L'obiettivo generale di questo metodo è generare un sistema di espressione mirato altamente specifico per i tessuti. In questo metodo, abbiamo dimostrato la generazione di un driver trascrizionale binario specifico per il nostro omologo Drosophila FGF, branchless. L'espressione dinamica e spaziotemporale di branchless regola l'emogenesi di ramo dell'epitelio tracheale delle vie aeree.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'espressione spaziotemporale e sulla migrazione delle cellule produttrici senza rami, può essere facilmente applicato ad altri geni e tessuti in Drosophila o in altri organismi modello, come C.Elegans e zebrafish. Il principale vantaggio di questa tecnica è che genera sistemi di espressione altamente affidabili, specifici dei tessuti e dei geni, e attivi esclusivamente in cellule in cui gli elementi regolatori cis del gene sostituito sono funzionali. I sistemi di trascrizione binaria sono strumenti essenziali per l'espressione e la manipolazione genica mirata.
Un attivatore trans, come GAL4 o LexA, espresso sotto il controllo di elementi regolatori cis di un gene, guida un gene trans effettore che viene posizionato a valle di specifici siti di legame trascrizione, come UAS per GAL4 e / o LexO per LexA. Questa metodologia sostituisce il primo esone codificante del gene branchless con il driver di trascrizione. Il metodo basato su CRISPR Cas9 pone una sequenza di attivatori trans LexA sotto la regolazione endogena del gene branchless e, di conseguenza, facilita l'espressione transattivatore esclusivamente in specifici schemi spaziotemporali specifici senza rami.
Inizia selezionando due siti di destinazione dell'RNA guida che si rivolgono specificamente a due estremità dell'area di interesse selezionata. Aprire lo strumento di progettazione CRISPR preferito. Fly CRISPR Optimal Target Finder viene utilizzato qui.
Clicca su Select Genome'inserisci la sequenza di interesse e seleziona l'annotazione del genoma drosophila melanogaster caricata più recente, attualmente R sottolineatura sei, nel menu a discesa. Fare quindi clic su Seleziona lunghezza guida' e immettere 20. Selezionate Tutte le destinazioni CRISPR', quindi fate clic su Trova destinazioni CRISPR (Find CRISPR targets).
Valutare tutte le destinazioni dell'RNA guida candidata impostando il massimo per il rigore e NGG solo'per PAM. Per generare un vettore di espressione dell'RNA guida tandem, il primo PCR amplifica un frammento di DNA per introdurre due sequenze proto distanziali in una dorsale vettoriale di espressione dell'RNA pCFD4. Usa un primer avanti e indietro, ognuno con una sequenza proto distanziale, e si sovrappone alla sequenza vettoriale pCFD4 in un PCR usando la polimerasi ad alta fedeltà e il DNA del modello pCFD4.
Per preparare pCFD4 per la clonazione, digerire il plasmide con l'enzima Bbs1. Impostare una reazione nell'apposito tampone di digestione contenente da due a cinque microgrammi di pCFD4 plasmide e un microlitro di enzima Bbs1 e un volume finale di 50 microlitri. Mescolare il contenuto di reazione toccando il tubo e raccogliendo tutte le goccioline sparse dalla parete del tubo verso il basso con un breve giro.
Incubare la miscela di reazione a 37 gradi Celsius per due ore dopo aver eseguono il prodotto PCR e digerito il plasmide su un gel di agarosio dell'uno per cento. Purificare il plasmide lineare a coppia da 6,4 kilobase e il prodotto PCR a 600 coppie di basi utilizzando colonne standard di purificazione del gel. Impostare la reazione di assemblaggio del DNA secondo il protocollo del produttore.
Per il knock-in genomico di una sequenza GAL4 o LexA, progetta un donatore HDR a doppio filamento contenente la sequenza di attivatori trans, affiancato da due bracci di omologia. Per evitare di ri-indirizzare l'RNA guida al locus ingegnerizzata, progettare il donatore sostitutivo in modo tale che i siti di riconoscimento dell'RNA guida siano interrotti dalla sequenza esogena introdotta. Inoltre, per evitare di alterare la purezza degli elementi normativi cis, selezionare sempre i siti di riconoscimento dell'RNA guida all'interno della regione di codifica esonero.
Per generare una cassetta sostitutiva, pianifica la strategia di assemblaggio del DNA per unire quattro segmenti. I cinque bracci di omologia primaria e tre primi, la sequenza media del DNA del transattivatore esogeno e la spina dorsale lineare del vettore di clonazione. Pcr amplifica una cassetta di espressione GAL4 o LexA da un vettore appropriato e PCR amplifica i bracci di omologia dal DNA genomico estratto dalla linea di volo madre selezionata per l'iniezione.
Utilizzare la polimerasi ad alta fedeltà in ogni PCR per generare i frammenti di destinazione. Per impostare la reazione di assemblaggio del DNA, mescolare il vettore di clonazione linearizzato e i frammenti bersaglio generati dalla clonazione PCR con il mastermix di assemblaggio del DNA e un volume di reazione finale a 20 microlitri secondo le istruzioni del produttore. Incubare il mix di reazione per un'ora a 50 gradi Celsius.
Quando gli embrioni Nos-Cas9 precedentemente iniettati con il plasmide di espressione dell'RNA guida e il donatore sostitutivo, si sviluppano in adulti, attraversano le mosche G0 individualmente per bilanciare le mosche da una linea appropriata per l'allele mirato. Anestetizza la prole F1 da ogni croce G0 su un cuscinetto di anidride carbonica. Scegli casualmente da 10 a 20 maschi al microscopio stereo.
Attraversare individualmente ogni maschio selezionato in una femmina di bilanciatore da una linea appropriata per l'allele mirato. Quando le larve di F2 si schiudono, scegli il padre F1 da ogni croce. Estrarre il DNA genomico schiacciando ogni mosca per 10-15 secondi con una punta di pipetta, contenente 50 microlitri di tampone di schiacciamento senza erogare il tampone.
Quindi, erogare il tampone rimanente nel tubo e mescolare bene. Incubare a 37 gradi Celsius per 20-30 minuti. Dopo l'incubazione, posizionare i tubi in blocco termico di 95 gradi Celsius per uno o due minuti per inattivare la proteinasi K.Dopo aver filato per cinque minuti a 10.000 volte G, conservare la preparazione a quattro gradi Celsius per ulteriori analisi PCR.
Eseguire schermate basate su PCR in tre step utilizzando primer in avanti uno e invertire uno sullo schermo per l'esistenza dell'inserimento o della sostituzione. Eseguire PCR utilizzando in avanti due e invertire due primer per verificare l'inserimento o la sostituzione dalla regione primaria a tre. Eseguire PCR utilizzando primer M13F e invertire tre per controllare ends-in'HDR.
Mantieni le linee di volo con il end-out confermato'HDR e stabilisci scorte bilanciate della generazione F2. Superato di nuovo il bilanciatore per rimuovere eventuali mutazioni indesiderate su altri cromosomi. L'espressione branchless, o bnl, è mostrata qui in rosso nel terzo disco alare delle larve instar, con il recettore che esprime le cellule senza fiato, mostrato in verde, nel primordium dell'aria in crescita.
Le cellule che esprimono branchless sono mostrate qui nel ramo connettivo trasversale TR5 e nel ramo dorsale TR2. Le cellule tracheali che esprimono senza fiato sono mostrate qui in verde. Le cellule esprimenti senza fiato sono mostrate in verde, segnando la trachea embrionale in via di sviluppo dallo stadio nove allo stadio 14 e le cellule esprimenti senza rami sono mostrate in rosso.
Questa immagine mostra l'espressione branchless indotta in posizioni di tessuto ectopico in condizioni ipossiche, rispetto al controllo. Questo metodo è stato progettato per mantenere tutte le normative spaziotemporali originali della trascrizione genica senza rami. Pertanto, era importante sostituire solo il primo esone codificante del gene con la sequenza di codifica transattivatore LexA.
Dopo il suo sviluppo, questo nuovo toolset genetico ha aperto la strada all'esplorazione di nuovi modelli di espressione tissutale del gene branchless. Ha anche permesso l'espressione errata del gene e abbattuto esclusivamente in cellule che esprimono branchless e ha contribuito a monitorare la migrazione lineare e le interazioni di segnalazione delle cellule.
