الهدف العام لهذه الطريقة هو إنشاء نظام تعبير موجه خاص بالأنسجة. في هذه الطريقة، أظهرنا جيل برنامج تشغيل النسخ الثنائي محددة لدينا Drosophila FGF homolog، branchless. دينامية، والتعبير الصدغي من دون فرع ينظم تكوين فرع من ظهارة مجرى الهواء القصبي.
على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في التعبير الزماني الزاقاري وهجرة الخلايا المنتجة غير الفرعية ، يمكن تطبيقها بسهولة على الجينات والأنسجة الأخرى في دروسوفيليا أو في كائنات نموذجية أخرى ، مثل C.Elegans و zebrafish. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يولد أنظمة التعبير التي هي موثوقة للغاية ، والأنسجة وجين محددة ، ونشطة حصرا في الخلايا حيث العناصر التنظيمية لرابطة الدول المستقلة من الجين استبدال وظيفية. أنظمة النسخ الثنائية هي أدوات أساسية للتعبير الجيني الموجه والتلاعب.
المنشط عبر، مثل GAL4 أو ليكسا، التي أعرب عنها تحت سيطرة العناصر التنظيمية رابطة الدول المستقلة من الجينات، محرك الجينات trans effector التي وضعت في المصب من مواقع محددة ملزمة النسخ، مثل UAS لGAL4 و / أو LexO لLexa. هذه المنهجية يستبدل إكسون الترميز الأول من الجين بلا فروع مع برنامج النسخ. تضع الطريقة القائمة على CRISPR Cas9 تسلسل يكسا عبر المنشط تحت التنظيم الداخلي للجينة غير المتفرعة ، وبالتالي ، تسهل التعبير عبر المنشط حصريًا في أنماط متزامنة متزامنة محددة بدون فروع.
ابدأ بتحديد موقعين مستهدفين لـ RNA موجهين يستهدفان بشكل خاص طرفي المنطقة المختارة التي تهمك. افتح أداة تصميم CRISPR التي تختارها. يتم استخدام Fly CRISPR الهدف الأمثل مكتشف هنا.
انقر على تحديد Genome'insert تسلسل الفائدة، وحدد أحدث تعليق توضيحي للجينوم Drosophila melanogaster تم تحميله، حاليا R سفلية ستة، في القائمة المنسدلة. بعد ذلك، انقر فوق تحديد طول الدليل'وإدخال 20. حدد كافة أهداف CRISPR'وانقر فوق البحث عن أهداف CRISPR.
تقييم جميع أهداف دليل المرشح RNA عن طريق وضع الحد الأقصى للصرامة وNGG only'for PAM. لتوليد دليل جنبا إلى جنب RNA التعبير ناقلات، PCR الأولى تضخيم جزء الحمض النووي لإدخال اثنين من تسلسلات بروتو في التعبير pCFD4 RNA ناقلات التعبير العمود الفقري. استخدام التمهيدي إلى الأمام وعكس، مع كل تسلسل بروتو مفر، وتداخل مع تسلسل ناقلات pCFD4 في PCR باستخدام البوليميراز عالية الدقة والحمض النووي قالب pCFD4.
لإعداد pCFD4 للاستنساخ، هضم البلازميد مع إنزيم BBS1. إعداد رد فعل في العازلة الهضم المناسبة التي تحتوي على اثنين إلى خمسة ميكروغرام من pCFD4 plasmid وميكر واحد من انزيم Bbs1 وحجم النهائي من 50 ميكرولترات. اخلط محتويات التفاعل عن طريق النقر على الأنبوب وجمع جميع القطرات المتناثرة من جدار الأنبوب إلى الأسفل عن طريق دوران قصير.
احتضان مزيج رد الفعل في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين بعد تشغيل المنتج PCR وهضم plasmid على هلام agarose واحد في المئة. تنقية 6.4 كيلو قاعدة زوج plasmid الخطية و 600 زوج قاعدة PCR الزوج المنتج باستخدام أعمدة تنقية هلام القياسية. إعداد تفاعل تجميع الحمض النووي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
بالنسبة لسلسلة من الـ GAL4 أو LexA، صمم متبرعًا مزدوجًا بتقنية HDR يحتوي على تسلسل المنشط عبر، ويحيط به ذراعان للتهكم. لتجنب إعادة استهداف RNA الدليل إلى موضع هندسي، تصميم الجهة المانحة البديلة بطريقة تعطل مواقع التعرف على RNA دليل من قبل تسلسل الخارجية المقدمة. أيضا، لتجنب تغيير نقاء رابطة الدول المستقلة العناصر التنظيمية، حدد دائما دليل مواقع الاعتراف RNA داخل المنطقة exon الترميز.
لإنشاء كاسيت بديل، قم بتخطيط استراتيجية تجميع الحمض النووي للانضمام إلى أربعة أجزاء معًا. الخمسة الرئيسي وثلاثة الرئيسية homology الأسلحة ، middle exogenous trans activator DNA تسلسل ، وخطي استنساخ ناقلات العمود الفقري. تضخيم PCR GAL4 أو كاسيت تعبير LexA من ناقل مناسب وPCR تضخيم الأسلحة homology من الحمض النووي الجينوم المستخرج من خط يطير الأصل المحدد للحقن.
استخدام البوليميراز عالية الدقة في كل PCR لتوليد شظايا الهدف. لإعداد تفاعل تجميع الحمض النووي ، وخلط ناقلات الاستنساخ الخطية والشظايا المستهدفة التي يولدها استنساخ PCR مع mastermix الجمعية الحمض النووي وحجم التفاعل النهائي إلى 20 ميكرولترات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. احتضان مزيج رد فعل لمدة ساعة واحدة في 50 درجة مئوية.
عندما الأجنة Nos-Cas9 حقن سابقا مع كل من دليل RNA التعبير plasmid والمتبرع استبدال, تتطور إلى البالغين, عبر G0 الذباب بشكل فردي لتحقيق التوازن بين الذباب الخاص بك من خط مناسب للأليل المستهدفة. تخدير ذرية F1 من كل عبر G0 على لوحة ثاني أكسيد الكربون. اختيار عشوائيا 10 إلى 20 الذكور تحت مجهر ستيريو.
عبر فردي كل ذكر مختارة لأنثى موازن من خط مناسب لأليل المستهدفة. عندما تفقس يرقات F2، اختر الأب F1 من كل صليب. استخراج الحمض النووي الجينوم عن طريق السحق كل ذبابة لمدة 10 إلى 15 ثانية مع طرف ماصة، تحتوي على 50 ميكرولترات من المخزن المؤقت السحق دون الاستغناء عن العازلة.
ثم، الاستغناء المخزن المؤقت المتبقي في الأنبوب وخلط جيدا. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بعد الحضانة، ضع الأنابيب في كتلة حرارة 95 درجة مئوية لمدة دقيقة إلى دقيقتين لتنشيط البروتينات K.After تدور لمدة خمس دقائق في 10،000 مرة G، وتخزين إعداد في أربع درجات مئوية لمزيد من تحليل PCR.
تنفيذ ثلاث خطوات PCR المستندة إلى الشاشات باستخدام التمهيديات إلى الأمام واحد وعكس واحد إلى الشاشة لوجود الإدراج أو الاستبدال. تنفيذ PCR باستخدام الأمام اثنين وعكس التمهيديين للتحقق من الإدراج أو الاستبدال من المنطقة الرئيسية الثلاثة. تنفيذ PCR باستخدام التمهيديات M13F وعكس ثلاثة للتحقق من ينتهي في'HDR.
حافظ على خطوط الطيران مع انتهاء-out'HDR المؤكدة وإنشاء مخزونات متوازنة من جيل F2. خارج عبر التوازن الذباب مرة أخرى لإزالة أي طفرات غير مقصودة على الكروموسومات الأخرى. يظهر التعبير غير المتفرع، أو bnl، هنا باللون الأحمر في قرص جناح اليرقات النجمية الثالث، مع الخلايا التعبيرية اللاهثة المستقبلة، الموضحة باللون الأخضر، في قرص الهواء المتنامي.
تظهر الخلايا التعبيرية غير المتفرعة هنا في فرع TR5 الضامة العرضية وفرع TR2 الظهرية. تظهر خلايا القصبة الهوائية اللاهثة هنا باللون الأخضر. تظهر الخلايا التعبيرية اللاهثة باللون الأخضر ، مما يضع علامة على القصبة الهوائية الجنينية النامية من المرحلة التاسعة إلى المرحلة 14 وتظهر الخلايا التعبيرية غير المتفرعة باللون الأحمر.
تُظهر هذه الصورة التعبير غير المتفرع المستحث في مواقع الأنسجة المنتبذة في ظل ظروف نقص الأكسجين، نسبة إلى التحكم. وقد صممت هذه الطريقة للاحتفاظ بجميع اللوائح الأصلية اصمة الزمانية من النسخ الجينية غير المتفرعة. ولذلك، كان من المهم استبدال فقط إكسون الترميز الأول للجين مع تسلسل الترميز يكسا عبر المنشط.
بعد تطورها ، مهدت هذه الأدوات الوراثية الجديدة الطريق لاستكشاف أنماط التعبير الأنسجة الجديدة للجينة غير المتفرعة. كما مكّن ذلك من سوء التعبير عن الجينات وأسقطه حصرياً في الخلايا التعبيرية غير المتفرعة وساعد في رصد الهجرة الخطية والإشارة إلى تفاعلات الخلايا.
