وقد أظهرت طريقة الكشف هذه المستندة إلى النانوبور إمكانية تحديد الجزيئات الفردية وتحديدها ماديًا. إن العمل مع الجسيمات النانوية المعدنية، وهو الغرض من هذا الفيديو، يشكل تحدياً لفهمنا لما يحد من دقة القياس ودقته. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أن هذا الجهاز لديه عرض النطاق الترددي أكبر من الدهون التقليدية bilayer الذاكرة إعداد، مما يتيح لنا رؤية نتائج أسرع والمزيد من ردود الفعل في نانوبور.
وقد أصبحت هذه التقنية ممكنة لأنه في أوائل التسعينات تبين أن الغائط في الجراثيم النانوية البروتينية، أي التبديل بين مختلف الولايات، يمكن السيطرة عليها ويمكن للجزيئات أن ترتبط بجدار المسام. ويجري تطوير هذه التقنية من أجل تطبيقات تسلسل الحمض النووي التجارية لأنها تستخدم عينات ضئيلة. لا يتطلب تسميات الفلورسنت ويستخدم أطوال قراءة أطول بكثير من الطرق التقليدية.
وقد تم تطوير هذه التقنية أيضا للتمييز بين البوليمرات على أساس حجمها مع دقة وسرعة أكبر من جل الكهربائية والكروماتوغرافيا. أولاً، إعداد 500 ملليلتر من محلول كلوريد الصوديوم أحادي الضرس وفوسفات أحادي الصوديوم بـ 10 ملليمولار في الماء فائق الخطورة كالكهرباء. فمن الأفضل لاستخدام حلول جديدة وعينات مع هذا الإعداد خاصة.
بالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن المياه ذات جودة عالية الأيونات مهمة جدا لتشكيل الأغشية بنجاح. المقبل, الجمع بين ملليغرام واحد من اليوفيليد البرية من نوع أحادية اللون S.aureus ألفا الهيموليسين مسحوق مع ملليلتر واحد من الماء فائقة الpure. لا ننسى أن العمل مع ستاف ألفا بروتين الهيمليسين السام يمكن أن تكون خطرة.
اتبع الاحتياطات في MSDS عند تنفيذ هذا الإجراء. المقبل, إعداد أربعة ملليلتر من خمسة ملليغرام لكل ملليلتر DPhyPC في التقاق في قارورة التلألؤ الزجاج. قم بتكشي القارورة بغطاء مبطن بالاثيلين المتعدد التيترافلورو واخزنها عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر.
بعد ذلك ، قم بحل 57.6 ملليغرام من هيدرات حمض فوسفوتونجستيك 12-phophotungstic في 10 ملليلتر من المنحل بالكهرباء لجعل محلول بوليوكسيمولات مليمولار اثنين. تقسيم حل POM إلى اثنين من أجزاء 5 ملليلتر. استخدم هيدروكسيد الصوديوم ثلاثي العث لضبط درجة الـ PH لمحلول POM واحد إلى 5.5.
للبدء في التحضير للاختبار، قم بتجميع خلية الاختبار لجهاز الفيزيولوجيا الكهربائية ثنائي الطبقات الدهنية. أولاً، أبرادي سلكاً فضياً مع ورق رملي 600-حصى ونقعه في التبييض القائم على هيبوكلوريت الصوديوم المتاح تجارياً لمدة 10 دقائق لصنع قطب الأسلاك كلوريد الفضة والفضة. شطف وتجفيف قطب الأسلاك قبل إدراجه في الشعرية الكوارتز من الجهاز.
الحفاظ على القطب داخل غشاء الكوارتز نانوبور، أو QNM، وفصل الشعيرات الدموية والخزان. ثم ضع قطب بيليد كلوريد كلوريد الفضة الفضي الأسطواني المثبت على سلك فضي في الخزان. قم بتوصيل كل من الأقطاب الكهربائية بلوحة دوائر مكبر للصوت.
بعد ذلك، افتح برنامج الحصول على البيانات وابدأ تشغيل مصدر الطاقة عند الصفر. تأكد من عدم اكتشاف أي تيار DC بين الأقطاب الكهربائية في الخلية الفارغة. خلال هذه المظاهرة من المهم مشاهدة كيف يمكن أن يؤثر ضغط عبر الرأس على تكوين الغشاء وتشكيل النانو اللاحق.
دون القيام بهذه الخطوات اثنين بشكل صحيح، لن تنجح التجارب. تحميل حوالي ملليلتر من المنحل بالكهرباء في حقنة وتوصيله بخط السوائل المتصل بالخزان. إضافة المنحل بالكهرباء إلى الخزان حتى يتم غمر وجه QNM، كما هو مبين من قبل التيار الأيوني بين الأقطاب الكهربائية تشبع مكبر للصوت.
إذا كان مكبر للصوت لا تشبع، unclog QNM عن طريق تطبيق الجهد البوب من زائد أو ناقص فولت واحد أو زيادة الضغط الشعري بنحو 300 ملليمتر من الزئبق. استخدم كلا التقنيتين إذا لزم الأمر. بمجرد أن يشبع مكبر الصوت، اسحب المنحل بالكهرباء من الخزان حتى تنخفض مستويات الحل تحت QNM، كما يشير إلى ذلك التيار العائد إلى الصفر.
لبدء عملية تشكيل ثنائي الطبقات الدهنية، رفع مستوى الحل المنحل بالكهرباء أعلى بكثير من وجه QNM وملاحظة حول كم حل استغرق. ثم تراجع تلميح ماصة 10 ميكرولتر في حل DPHyPC ورسم كل الدهون مرئية في الطرف. المس طرف الماصة على سطح محلول المنحل بالكهرباء، واسمح للدهون بالتدفق من الماصات عبر واجهة الهواء والماء.
انتظر دقيقتين إلى خمس دقائق للدهون لنشر موحد عبر الحل. بعد ذلك، قم بسحب المنحل بالكهرباء ببطء حتى يصبح سطح المحلول تحت QNM ثم أضف ببطء ما يكفي من المنحل بالكهرباء لرفع المحلول فوق QNM لتشكيل غشاء ثنائي الطبقات الدهنية العازل. إذا لم تتشكل الطبقة الثنائية بعد ثلاث محاولات، قم بتطبيق جزء آخر من الدهون كما هو موضح سابقًا وكرر العملية.
مرة واحدة يبدو أن bilayer قد تشكلت، وزيادة الضغط على شعري لموسيقى البوب bilayer ومن ثم إصلاحه عن طريق خفض ببطء ورفع مستوى الحل في نفس الطريقة كما كان من قبل. كرر هذه العملية عدة مرات لضمان عدم انسداد QNM وتشكيل ثنائية. بعد ذلك، ذوبان aliquot من بروتين الهيمlysin ألفا على الجليد أو في درجة حرارة الغرفة.
ملء الخزان مع 250 نانوغرام من البروتين الهيموليسين ألفا أحادية الميل ونحو 250 ميكرولتر من المياه فائقة الpure. ثم، تطبيق 200 إلى 400 ميلفولت التحيز للحث على تشكيل المسام. ولتيسير تكوين المسام، قم بزيادة ضغط الشعيرات الدموية بمقدار 40 إلى 200 مليمتر من الزئبق لتوسيع الطبقة الثنائية من QNM.
مرة واحدة في شكل نانوبور، والحد من التحيز المطبقة لقياس الجهد وتقليل الضغط إلى حوالي نصف ضغط الإدراج. لبدء الاختبار، قم بإعادة ضبط الجهد الجهد DC-offset لضمان عدم وجود تيار محسوب عند تعيين الإمكانات التطبيقية إلى الصفر. بعد ذلك، الحصول على أثر أيوني للتيار لإمكانية تطبيقية من 120 إلى 120 ميليفولت سالبة بالنسبة للخزان.
تأكد من عدم وجود ملوثات، والتي يمكن أن تشير إليها الحصارات الحالية العفوية. إضافة واحد إلى ستة ميكرولترات من 5.5 2-ملليمولار بوم حل الكتلة إلى الخزان. تطبيق القياسات الحالية للسلسلة الزمنية الأيونية في الجهد تطبيقية من 120 millivolts السلبية.
أنتجت حركة جزيئات حمض الفوسفوروفوتوغستيك الفردية من خلال قناة ألفا الهيمليسين حصارات عابرة انخفضت التيار الأيوني المفتوح المتوسط بنحو 80٪ ترتبط المدة والحصار الحالي بشكل مباشر بتفاعل الجسيمات المسام ، مما يسمح بتمييز الأنواع الأيونية في الرسوم البيانية لنسب عمق الحصار النسبي. وعند 5.5 من مستويات الـ PH، لوحظت ذرتان بنسب عمق تبلغ حوالي 0.06 و0.16. واستنادا إلى NMR الفوسفور، كانت الذروة الصغرى الأنواع الفوسفاتية ناقص ستة وكانت ذروة الرئيسية الأنواع ناقص سبعة.
وعند درجة الHH 7.5، تحولت التركيزات النسبية إلى نسبة أعلى من الأنواع 6-ناقص إلى الأنواع السبعة ناقص. ويعزى الانخفاض البالغ 20 ضعفاً في أحداث الحصار مقارنةً بـ 5.5 من الـ 5.5 إلى تدهور الفوسفات والأيونات التنغستية. ويتطلب تركيب التوزيعات الزمنية للإقامة وظائف أسية متعددة، مما يشير إلى أنواع متعددة من تفاعلات المسام الجسيمية داخل كل نوع من الأنواع الأيونية.
وقد أشارت أوقات الإقامة الأقصر عند الرقم الهيدروجيني 7.5 إلى تفاعلات أضعف للجسم المسامية من الرقم الهيدروجيني 5.5، بما يتفق مع الدراسات السابقة التي تظهر التغيرات المعتمدة على الرقم الهيدروجيني في العدد النسبي للتهم الثابتة في تجويف قناة ألفا إنمولليزين أو بالقرب منه. المياه ذات النقاء العالي deionized أمر بالغ الأهمية لهذا الإعداد خاصة. كانت خرطوشة تصفية المواد العضوية المستهلكة السبب المحتمل لعدم تمكن مختبرنا من تشكيل أغشية على QNMs لعدة أشهر.
الأفراد جديدة لهذا الإصدار خاصة من الأسلوب قد النضال أيضا لأن الأغشية صغيرة جدا وهناك خدعة للحصول على نانوثيم لتشكيل. وقد أثبتت هذه الطريقة، التي بدأت منذ عدة عقود، فائدتها في تحليل الأيونات والأحماض النووية والبوليمرات الاصطناعية، فضلا عن تسلسل الحمض النووي. ويمكن أيضا أن تجد تطبيقات في الفيزياء الحيوية وبيولوجيا الخلايا الأساسية.
على سبيل المثال، يمكن استخدام هذا الإجراء لدراسة الخصائص الفيزيائية للبوليمرات الاصطناعية والبوليمرات البيولوجية للتحقيق في حجمها، والتفاعلات مع جزيئات أخرى، وغيرها من الأسئلة الهامة.
