يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تخليق الببتيد مثل توليف الببتيدات الغنية بالتكفيد وتحديد نمط جسر كبريتيد المقابل لها. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالتخلّص الانتقائي من بُتّيد ثنائي الوثّاق وخواصها الكيميائية والهيكلية اللاحقة. عموما الأفراد الجدد لهذه الطريقة سوف النضال لأن كل الببتيد الغنية كبريتيد يتصرف بشكل مختلف.
قد يكون التوليف والتحليل الأمثل جزئيا لpetide الفردية أو البروتين. نقل الكواشف المذكورة في بروتوكول النص إلى السفن المقابلة ووضعها في المضارب المناسبة من المزج الببتيد المرحلة الصلبة. ثم، إضافة 100 ملليغرام من الراتنج الجاف لأعمدة رد فعل ووضعها في مضرب المزج.
بدء تركيب الببتيد الصلبة المرحلة كما هو مفصل في بروتوكول النص. بعد الانتهاء من التوليف، lyophilized الراتنج بين عشية وضحاها. الآن اضمب الببتيد من الراتنج وأداء حماية عميقة من السلاسل الجانبية.
للقيام بذلك الجمع بين الراتنج المجفف في أنبوب 12 ملليلتر وتبريده إلى الصفر درجة مئوية على الجليد. أولا، إضافة 150 ميكرولترات من خليط زبال، ثم إضافة ملليلتر واحد من 95٪ حمض ثلاثي الفلوراستيك لكل 100 ملليغرام من الراتنج. اترك الخليط يرتجف بلطف لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة.
الآن، تصفية الخليط من خلال frit الزجاج. جمع الترشيح في أنابيب، مملوءة بشكل فردي مع الإيثر ديثيل الجليد الباردة في ملليلتر واحد من خليط الانقسام لكل ثمانية إلى 10 ملليلتر من الإيثر ديثيل. الببتيد يترسب كما الصلبة البيضاء.
بعد الشطف و طاردة الأنابيب كما هو موضح في بروتوكول النص، تجميد الجافة الببتيدات. لتنقية السلائف الخطية مع الكروماتوغرافيا نصف المعد إضافة ما يقرب من 70 ملليغرام من الببتيد الخام إلى أنبوب 15 ملليلتر. ثم قم بحل الببتيد الخام في 0.1٪ TFA وAcetonitrile واحد إلى واحد إلى الماء.
فصل خليط الببتيد باستخدام تدرج من صفر إلى 50٪ الوينت B أكثر من 120 دقيقة بمعدل تدفق 10 ملليلتر في الدقيقة. جمع الكسور في أنابيب فردية كما تظهر وإعداد الكسور المحددة لقياس الطيف الشامل وتحليل HPLC كما هو موضح في بروتوكول النص. تجميد الجافة الكسور والجمع بين الكسور الأقران.
بدء التشكيل الانتقائي للسندات كبريتيد من خلال تنفيذ الأكسدة الأولى. للقيام بذلك، قم بحل 15 ملليغرام من الببتيد الخطي المجفف بالتجميد في 105 ملليلتر من خليط ماء الإيزوبروبانول. اترك الخليط مع التحريك على الهواء في ظل الظروف الأساسية لمدة 12 إلى 48 ساعة.
الإجراء أكسدة الخطوة خطوة حرجة جدا. يتم اتخاذ ضوابط رد الفعل في جميع خطوات الأكسدة الثلاث لضمان تكوين غنية بالتكفد الفردية. الأكسدة الثالثة هي الأكثر أهمية لأن الهرولة من كبريتيد يمكن أن تحدث عندما يتم تجاوز وقت التفاعل الأمثل.
الآن أداء الأكسدة الثانية. تذوب 15 ملليغرام من الببتيد المجفف بالتجميد في 105 ملليلتر من ماء ايزوبروبانول ، خليط حمض الهيدروكلوريك المولر. إضافة 158 ميكرولترات من محلول اليود 0.1 المولر في الميثانول إلى الحل.
يُحرّك التفاعل في درجة حرارة الغرفة حتى تكتمل الأكسدة. ثم وقف رد الفعل عن طريق إضافة 79 ميكرولترات من حمض الأسكوربيك الضرس واحد في الماء. وأخيراً إجراء الأكسدة الثالثة.
حل 15 ملليغرام من الببتيد المجفف بالتجميد في 5.5 ملليلتر من TFA تحتوي على خليط زبال. عجل الببتيد في أنابيب تحتوي على الإيثر ثنائي الإيثيل البارد في ملليلتر واحد من حل التفاعل لكل ثمانية إلى عشرة ملليلترات من الإيثر ديثيل. لأداء تنقية الببتيد في 15 ملليغرام من المنتج الخام تجميد المجففة إلى أنبوب 15 ملليلتر.
قم بإذابة المنتج الخام في حجم حلقة عينة HPLC باستخدام خليط من 0.1٪ TFA وواحد إلى واحد الأسيتريتريل إلى الماء. بعد دوامة حتى حل كامل، الطرد المركزي الحل من دقيقة واحدة في 3400 مرات G.Draw حتى خليط 3.6 ملليلتر في حقنة 5 ملليلتر وحقن العينة دون أي فقاعات الهواء في حلقة الحقن. بدء الحقن في نظام HPLC.
تنقية خليط الببتيد باستخدام تدرج من صفر إلى 50٪ الوينت B أكثر من 120 دقيقة بمعدل تدفق 10 ملليلتر في الدقيقة. جمع الكسور في أنابيب الفردية كما تظهر. بعد اكتمال التشغيل، قم بإعداد الكسور المحددة لتحليل MS و HPLC كما هو موضح في النص.
تجميد الجافة جميع الكسور وتخزينها في ناقص 20 درجة مئوية. لتنفيذ HPLC التحليلية, نقل عينات من الكسور الببتيد أو عناصر التحكم في التفاعل في قارورة HPLC وتذوب في خليط من 0.1٪ TFA في واحد إلى واحد الأسيتريتريل إلى الماء. ضع قارورة HPLC في العينات التلقائية للمرحلة التحليلية التي تم تعيينها HPLC لضخ 250 ميكرولترات من كل عينة.
استخدام نظام الانحدار elution من 0.1 ٪ TFA في الماء كما Eluent A في 0.1 ٪ TFA في الأسيتونتريل كما الوينت B.تحليل الببتيد باستخدام تدرج من 10 ٪ إلى 40 ٪ Eluent B أكثر من 30 دقيقة بمعدل تدفق 1.0 ملليلتر في الدقيقة. لإجراء تحليل الأحماض الأمينية، نقل 100 ميكروغرام من الببتيد النقي إلى أنبوب 1.5 ملليلتر أجهزة الطرد المركزي الصغيرة وحل المسحوق في 200 ميكرولترات من ستة مولور HCL. بعد نقل الحل إلى أمبول زجاجي ، أغلق أمبول عن طريق تسخين الرقبة بهب ونسخ bunsen.
ثم ضع أنبوب زجاجي يحمل أمبول في كتلة التدفئة لمدة 24 ساعة في 110 درجة مئوية للتحلل. بعد 24 ساعة، افتح أمبول ونقل المحلول إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير ميليلتر. الطرد المركزي الحل لمدة ست ساعات في ستين درجة مئوية و 210 مرات G في فراغ التناوب المكثف.
ثم قم بحل المنتج المتحلل في 192 ميكرولترات من العازلة التخفيف العينة ونقل الحل إلى مرشح الطرد المركزي الجزئي. بعد الطرد المركزي للعينة لمدة دقيقة واحدة في 2300 مرات G، نقل 100 ميكرولترات من الترشيح إلى أنبوب عينة تحليل الأحماض الأمينية. ضع الأنبوب في محلل الأحماض الأمينية وابدأ التحليل.
وخلال هذا البروتوكول السابق للحد من التحلل، من الأهمية بمكان أن تتخذ عدة ضوابط رد فعل من أجل الحصول على مرتين أو أربع مرات الأنواع الميثيلات الكابا التي لا غنى عنها لتحليل كبريتيد لاحقا عن طريق قياس الطيف الشامل. أول حل 600 ميكروغرام من الببتيد النقي في 1.2 ملليلتر من 0.05 عازلة citrate ضرس تحتوي على TCEP. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة أخذ عدة 100 ميكرولتر عينات التحكم في التفاعل تتراوح بين صفر إلى 30 دقيقة.
اخلط العينات في أنبوب أجهزة طرد مركزي صغير 1.5 ملليلتر مع 300 ميكرولترات من عازلة الألكيل لوقف التفاعل وإجراء ميثيل الكربونيل لمجموعات الثيول الحرة. وقف رد الفعل بعد خمس دقائق عن طريق إضافة 100 ميكرولترات من 10٪ TFA والمياه وتخزين العينات على الجليد الجاف. الآن تنفيذ HPLC على العينات كما هو مفصل في بروتوكول النص.
نقل كمية صغيرة من كل كسر تم جمعها إلى أنبوب أجهزة طرد مركزي صغيرة 1.5 ملليلتر لتحليل MS/MS للأشكال المؤكدة. قم بحل الببتيد المتبقي في 0.1٪ TFA في الماء وإضافة حجم مناسب على 100 ميل TCEP 10 ملليمولار للحصول على تركيز TCEP النهائي من 10 ملليمولار. عند هذه النقطة، يمكن فحص الألكيلية السيستين انتقائية عن طريق تسلسل الببتيد.
مع الببتيدات اثنين في الوسط، وتحديد نمط جسر ثنائي الكبريتيد ممكن. يتم إجراء تحليل NMR من الأيزومرات المختلفة للكشف عن هياكل الببتيد الفردية. وتظهر الهياكل العشرين ذات الطاقات الدنيا وكذلك الربط بالتكريد من الأيزومرات المختلفة.
وتجدر الإشارة إلى أن الجمع بين تجزئة HPLC MS/MS وتحليل الـ NMR في المرحلة المعكوسة مطلوب لتحديد اتصال ثنائي الكبريتيد بشكل لا لبس فيه. أوضحت المقارنة بين قيمة الانحراف التربيعي لقيمة الجذر أن الببتيد الجامد يؤدي في الغالب إلى بنية NMR محسّلة. هذا الفيديو يجب أن تعطيك مثالا كيفية توليف انتقائي الببتيدات مع نمط السندات ثاني كبريتيد المطلوب.
كما يظهر إمكانية التحقق من الاتصال الصحيح بالفكريد عن طريق قياس الطيف الكتلي الطري والحصول على بنية ثلاثية الأبعاد عن طريق التحليل الطيفي للـ NMR. بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تخليق الببتيد لاستكشاف أهمية أنماط السندات من ثاني كبريتيد للهيكل ثلاثي الأبعاد وبالتالي نشاط أيزومرات الببتيد هذه. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل ASAS النشاط من أجل الحصول على نظرة ثاقبة في علاقات نشاط هيكل من ايزومرات الببتيد المختلفة في الهدف البيولوجي المحدد.
على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في تركيب وتحليل كونوكسيثان، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على غيرها من الببتيدات جسر كبريتيد والبروتينات مثل fenzens، السموم الحيوانية الغنية بالكبريتيد وغيرها من الجزيئات التي تحتوي على السيستين المتعددة.
