HPDP البيوتين يترسب من الحل، زيادة حجم DMSO أو DMF تصل إلى 40٪ من حجم التفاعل كما هو موضح في بروتوكول النص. حماية العينة من الضوء واحتضانها في درجة حرارة الغرفة مع التحريض لطيف لمدة ثلاث ساعات. بعد ذلك، إضافة حجم متساو تقريبا من الكلوروفورم إلى الأنابيب ومزيج بقوة.
جهاز طرد مركزي في 13،000 مرة ز و أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. المقبل، بعناية نقل المرحلة العليا إلى أنابيب ملليلتر جديدة. إضافة كمية من خمسة كلوريد الصوديوم الضرس يساوي حوالي 1/10 من حجم العينة.
ثم اخلطي العينة. أولاً، سخني الحمض النووي الريبي الحيوي عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم هدئ عينات على الجليد لمدة خمس دقائق.
إضافة 100 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي Streptavidin المغلفة إلى الحمض النووي الريبي biotinylated. احتضان في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز طفيف لمدة 90 دقيقة. ضع الأعمدة المقدمة مع المجموعة في الحامل المغناطيسي.
بعد ذلك، أضف 900 ميكرولترات من غرفة درجة حرارة الغسيل العازلة إلى الأعمدة. تطبيق 200 ميكروليتر حبة وخلط الحمض النووي الريبي على الأعمدة. جمع تدفق من خلال في أنابيب 1.5 ملليلتر ومن ثم تطبيقه مرة أخرى على نفس العمود المغناطيسي.
الحفاظ على هذا التدفق من خلال إذا لزم الأمر كما يمثل كسر RNA unlabeled. لبدء التحقق من صحة RT-qPCR من الكسور المختلفة، أولاً توليف cDNA كما هو موضح في النص. ثم تضخيم cDNA عن طريق qPCR في الوقت الحقيقي باستخدام بروتوكول قياسي.
المستويات المقاسة من النصوص في الكسور المنقاة من الخلايا البرية من النوع المستزرعة مع وبدون أربعة thiouracil أكد هذا الإجراء ينقي على وجه التحديد RNA المسمى. تحليل سلالة دلتا spt20 يكشف أن كمية من إجمالي الحمض النووي الريبي ثابت الدولة لم يتغير إلى حد كبير أو هو فقط أقل قليلا للجينات اختبارها. وينظر إلى نتائج مماثلة لسلالات حذف لbre1.
ومع ذلك، فإن تحليل الحمض النووي الريبي المنسوخ حديثاً في سلالة دلتا SPT20 يكشف عن انخفاض بنسبة ثلاثة إلى خمسة أضعاف في تخليق مرناً لجميع الجينات المختبرة. وفي الوقت نفسه، وفقدان bre1 يؤدي إلى انخفاض أكثر سرية ولكن لا تزال مرئية. عند استنفاد غير قابل للاستنفاد من spt7، وحدة فرعية هيكلية من مجمع الملحمة، يتم تخفيض مستويات مرنا حديثا نسخها إلى حد مماثل للضغط الحذف.
عندما يتم قياس مستويات الحمض النووي الريبي الإجمالية عن طريق التحليل على نطاق الجينوم، يُنظر إلى عدد قليل فقط من الجينات على أن مستويات التعبير الخاصة بها قد تغيرت عند حذف spt20 إما عن طريق التنظيم أو التنظيم لأسفل. ومع ذلك ، فإن تحليل الحمض النووي الريبي المنسوخ حديثًا يكشف عن أن مستويات أكثر من 4000 جينات يتم تقليلها بشكل كبير على الأقل شقين عند حذف spt20 مما يشير إلى تأثير إيجابي عالمي للملحمة على نسخ RNA POLYMERase II في الخمائر الناشئة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في النسخ في Saccharomyces cerevisiae، تم تطبيقه فقط مع اختلافات طفيفة لاستخدام هذا البروتوكول، يمكننا الكشف عن انخفاض عالمي في تخليق مرنا الذي تم تعويضه من قبل انخفاض عالمي في تدهور الحمض النووي الريبي.
