A principal vantagem desta técnica é que ela reflete a atividade de polimerase II do RNA medindo mRNA recém-sintetizado que não são influenciados pela degradação do RNA. Este protocolo foi originalmente descrito usando hibridização de microarray, mas pode ser facilmente adotado para sequenciamento de alta duração de mRNA recém-transcrito. Demonstrando esse procedimento estará Tiago Baptista, ex-aluno de pós-graduação do nosso laboratório.
Depois de inocular as células S.cerevisiae, cresça-as durante a noite a 30 graus Celsius com agitação constante a 150 RPM. No dia seguinte, meça a densidade óptica em 600 nanômetros. Diluir a cultura para um OD600 de aproximadamente 0,1 em 100 mililitros de meio YPD.
Cresça as células até que o OD600 esteja em torno de 0,8. Depois disso, meça o OD600 da cultura S.pombe da noite para o dia. Diluir esta cultura para um OD600 de aproximadamente 0,1 em 500 mililitros de meio YAS e deixá-lo crescer até que o OD600 seja aproximadamente 0,8.
Primeiro, prepare uma nova solução de dois molares de quatro tiocral. Mantenha a solução preparada à temperatura ambiente e protegida da luz. Adicione a solução de quatro tioracil às culturas S.cerevisiae e S.pombe de tal forma que a concentração final seja de cinco mililitros.
Incubar as culturas S.cerevisiae e S.pombe a 30 graus Celsius e 32 graus Celsius, respectivamente, com agitação constante por seis minutos. Depois disso, remova uma pequena alíquota de cada cultura e conte as células usando um contador automático de células ou uma câmara de Neubauer. Centrífuga a 2.500 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos para coletar as células.
Descarte o supernasce e lave as células com gelo frio uma vez PBS. Centrifugar novamente a 2.500 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, resuspense as células em cinco mililitros de gelo frio uma vez PBS.
Misture as células S.cerevisiae e S.pombe a uma proporção de três para um. Centrifugar as amostras mistas a 2.500 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, remova o PBS e congele as células em nitrogênio líquido.
Armazene a amostra a 80 graus Celsius negativo até estar pronto para usar. Quando estiver pronto para prosseguir, descongele as células no gelo por aproximadamente 20 a 30 minutos. Use um kit de extração de RNA de levedura adaptado para extrair o RNA conforme descrito no protocolo de texto.
Depois disso, transfira o cartucho do filtro para o tubo de coleta final. Elute o RNA com 50 microliters de água livre de RNase tratada com DEPC que foi pré-aquecido a 100 graus Celsius. Centrifugar a 16.000 vezes por um minuto.
Em seguida, use 50 microliters de água pré-aquecido tratado de RNase tratado com DEPC para elutar o RNA novamente para o mesmo tubo. Centrifugar a 16.000 vezes g por um minuto certificando-se de que todo o volume da amostra passou pelo filtro. Se não o fez, centrífuga novamente por um período maior de tempo.
Quando terminar, quantifique e verifique a pureza da amostra utilizando o equipamento apropriado. Use água sem nuclease tratada com DEPC para ajustar a concentração do RNA adquirido anteriormente para dois miligramas por mililitro. Alíquota de 200 microgramas de RNA total e aqueça-o a 60 graus Celsius por 10 minutos.
Imediatamente esfrie no gelo por dois minutos. Adicione 600 microliters de água sem RNase tratada com DEPC. Adicione 100 microliters de tampão de biotiningação e, em seguida, adicione 200 microliters de biotina HPDP.
Se a solução biotina HPDP precipitar-se fora da solução, aumente o volume de DMSO ou DMF em até 40% do volume de reação, conforme descrito no protocolo de texto. Proteja a amostra da luz e incuba-a à temperatura ambiente com agitação suave por três horas. Depois disso, adicione um volume aproximadamente igual de clorofórmio aos tubos e misture vigorosamente.
Centrifugar a 13.000 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, transfira cuidadosamente a fase superior para novos dois tubos mililitros. Adicione uma quantidade de cinco cloreto de sódio molar igual a aproximadamente 1/10 do volume amostral.
Em seguida, misture a amostra. Primeiro, aqueça o RNA biotinilado a 65 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, esfrie as amostras no gelo por cinco minutos.
Adicione 100 microliters de contas magnéticas revestidas de Streptavidin ao RNA biotinilado. Incubar em temperatura ambiente com leve tremor por 90 minutos. Coloque as colunas fornecidas com o kit no suporte magnético.
Em seguida, adicione 900 microliters de tampão de lavagem de temperatura ambiente às colunas. Aplique a mistura de 200 microliter e RNA nas colunas. Colete o fluxo em tubos de 1,5 mililitro e, em seguida, aplique-o novamente na mesma coluna magnética.
Mantenha este fluxo, se necessário, pois representa a fração de RNA sem rótulo. Para iniciar a validação rt-qPCR das diferentes frações, primeiro sintetize o CDNA conforme descrito no texto. Em seguida, amplie o cDNA por qPCR em tempo real usando um protocolo padrão.
Os níveis medidos de transcrições em frações purificadas de células do tipo selvagem cultivadas com e sem quatro tioracil confirmaram que este procedimento purifica especificamente o RNA rotulado. A análise da cepa delta spt20 revela que a quantidade de RNA de estado estável total é em grande parte inalterada ou é apenas levemente reduzida para os genes testados. Resultados semelhantes são vistos para cepas excluídas para bre1.
No entanto, a análise do RNA recém-transcrito na cepa delta spt20 revela uma redução de três a cinco vezes na síntese de mRNA para todos os genes testados. Enquanto isso, a perda de bre1 leva a uma diminuição mais discreta, mas ainda visível. Após o esgotamento indutível do spt7, uma subunidade estrutural do complexo da saga, os níveis de mRNA recém-transcritos são reduzidos a uma medida semelhante à cepa de exclusão.
Quando os níveis totais de RNA são medidos pela análise em todo o genoma, apenas alguns genes são vistos com seus níveis de expressão alterados após a exclusão do spt20, seja regulando ou regulando. No entanto, a análise do RNA recém-transcrito revela que os níveis de mais de 4.000 genes são significativamente reduzidos pelo menos duas vezes após a exclusão do spt20, o que sugere um efeito positivo global da saga na transcrição da polimerase II do RNA em leveduras brotantes. Embora este método possa fornecer insights na transcrição em Saccharomyces cerevisiae, ele só foi aplicado com pequenas variações ao usar este protocolo, poderíamos detectar uma diminuição global na síntese de mRNA que foi compensada por uma diminuição global na degradação do mRNA.
