L’objectif global de cette méthode est de générer un système d’expression ciblée hautement spécifique aux tissus. Dans cette méthode, nous avons démontré la génération d’un pilote transcriptionnel binaire spécifique à notre homolog Drosophila FGF, sans branche. L’expression dynamique et spatiotemporal de branchless régule l’hémogenèse de branche de l’épithélium trachéal de voie aérienne.
Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’expression spatiotemporale et de la migration des cellules productrices sans branches, elle peut être facilement appliquée à d’autres gènes et tissus dans Drosophila ou dans d’autres organismes modèles, tels que C.Elegans et zebrafish. Le principal avantage de cette technique est qu’elle génère des systèmes d’expression hautement fiables, spécifiques aux tissus et aux gènes, et actifs exclusivement dans les cellules où les éléments réglementaires cis du gène remplacé sont fonctionnels. Les systèmes de transcription binaire sont des outils essentiels pour l’expression et la manipulation ciblées des gènes.
Un activateur trans, tel que GAL4 ou LexA, exprimé sous le contrôle d’éléments réglementaires cis d’un gène, conduisent un gène trans effecteur placé en aval de sites spécifiques de liaison de transcription, comme le SAMU pour GAL4 et/ou le LexO pour LexA. Cette méthodologie remplace le premier exon codant du gène sans branche par le pilote de transcription. La méthode CRISPR Cas9 place une séquence d’activateur trans LexA sous la régulation endogène du gène sans branches et, par conséquent, facilite l’expression de l’activateur trans exclusivement dans des modèles spatiotemporaux spécifiques sans branches.
Commencez par sélectionner deux sites cibles d’ARN guide qui ciblent spécifiquement deux extrémités de la région d’intérêt sélectionnée. Ouvrez l’outil de conception CRISPR de choix. Fly CRISPR Optimal Target Finder est utilisé ici.
Cliquez sur Select Genome’insert la séquence d’intérêt, et sélectionnez la plus récente annotation du génome de Drosophila melanogaster téléchargée, actuellement R souligner six, dans le menu drop-down. Ensuite, cliquez sur Sélectionnez la longueur du guide et entrez 20. Sélectionnez toutes les cibles CRISPR et cliquez sur Trouver des cibles CRISPR.
Évaluez tous les objectifs d’ARN de guide de candidat en fixant le maximum pour la rigueur et NGG seulement’for PAM. Pour générer un vecteur d’expression d’ARN de guide tandem, d’abord PCR amplifier un fragment d’ADN pour introduire deux séquences d’espaceur proto dans une colonne vertébrale de vecteur d’expression d’ARN pCFD4. Utilisez une amorce avant et arrière, chacune avec une séquence d’espacement proto, et chevauchez la séquence vectorielle pCFD4 dans un PCR à l’aide de polymése haute fidélité et de l’ADN modèle pCFD4.
Pour préparer le pCFD4 au clonage, digérer le plasmide avec l’enzyme Bbs1. Mettre en place une réaction dans le tampon de digestion approprié contenant deux à cinq microgrammes de plasmide pCFD4 et un microlitre de l’enzyme Bbs1 et un volume final de 50 microlitres. Mélanger le contenu de la réaction en gentling tapant sur le tube et la collecte de toutes les gouttelettes dispersées de la paroi du tube vers le bas par un bref spin.
Incuber le mélange de réaction à 37 degrés Celsius pendant deux heures après l’exécution du produit PCR et digéré le plasmide sur un gel d’agarose d’un pour cent. Purifiez le plasmide linéaire de paire de 6,4 kilobases et le produit PCR de 600 paires de base à l’aide de colonnes de purification de gel standard. Configurer la réaction d’assemblage d’ADN selon le protocole du fabricant.
Pour le knock-in génomique d’une séquence GAL4 ou LexA, concevoir un donneur HDR à double brin contenant la séquence d’activateur trans, flanqué de deux bras homologiques. Pour éviter de re-cibler l’ARN guide vers le locus conçu, concevez le donneur de remplacement de manière à ce que les sites de reconnaissance de l’ARN guide soient perturbés par la séquence exogène introduite. En outre, pour éviter de modifier la pureté des éléments réglementaires cis, sélectionnez toujours les sites de reconnaissance de l’ARN guide dans la région d’exon codage.
Pour générer une cassette de remplacement, planifiez la stratégie d’assemblage de l’ADN pour unir quatre segments. Les cinq bras d’homologie principaux et trois premiers, la séquence exogène moyenne d’ADN d’activateur trans, et l’épine dorsale linéaire de vecteur de clonage. PCR amplifier un GAL4 ou une cassette d’expression LexA à partir d’un vecteur approprié et PCR amplifier les bras homologie de l’ADN génomique extrait de la ligne de mouche parent sélectionné pour injection.
Utilisez la polymése haute fidélité dans chaque PCR pour générer les fragments cibles. Pour configurer la réaction d’assemblage de l’ADN, mélangez le vecteur de clonage linéarisé et les fragments cibles générés par le clonage PCR avec le mastermix d’assemblage d’ADN et un volume de réaction final à 20 microlitres selon les instructions du fabricant. Incuber le mélange de réaction pendant une heure à 50 degrés Celsius.
Lorsque nos-Cas9 embryons précédemment injectés à la fois avec le plasmide d’expression arn guide et le donneur de remplacement, se développer en adultes, traverser G0 mouches individuellement pour équilibrer vos mouches à partir d’une ligne appropriée pour l’allèle ciblé. Anesthésier la progéniture F1 de chaque croix G0 sur un tampon de dioxyde de carbone. Choisissez au hasard 10 à 20 mâles au microscope stéréo.
Croisez individuellement chaque mâle sélectionné à une femelle tétraire à partir d’une ligne appropriée à l’allèle ciblé. Lorsque les larves de F2 éclosent, choisissez le père F1 de chaque croix. Extraire l’ADN génomique en squishing chaque mouche pendant 10 à 15 secondes avec une pointe pipette, contenant 50 microlitres de tampon squishing sans distribuer le tampon.
Ensuite, distribuez le tampon restant dans le tube et mélangez bien. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes. Après l’incubation, placez les tubes dans un bloc thermique de 95 degrés Celsius pendant une à deux minutes pour inactiver la proteinase K.Après avoir tourné vers le bas pendant cinq minutes à 10 000 fois G, conservez la préparation à quatre degrés Celsius pour une analyse pcr plus poussée.
Effectuez des écrans PCR en trois étapes à l’aide d’amorces en avant une et inversion d’un écran pour l’existence de l’insertion ou le remplacement. Effectuez le PCR à l’aide de deux amorces avant et arrière pour vérifier l’insertion ou le remplacement des trois principales régions. Effectuez pcr à l’aide d’amorces M13F et inverser trois pour vérifier les extrémités-in’HDR.
Gardez les lignes de vol avec le ends-out’HDR confirmé et établissez des stocks équilibrés de la génération F2. Out-cross l' équilibreur vole à nouveau pour enlever toutes les mutations involontaires sur d’autres chromosomes. L’expression branchless, ou bnl, est montrée ici en rouge dans le troisième disque d’aile de larves de instar, avec le récepteur à bout de souffle exprimant des cellules, montrées en vert, dans le primordium croissant de sac d’air.
Des cellules d’expression sans branche sont montrées ici dans la branche conjonctive transversale tr5 et la branche dorsale TR2. Les cellules trachéales exprimant à bout de souffle sont montrées ici en vert. Les cellules exprimant à bout de souffle sont montrées en vert, marquant la trachée embryonnaire se développante du stade neuf au stade 14 et les cellules d’expression branchless sont montrées en rouge.
Cette image montre l’expression branchless induite dans les emplacements ectopiques de tissu dans des conditions hypoxiques, par rapport au contrôle. Cette méthode a été conçue pour conserver toutes les réglementations spatiotemporal originales de la transcription de gène branchless. Par conséquent, il était important de remplacer seulement le premier exon codant du gène par la séquence de codage de l’activateur trans LexA.
Après son développement, ce nouvel ensemble d’outils génétiques a ouvert la voie à l’exploration de nouveaux modèles d’expression tissulaire du gène sans branches. Il a également permis une mauvaise expression génétique et a frappé exclusivement dans les cellules d’expression sans branches et a aidé à surveiller la migration linéaire et les interactions de signalisation des cellules.
