酿酒酵母4-硫尿嘧啶代谢标记及新合成 mRNA 作为 RNA 聚合酶 II. 活性的一种代理

该技术的主要优点是，它通过测量不受RNA降解影响的新合成mRNA来反映RNA聚合酶II活性。该协议最初使用微阵列杂交描述，但可以很容易地被采用到新转录的mRNA的高全序列。演示这个程序将是蒂亚戈巴普蒂斯塔，前研究生从我们的实验室。

接种S.cerevisiae细胞后，在30摄氏度下过夜，在150 RPM时持续搅拌。第二天，测量600纳米的光学密度。将培养量稀释到约 0.1 的 OD600，在 100 毫升 YPD 介质中。

成长的细胞，直到OD600是大约0.8。在此之后，测量S.pombe过夜文化的OD600。将这种培养剂稀释到约 500 毫升 YAS 介质中的 0.1 的 OD600，让它生长，直到 OD600 约为 0.8。

首先，准备一个新的解决方案，两个摩尔四硫化。将准备好的溶液保持室温，防止光线。将四硫化溶液添加到 S.cerevisiae 和 S.pombe 培养中，使最终浓度为 5 毫摩尔。

在30摄氏度和32摄氏度时，在30摄氏度和32摄氏度下培育S.cerevisiae和S.pombe培养，持续搅拌6分钟。在此之后，删除每个培养的一小部分，并使用自动细胞计数器或 Neubauer 腔室对细胞进行计数。在2，500倍g和4摄氏度的离心机5分钟收集细胞。

丢弃上清液，用冰冷洗涤细胞一次PBS。再次在2，500倍的g和4摄氏度下离心5分钟。接下来，将细胞重新在五毫升的冰冷中重新暂停一次PBS。

以三比一的比例混合S.cerevisiae和S.pombe细胞。将混合样品在2500倍g和4摄氏度下离心5分钟。然后取出PBS，将液氮中的细胞闪冻。

将样品存放在负 80 摄氏度，直到准备好使用。当准备继续时，在冰上解冻细胞约20至30分钟。使用经过改造的酵母RNA提取试剂盒提取文本协议中概述的RNA。

在此之后，将滤芯转移到最终收集管。用50微升DEPC处理的无RNase水来加热RNA，预热至100摄氏度。以16，000倍g的离心机一分钟。

然后使用 50 微升预热 DEPC 处理无 RNase 水将 RNA 再次加热到同一管。以 16，000 次 g 离心一分钟，确保整个样品体积通过过滤器。如果没有，则再次离心较长时间。

完成后，使用适当的设备对样品的纯度进行量化和检查。使用 DEPC 处理无核酸酶的水将以前获得的 RNA 的浓度调整为每毫升 2 毫克。200微克总RNA的等量，在60摄氏度下加热10分钟。

立即在冰上冷却两分钟。添加 600 微升 DEPC 处理的无 RNase 水。添加100微升生物素化缓冲液，然后加入200微升生物素HPDP。

如果生物素 HPDP 溶液沉淀出溶液，则将 DMSO 或 DMF 的体积增加至文本协议中所述的 40% 的反应量。保护样品免受光线的污染，并在室温下用温和的搅拌孵育三个小时。在此之后，在管中加入大约相等的氯仿体积，并大力混合。

在13，000倍的g和4摄氏度的离心机5分钟。接下来，小心地将上相转移到新的两毫升管中。加入相当于样品体积约1/10的五摩尔氯化钠。

然后混合样品。首先，在65摄氏度下加热生物素化RNA10分钟。然后在冰上冷却样品五分钟。

在生物素化RNA中加入100微升的斯特雷普他丁涂层磁珠。在室温下孵育，轻微摇晃90分钟。将套件提供的柱放在磁性支架中。

接下来，在柱子上加入900微升的室温洗涤缓冲液。将 200 微升珠和 RNA 混合物涂抹到柱上。收集1.5毫升管中的流经，然后再次将其应用到同一磁柱上。

如有必要，保持此流通过，因为它表示未标记的 RNA 分数。要开始对不同分数进行RT-qPCR验证，请先合成文本中概述的cDNA。然后使用标准协议通过实时 qPCR 放大 cDNA。

从野生细胞中纯化的份量中测得的转录量，与四硫化杆和未培养的四硫化细胞确认，这一程序特别净化了标有RNA的RNA。对spt20增量菌株的分析表明，总稳定态RNA的数量基本保持不变，或者只是被测试基因的轻微减少。对于删除的 bre1 菌株，也可以看到类似的结果。

然而，对spt20增量菌株中新转录的RNA的分析表明，所有被测试基因的mRNA合成减少了3到5倍。同时，bre1 的丢失导致更谨慎但仍然可见的下降。在 spt7 的可致耗尽后，saga 复合体、新转录的 mRNA 水平的结构子单元将降低到类似于删除应变的程度。

当通过全基因组分析测量总RNA水平时，只有少数基因在通过向上调节或向下调节来降低spt20的缺失时，其表达水平会有所改变。然而，对新转录的RNA的分析表明，在删除spt20时，超过4000个基因的含量显著降低至少两倍，这表明传奇对发芽酵母中RNA聚合酶II转录的全球积极影响。虽然这种方法可以提供对糖核糖精转录的见解，但它只是使用本协议，只有稍有变化，我们才能检测到mRNA合成的全局减少，而mRNA降解的全局减少可以补偿。