MUB40 هو علامة العدلات رواية، والتي ترتبط لاكتوفيرين ويسمح للكشف محددة في عينة الأنسجة البشرية والثدييات جميع اختبارها حتى الآن. إن وصف العدلات مع MUB40 سهل وسريع ومحدد. انها تستخدم الآن على نطاق واسع في مختبرنا والآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد نحو تشخيص الأمراض الالتهابية.
للبدء، إعداد الحلول واحد، اثنين، وثلاثة وفقا لبروتوكول النص، ووضعها في مجلس الوزراء anoxic بين عشية وضحاها. ثم، الطرد المركزي أنابيب الدم المجمعة في 650 غرام لمدة 20 دقيقة لفصل الخلايا من كسر البلازما. دون إزعاج الدم المنفصل ، قم بنقل الأنابيب إلى الخزانة الأنوكسية ونقل كسور البلازما إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
بعد هذا إزالة أنبوب البلازما من مجلس الوزراء anoxic والطرد المركزي في 2900 غرام لمدة 20 دقيقة. مع الحرص على عدم تعطيل الصفائح الدموية بيليه، ونقل أنبوب إلى مجلس الوزراء anoxic والماصات البلازما الصفيحات الفقيرة في أنبوب 50 ملليلتر الطازجة. باستخدام أنابيب جمع الدم، والجمع بين خلايا الدم الحمراء في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
ثم، إضافة 0.9٪ محلول كلوريد الصوديوم حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 44 ملليلتر، وإضافة ستة ملليلترات من 6٪ dextran. عكس أنبوب 10 إلى 20 مرات لخلط بلطف الدم وخليط ديكستران، والسماح للأنبوب إلى الرواسب لمدة 30 دقيقة على الأقل. في حين أن الرواسب أنبوب، وإعداد التدرج Percoll بإضافة 4.2 ملليلتر من حل Percoll إلى 5.8 ملليلتر من البلازما، وعكس أنبوب لخلط.
المقبل, جمع العدلات التي تحتوي على الجزء العلوي من ديكستران, مع الحرص على عدم ماصة خلايا الدم الحمراء. تشديد غطاء المسمار, إزالة أنبوب ديكستران من مجلس الوزراء anoxic, والطرد المركزي أنبوب في 300 غرام لمدة 10 دقائق. الحرص على عدم إزعاج الخلايا بيليه، وضع أنبوب مرة أخرى في مجلس الوزراء anoxic.
ثم، وإزالة السائل عن طريق الأنابيب. إعادة تعليق بلطف بيليه في ملليلتر واحد من البلازما. إضافة ببطء الخلايا التي تم إعادة تعليقها إلى قمم حل Percoll.
قم بإزالة أنبوب حل Percoll بعناية من الخزانة الأنوكسية والطرد المركزي في 800 غرام لمدة 20 دقيقة لفصل PBMCs عن العدلات. المقبل، وإعداد 14 ملليلتر من محلول الغسيل العازلة وفقا لبروتوكول النص. ثم، ضع أنبوب Percoll في خزانة أنوكسي.
استخدام ماصة لإزالة Percoll و PBMCs وإعادة العدلات التي تحتوي على بيليه في ملليلتر واحد من محلول الغسيل العازلة. بعد ذلك، إضافة 200 ميكرولترات من الخرز المغناطيسي إلى الخلايا resuspended. خلط بلطف واحتضان الخلايا والخرز لمدة 15 دقيقة على الأقل.
بعد هذا، وغسل عمود فصل مرتين، مع اثنين من ملليلتر من العازلة الغسيل. في حين عقد جديد, 15 ملليلتر أنبوب مخروطي تحت العمود, ماصة ببطء خليط خلايا الدم الحمراء العدلات من خلال العمود. يجب أن يكون التدفق من العمود غائمًا ويفقد لونه الأحمر ، مما يؤكد الفصل الكامل للعدلات عن خلايا الدم الحمراء المتبقية.
إضافة ملليلترين من الغسيل العازلة إلى أعلى العمود وجمع تدفق من خلال في نفس الأنبوب. بحلول نهاية هذا الغسل، ينبغي أن يكون التدفق من خلال واضحة. خلط بلطف أنبوب جمع لضمان توزيع العدلات بالتساوي.
ثم جمع 10 ميكرولترات من تدفق من خلال من عد الخلايا. بعد ذلك، قم بإزالة أنبوب العدلات من الخزانة الأنوكسية والطرد المركزي الأنبوب في 300 غرام لمدة 20 دقيقة. وضع العدلات الرسوبية مرة أخرى في مجلس الوزراء anoxic وإزالة العازلة الغسيل عن طريق الأنابيب.
ثم، resuspend بيليه في البلازما. إضافة ميكرولتر واحد من RI-MUB40-Cy5 إلى ملليلتر واحد من 1640- 1640 دورة في الدقيقة المتوسطة، دون الحمراء الفينول، ومزيج عن طريق الأنابيب. ثم، إضافة ميكرولتر واحد من حل FMLP وماصة لخلط.
نقل الخليط إلى طبق المجهر الزجاجي السفلي. ثم إضافة حجم مناسب من الخلايا النقية إلى الطبق. وأخيراً، ضع الطبق في مجهر فلوري مقلوب وابدأ في الحصول على الصورة.
في هذا البروتوكول، تم استخدام MUB40 على الخلايا الحية للكشف عن إفراز العدلات عند المحاكاة مع FMLP. يمكن تصور ديناميات إطلاق محتوى الحبيبات ، بما في ذلك اللاكتوفيرين ، مع مرور الوقت ، هنا باللون الأرجواني. قد تستخدم أيضا MUB40 على العدلات الثابتة.
هنا، بالتبميم الخرز الفلورسنت في سلسلة موقوتة. محتوى حبيبات العدلات هو المسمى هنا باللون الأزرق. وأظهرت العدلات القليل إلى لا تلطيخ الخلية في وقت مبكر نقاط، وبالتدريج، RI-MUB40 وضع العلامات زيادة مع مرور الوقت، سواء على غشاء البلازما وسطح الخرز.
يمكن أيضاً استخدام MUB40 على الأنسجة الالتهابية الثابتة للكشف عن العدلات على وجه التحديد، كما هو موضح في أرقام النص. نحن نصف هنا إجراء تنقية العدلات، المطبق بشكل روتيني في مختبرنا. أي طريقة أخرى مناسبة، سوف MUB40-Cy5 وضع العلامات لا تزال تعمل.
قد تكون مسمَّاة على وجه التحديد مع MUB40 بعد تنقية، أو مباشرة في الأنسجة الملتهبة من المرضى أو نماذج الحيوانات. وقد تم تصميم العديد من المشتقات MUB40 لتوسيع استخدامها. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحث في مجال الالتهاب ، لاستكشاف تجنيد العدلات وتفعيلها في الأمراض الالتهابية.
