MUB40 является новым маркером нейтрофила, который связывается с лактоферрином и позволяет конкретное обнаружение в человеке и всех млекопитающих образца ткани испытания до сих пор. Маркировка нейтрофилов с помощью MUB40 проста, быстра и специфична. В настоящее время широко используется в нашей лаборатории и последствия этого метода распространяется на диагностику воспалительных заболеваний.
Для начала подготовьте решения один, два и три в соответствии с текстовым протоколом, и поместите их в аноксический кабинет на ночь. Затем центрифугировать трубки собранной крови на 650 г в течение 20 минут, чтобы отделить клетки от плазменной фракции. Не нарушая разделенную кровь, перенесите трубки в аноксический шкаф и перенесите плазменные фракции в 50 миллилитровую коническую трубку.
После этого удалить трубку плазмы из аноксического шкафа и центрифуги его на 2900 г в течение 20 минут. Заботясь, чтобы не нарушить гранулы тромбоцитов, передать трубку в аноксический шкаф и пипетки тромбоцитов бедных плазмы в свежей 50 миллилитровой трубки. Используя трубки сбора крови, объединить красные кровяные тельца в конической 50 миллилитров трубки.
Затем добавьте раствор хлорида натрия 0,9% до тех пор, пока общий объем не достигнет 44 миллилитров, и добавьте шесть миллилитров 6%декстрана. Переверните трубку 10-20 раз, чтобы аккуратно смешать кровь и декстранную смесь, и дайте трубке от осадка, по крайней мере 30 минут. В то время как трубчатые отложения, подготовить градиент Percoll, добавив 4,2 миллилитров раствора Percoll до 5,8 миллилитров плазмы, и инвертировать трубку, чтобы смешать.
Затем соберите нейтрофил, содержащий верхнюю часть декстрана, заботясь о том, чтобы не пипетки красных кровяных телец. Затяните крышку винта, удалите декстрановую трубку из аноксического шкафа и центрифугировать трубку при 300 г в течение 10 минут. Заботьтесь о том, чтобы не нарушить гранулы клеток, поместите трубку обратно в аноксический шкаф.
Затем удалите жидкость путем трубопроводов. Аккуратно повторно посовещение гранул в один миллилитр плазмы. Медленно добавьте повторно натучные ячейки к вершинам раствора Percoll.
Аккуратно удалите трубку раствора Percoll из аноксического шкафа и центрифуга его при 800 г в течение 20 минут, чтобы отделить ПЦМ от нейтрофилов. Далее подготовьте 14 миллилитров раствора буфера для мытья в соответствии с текстовым протоколом. Затем поместите трубку Percoll в аноксический шкаф.
Используйте пипетку, чтобы удалить Percoll и PBMCs и повторно использовать нейтрофил, содержащий гранулы в один миллилитр стирального буферного раствора. Затем добавьте 200 микролитров магнитных бусин к рсуспенным клеткам. Аккуратно перемешайте и инкубировать клетки и бусы, по крайней мере 15 минут.
После этого дважды помойте разделительную колонку двумя миллилитров стирального буфера. Держа под колонной новую, 15-миллилитровую коническую трубку, медленно протыкает нейтрофиловую смесь красных кровяных телец через колонну. Поток из колонны должен быть облачным и терять красный цвет, подтверждая полное отделение нейтрофилов от оставшихся красных кровяных телец.
Добавьте два миллилитров стирального буфера в верхнюю часть колонны и соберите поток через ту же трубку. К концу этой стирки, протекаемый должен быть ясным. Аккуратно смешайте трубку сбора, чтобы обеспечить равномерное распределение нейтрофилов.
Затем собрано 10 микролитров протека от подсчета клеток. После этого снимите нейтрофиловую трубку с аноксического шкафа и центрифугировать трубку при 300 г в течение 20 минут. Поместите отложенные нейтрофилов обратно в аноксический шкаф и удалите буфер для мытья через трубу.
Затем, повторное приостановление гранулы в плазме. Добавьте один микролитр RI-MUB40-Cy5 в один миллилитр среды RPMI-1640, без фенола красного цвета, и смешайте с помощью пипетки. Затем добавьте один микролитер раствора FMLP и пипетки для смешивания.
Перенесите смесь на стеклянную нижнюю микроскопию. Затем добавьте в блюдо соответствующий объем очищенных клеток. Наконец, поместите блюдо в перевернутый флуоресцентный микроскоп и начните приобретение изображений.
В этом протоколе, MUB40 был использован на живых клетках для обнаружения нейтрофиловой секреции при моделировании с FMLP. Динамика высвобождения содержания гранул, в том числе лактоферрина, может быть визуализирована с течением времени, здесь, в пурпурном. MUB40 может быть дополнительно использован на фиксированных нейтрофилов.
Здесь фагоцитизирующие флуоресцентные бусы в серии сутками. Содержимое гранул нейтрофила помечено здесь синим цветом. Нейтрофилов показали практически нет окрашивания клеток в ранние моменты времени и постепенно, RI-MUB40 маркировки увеличилось с течением времени, как на плазменной мембране и поверхности бисера.
MUB40 также может быть использован на фиксированных воспалительных тканей для обнаружения нейтрофилов конкретно, как показано на тексте цифры. Мы описываем здесь процедуру очистки нейтрофила, регулярно применяемую в нашей лаборатории. Любой другой метод подходит, MUB40-Cy5 маркировки будет по-прежнему работать.
Нейтрофил может быть специально помечены с MUB40 после очистки, или непосредственно в воспаленной ткани от пациентов или животных моделей. Несколько производных MUB40 были разработаны, чтобы расширить его использование. После своего развития, этот метод проложил путь для исследователя в области воспаления, для изучения нейтрофилового набора и активации при воспалительных заболеваниях.
