이 기술의 주요 장점은 RNA 분해에 의해 영향을 받지 않는 새로 합성된 mRNA를 측정하여 RNA 폴리머라제 II 활성을 반영한다는 것이다. 이 프로토콜은 원래 마이크로어레이 혼성화를 사용하여 설명되었지만 새로 전사된 mRNA의 고온 시퀀싱에 쉽게 채택될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 티아고 침례교, 우리의 실험실에서 전 졸업생이 될 것입니다.
S.cerevisiae 세포를 접종 한 후, 150 RPM에서 지속적인 동요와 섭씨 30도에서 하룻밤 을 성장. 다음 날, 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다. YPD 배지의 100 밀리리터에서 약 0.1의 OD600으로 배양을 희석시.
OD600이 약 0.8이 될 때까지 세포를 성장시다. 그 후, S.pombe 하룻밤 문화의 OD600을 측정합니다. 이 배양을 YAS 배지의 500밀리리터에서 약 0.1의 OD600으로 희석하고 OD600이 약 0.8이 될 때까지 자랄 수 있도록 한다.
먼저, 두 개의 어금니 4-티오라실의 신선한 솔루션을 준비한다. 준비된 솔루션을 실온에서 유지하고 빛으로부터 보호하십시오. 최종 농도가 5 밀리머인 S.cerevisiae 및 S.pombe 문화에 4-티오라실 용액을 추가합니다.
S.cerevisiae와 S.pombe 문화를 각각 섭씨 30도, 섭씨 32도에서 배양하고 6분 동안 지속적인 동요를 합니다. 그 후, 각 배양의 작은 알리쿼트를 제거하고 자동 세포 카운터 또는 노이바우어 챔버를 사용하여 세포를 계산합니다. 원심분리기는 세포를 수집하는 데 5분 동안 2, 500배, 섭씨 4도에서 분리됩니다.
상체를 버리고 얼음 차가운 한 번 PBS로 세포를 씻으십시오. 원심분리기는 다시 2, 500배, 섭씨 4도에서 5분간 다시 원심분리기를 사용한다. 다음으로, 얼음 의 5 밀리리터에 세포를 다시 일시 중단 한 번 PBS.
S.cerevisiae 및 S.pombe 세포를 3 대 1의 비율로 혼합합니다. 혼합 샘플을 2, 500배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리합니다. 그런 다음 PBS를 제거하고 액체 질소로 세포를 동결 플래시.
사용 준비가 될 때까지 샘플을 음수 섭씨 80도에 저장합니다. 진행 준비를 마쳤을 때, 약 20~30분 동안 얼음 에 세포를 해동하십시오. 적응된 효모 RNA 추출 키트를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 RNA를 추출합니다.
이 후 필터 카트리지를 최종 수집 튜브로 옮기습니다. 100섭씨까지 예열된 DEPC 처리 RNase 프리 워터 50 마이크로리터로 RNA를 엘테. 16, 000배 에서 1분간 원심분리기.
그런 다음 예열된 DEPC 처리 RNase 프리 워터 50 마이크로리터를 사용하여 RNA를 동일한 튜브로 다시 엘로트합니다. 원심분리기는 16, 000배 g에서 1분 동안 전체 샘플 볼륨이 필터를 통과했는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 원심분리기는 더 오랜 시간 동안 다시 원심분리기를 다시 합니다.
완료되면 적절한 장비를 사용하여 샘플의 순도를 정량화하고 확인하십시오. DEPC 처리 된 뉴클레아제없는 물을 사용하여 이전에 획득 한 RNA의 농도를 밀리리터 당 2 밀리그램으로 조정하십시오. Aliquot 200 마이크로그램의 총 RNA를 10분 동안 섭씨 60도에서 가열합니다.
즉시 2 분 동안 얼음에 차가운. DEPC 처리 RNase 가 없는 물 600마이크로리터를 추가합니다. 바이오타이니션 버퍼 100마이크로리터를 추가한 다음 200마이크로리터의 비오틴 HPDP를 추가합니다.
비오틴 HPDP 솔루션이 용액에서 침전되는 경우 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 반응 량의 최대 40%까지 DMSO 또는 DMF의 볼륨을 증가시합니다. 샘플을 빛으로부터 보호하고 3시간 동안 부드러운 교반으로 실온에서 배양합니다. 그 후, 튜브에 약 동일한 부피의 클로로폼을 추가하고 적극적으로 섞는다.
원심분리기는 13, 000배, 섭씨 4도에서 5분간. 다음으로 상층을 새로운 2밀리리터 튜브로 조심스럽게 옮기십시오. 시료 부피의 약 1/10에 해당하는 5개의 어금다 나트륨을 추가합니다.
그런 다음 샘플을 혼합합니다. 먼저 생체화 RNA를 섭씨 65도에서 10분간 가열합니다. 그런 다음 얼음에 샘플을 5 분 동안 식힙니다.
생체 화 RNA에 스트렙타비딘 코팅 마그네틱 구슬 100 마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 90분 동안 약간의 흔들림으로 배양하세요. 키트와 함께 제공된 컬럼을 마그네틱 스탠드에 놓습니다.
다음으로, 열에 실온 세척 버퍼의 900 마이크로 리터를 추가합니다. 200 마이크로리터 비드 및 RNA 혼합물을 컬럼에 적용합니다. 1.5 밀리리터 튜브에서 흐름을 수집한 다음 동일한 자기 컬럼에 다시 적용합니다.
라벨이 없는 RNA 분획을 나타내기 때문에 필요한 경우 이 흐름을 유지합니다. 다른 분획의 RT-qPCR 유효성 검사를 시작하려면 먼저 텍스트에 설명된 대로 cDNA를 합성합니다. 그런 다음 표준 프로토콜을 사용하여 실시간 qPCR으로 cDNA를 증폭시합니다.
4-티우라실의 유무에 관계없이 배양된 야생형 세포로부터 정제된 분획에서 측정된 성적증명서 수준은 이 절차가 특별히 표지된 RNA를 정화하는 것을 확인하였다. spt20 델타 균주의 분석은 총 정상 상태 RNA의 양이 크게 변하지 않거나 테스트 된 유전자에 대해서만 약간 감소한다는 것을 보여줍니다. bre1에 대해 삭제된 균주에 대해도 유사한 결과가 나오게 됩니다.
그러나, spt20 델타 균주에서 새로 전사된 RNA의 분석은 모든 시험된 유전자를 위한 mRNA 합성에 있는 3 5 배 감소를 제시합니다. 한편, bre1의 손실은 더 신중하지만 여전히 눈에 띄는 감소로 이어집니다. spt7의 유도 가능한 고갈시, 사가 복합체의 구조적 서브유닛, 새로 전사된 mRNA 수준은 삭제 균주와 유사한 정도로 감소된다.
총 RNA 수준이 게놈 전체 분석에 의해 측정될 때, 단지 몇몇 유전자는 spt20의 삭제 시 그들의 발현 수준이 위로 조절또는 아래로 조절에 의해 변경되는 것을 보입니다. 그러나, 새로 전사된 RNA의 분석은 4, 000 이상의 유전자의 수준이 신진 효모에서 RNA 폴리머라제 II 전사에 사가의 글로벌 긍정적 인 효과를 시사 하는 spt20의 삭제시 적어도 두 배 이상 감소되는 것으로 나타났습니다. 이 방법은 Saccharomyces cerevisiae에 있는 전사에 있는 통찰력을 제공할 수 있더라도, 이 프로토콜을 사용하여에 약간 변이로만 적용되었습니다, 우리는 mRNA 분해에 있는 글로벌 감소에 의해 보상된 mRNA 합성에 있는 글로벌 감소를 검출할 수 있었습니다.
