MUB40은 유당페린에 결합하고 지금까지 테스트된 인간 및 모든 포유류 조직 샘플에서 특정 검출을 허용하는 새로운 호중구 마커입니다. MUB40을 가진 호중구를 라벨링은 쉽고 빠르며 구체적입니다. 그것은 지금 우리의 실험실에서 널리 사용 하 고이 기술의 의미는 염증 성 질병의 진단으로 확장.
먼저 텍스트 프로토콜에 따라 1, 2, 3개의 솔루션을 준비하고 밤새 해부학 캐비닛에 배치합니다. 그런 다음, 혈장 분획에서 세포를 분리하기 위해 20 분 동안 650g에서 수집 된 혈액의 튜브를 원심 분리합니다. 분리된 혈액을 방해하지 않고 튜브를 무산소 캐비닛으로 옮기고 혈장 분획을 50 밀리리터 원내 튜브로 옮길 수 있습니다.
이 후 무산소 캐비닛에서 플라즈마의 튜브를 제거하고 원심 분리기2900 g에서 20 분 동안. 펠렛 혈소판을 방해하지 않도록주의하고, 관을 무산소 캐비닛으로 옮기고 혈소판이 가난한 혈장을 신선한 50 밀리리터 튜브로 피펫합니다. 혈액 수집 관을 사용하여 적혈구를 원추형 50 밀리리터 튜브에 결합합니다.
그런 다음 총 부피가 44 밀리리터에 도달할 때까지 0.9%의 염화 나트륨 용액을 추가하고 6밀리리터를 6%dextran으로 추가합니다. 튜브를 10~20회 반전하여 혈액과 덱스네 혼합물을 부드럽게 섞고 튜브가 적어도 30분 동안 퇴적물을 허용합니다. 튜브 퇴적물 동안, 4.2 밀리리터의 퍼콜 용액을 5.8 밀리리터의 플라즈마에 추가하여 퍼콜 그라데이션을 준비하고 튜브를 혼합하는 것을 반전시다.
다음으로, 적혈구를 피펫하지 않도록 주의하여, dextran의 최고 분획을 포함하는 호중구를 수집합니다. 나사 캡을 조이고, 무산소 캐비닛에서 덱스네 튜브를 제거하고, 튜브를 300g에서 10분간 원심분리합니다. 펠릿 세포를 방해하지 않도록주의하고, 관은 무산소 캐비닛에 다시 놓습니다.
그런 다음 파이펫팅으로 액체를 제거합니다. 플라즈마 의 1 밀리리터에 펠릿을 부드럽게 다시 중단합니다. 다시 일시 중단된 셀을 Percoll 용액의 상단에 천천히 추가합니다.
중성구에서 PBMC를 분리하기 위해 20 분 동안 800g에서 Percoll 용액 튜브를 조심스럽게 제거하고 원심 분리하십시오. 다음으로 텍스트 프로토콜에 따라 14 밀리리터의 세척 버퍼 솔루션을 준비합니다. 그런 다음 퍼콜 튜브를 해부학 캐비닛에 놓습니다.
파이펫을 사용하여 Percoll 및 PBMC를 제거하고 세척 완충액의 1 밀리리터에 펠릿이 함유 된 호중구를 다시 일시 중단하십시오. 다음으로, 재중단된 세포에 자기 구슬 200 마이크로리터를 추가합니다. 셀과 구슬을 15분 이상 부드럽게 혼합하고 배양합니다.
그 후, 분리 열을 두 번 씻고, 두 밀리리터의 세척 버퍼를 세척합니다. 기둥 아래 15밀리리터 원뉴얼 튜브를 새로 들고 있는 동안, 열을 통해 호중구 적혈구 혼합물을 천천히 피펫한다. 열에서 의 흐름은 흐리고 붉은 색을 잃어야하며, 남아있는 적혈구에서 호중구의 총 분리를 확인합니다.
두 밀리리터의 세척 버퍼를 컬럼 상단에 추가하고 동일한 튜브에서 흐름을 수집합니다. 이 세척이 끝날 때까지 흐름통과가 명확해야합니다. 수집 튜브를 부드럽게 혼합하여 호중구가 고르게 분포되도록 합니다.
그런 다음 셀 계수로부터 유량의 10 마이크로리터를 수집했다. 그 후, 무산소 캐비닛에서 호중구 튜브를 제거하고 20 분 동안 300g에서 튜브를 원심 분리하십시오. 퇴적한 호중구를 무산소 캐비닛에 다시 넣고 파이펫팅을 통해 세척 버퍼를 제거합니다.
그런 다음 플라즈마에서 펠릿을 다시 중단합니다. PHENol 레드 없이 RPMI-1640 배지의 1밀리리터에 RI-MUB40-Cy5의 마이크로리터 1개를 추가하고 파이펫팅을 통해 혼합합니다. 그런 다음 FMLP 솔루션과 파이펫의 마이크로리터 를 추가하여 혼합합니다.
혼합물을 유리 바닥 현미경 접시에 옮김합니다. 그런 다음 접시에 정제 된 세포의 적절한 볼륨을 추가합니다. 마지막으로, 접시를 반전형 형광 현미경으로 놓고 이미지 수집을 시작합니다.
이 프로토콜에서, MUB40은 FMLP를 이용한 시뮬레이션 시 호중구 분비를 검출하기 위해 살아있는 세포에 사용되었다. 락토페린을 포함한 과립 함량의 방출의 역학은 시간이 지남에 따라, 여기에 마젠타에서 시각화될 수 있다. MUB40은 고정 호중구에 추가로 사용될 수 있다.
여기, 시간 조정 된 시리즈에서 phagocytizing 형광 구슬. 호중구 과립의 내용은 여기에 파란색으로 표시됩니다. 호중구는 초기 시점에서 세포 염색이 거의 또는 전혀 없는 것으로 나타났으며, 점차적으로, RI-MUB40 라벨링은 혈장 막과 비드 표면 모두에서 시간이 지남에 따라 증가하였다.
MUB40은 또한 텍스트 수치에 도시된 바와 같이 호중구를 구체적으로 검출하기 위해 고정 염증 조직에 사용될 수 있다. 우리는 여기에 호중구 정화 절차를 설명, 우리의 실험실에서 일상적으로 적용. 다른 모든 방법이 적합, MUB40-Cy5 라벨은 여전히 작동합니다.
호중구는 정제 후 MUB40으로 구체적으로 표지될 수 있으며, 또는 환자 또는 동물 모델에서 염증이 있는 조직에 직접 부착될 수 있다. 여러 MUB40 유도체는 사용을 확대하도록 설계되었습니다. 개발 후, 이 기술은 염증 분야의 연구원이 염증 성 질환의 호중구 모집 및 활성화를 탐구할 수있는 길을 열었습니다.
