يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال حيوية، مثل صحة الميتوكوندريا، والكفاءة النشطة واستخدام الطاقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن استهلاك الأكسجين من الميتوكوندريا المعزولة يقاس مباشرة. النتائج لا تحتاج إلى تصحيح لعمليات الأيض الأخرى داخل الخلايا.
قررنا أولاً اتباع هذه الطريقة في ماشية الألبان عندما أردنا دراسة كيفية تأثير كفاءة الميتوكوندريا على كفاءة التغذية. عرض الفيديو من هذه الطريقة أمر بالغ الأهمية كما الخطوات في العزل الميتوكوندريا من الصعب تعلم لأنها تحتاج إلى أن تكون متسقة ودقيقة. في أقرب وقت ممكن بعد إزالة عينة الكبد من البقر غسل العينة في وسائط عزل الميتوكوندريا لإزالة خلايا الدم الحمراء.
باستخدام مقص ناعما مفروم الأنسجة في منقار مبردة التي تحتوي على وسائل الإعلام عزل ما يكفي للحفاظ على الأنسجة رطبة. نقل الكبد المفروم إلى قارورة زجاجية 30 ملليلتر تحتوي على وسائط عزل الميتوكوندريا. إضافة آفة تفلون التي لديها إزالة 0.16 ملليمتر، وقد احتضنت في الجليد وتجانس عينة الكبد في 500 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة مع أربع ضربات في الدقيقة.
بعد ذلك، نقل المتجانسة إلى أنبوب يحتوي على وسائل الإعلام عزل الميتوكوندريا ووضع هذا في منقار معبأة بالجليد. التجانس الطرد المركزي في 500 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقيقة. تخلص من البيليه ونقل المابير إلى أنبوب طرد مركزي مبرد.
أجهزة الطرد المركزي ناسخة الناتجة في 10،000 مرات G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق للحصول على بيليه الميتوكوندريا. Resuspend وغسل بيليه في 10 ملليلتر من وسائل الإعلام عزل الميتوكوندريا مع حمض الدهنية خالية من BSA. ثم جهاز الطرد المركزي في 8، 100 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
تجاهل supernatant وإعادة فرض بيليه في 200 microliters من وسائل الإعلام العزل. ضع هذا على الجليد حتى تصبح جاهزة للاستخدام لاستهلاك الأكسجين والبروتون تسرب المقايسات الحركية. تحديد تركيز البروتين من تعليق بيليه باستخدام طقم حمض bicinchoninic في تعليمات الشركة المصنعة باستخدام BSA كمعيار.
أولاً، إنشاء وسائط استهلاك الأكسجين كما هو موضح في بروتوكول النص. احتضان وسائل الإعلام استهلاك الأوكسجين في 30 درجة مئوية. المقبل، إعداد غرفة التنفس، مضخة وكهرباء الأكسجين لنظام الأوكسيجراف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
ثم ضع ملليلتر واحد من وسائل الإعلام استهلاك الأكسجين في غرفة التنفس. ثم إضافة 0.35 ملليغرام من بروتين الميتوكوندريا إلى الغرفة. يحرك بقوة لضمان أن يصبح الحل مشبعة بالهواء والحفاظ على درجة حرارة 30 درجة مئوية.
سجل استهلاك الأكسجين لمدة خمس دقائق تقريبًا. عندما يصبح استهلاك الأكسجين ثابتًا يمثله خط مستقيم متناقص ، قم بتسجيل هذا كـ استهلاك الأكسجين الأساسي. إضافة 1.25 ميكرولترات من محلول أربعة ملليمترات الروتينون لمنع واحد معقدة، ومن ثم إضافة خمسة ميكرولترات من محلول واحد بوتشينات الضرس للوصول إلى تركيز نهائي من خمسة ملليمولار succinate في غرفة الجهاز التنفسي.
هذا هو إستهلاك الأكسجين في الحالة الرابعة. بعد ذلك، أضف ميكرولتر واحد من محلول ADP 100 مليمولار للوصول إلى تركيز نهائي من 100 ميكرومولار في غرفة التنفس. سوف ينخفض استهلاك الأكسجين لمدة خمس دقائق تقريباً ثم سيصبح خط مستقيم.
سجل هذا استهلاك الأكسجين كما التنفس الدولة الثالثة. حساب نسبة التحكم في الجهاز التنفسي كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم تُفطّن جميع الحلول من غرفة التنفس.
شطف الغرفة عدة مرات مع الماء المزدوج الأيونية. أولاً، إعداد حل من 80 نانوغرام لكل ملليلتر من النيجر في الإيثانول الحد من كمية الإيثانول المضافة إلى أقل من ميكرولتر واحد. أيضا، إعداد حل من ثمانية ميكروغرام لكل ملليلتر oligomycin في الإيثانول.
بعد شطف الغرفة بدقة مع المياه المزدوجة deionized، ضع ملليلتر واحد من وسائل الإعلام استهلاك الأكسجين في غرفة التنفس ويحرك بقوة مع شريط ضجة المغناطيسي. أضف 0.35 ملليغرام من بروتين الميتوكوندريا إلى غرفة التنفس. أضف قطبًا حساسًا لثبيل فوسفونيوم الميثيل إلى إعداد الغرفة مع التأكد من أن الطرف الآخر متصل بشكل صحيح بمتر pH.
إضافة 1.25 ميكرولترات من محلول روفينون أربعة ملليمولار لمنع I.Record المعقدة التنفس لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق. سجل قيمة استهلاك الأكسجين عندما يصبح ثابتا. بعد ذلك، إضافة 0.56 ميكرولترات من حل oligomycin لمنع استخدام شرطة أبوظبي.
سجل التنفس لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق. سجل قيمة استهلاك الأكسجين عندما يصبح ثابتا. ثم إضافة 0.112 ميكرولترات من 80 نانوغرام في حل النيجرية المليلتر لإلغاء التدرج PH عبر الغشاء الداخلي الميتوكوندريا.
سجل التنفس لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق ولاحظ قيمة استهلاك الأكسجين عندما يصبح ثابتًا. إضافة خمسة ميكروليترات من 10 ملليمولار الميثيل ثلاثي الفينيلفوسفونيوم حل لاحتضان الميتوكوندريا للبدء في إعداد منحنى قياسي. كرر هذه الإضافة أربع مرات إضافية حتى تركيز إجمالي قدره 2.5.
وقد تمت إضافة ميكرومولار. بعد هذا، إضافة خمسة ميكرولترات من محلول واحد رزينة الضرس إلى الغرفة لبدء التنفس. سجل التنفس حتى يتم تحقيق أثر مستقر.
ثم إضافة ماسونات إلى titrate النظام كما هو موضح في بروتوكول النص. في هذه الدراسة، يتم قياس حركية تسرب RCR والبروتون في حليب الأبقار الحلوب هولشتاين بعد 70 يوما من الأبقار الحلوب قد تم إطعامها بمستويات مختلفة من النحاس والزنك والمنغنيز لمدة 28 يوما. وينظر إلى التنفس في الدولة الرابعة على أنه الأعلى في الأبقار نظرا لانخفاض مستويات المنغنيز، ومع ذلك هو أدنى مستوى في الأبقار السيطرة، مما يشير إلى أن المنغنيز يلعب دورا هاما في تقليل التنفس الذي يعتمد على تسرب البروتونات.
ويكشف تحليل التنفس الذي يعتمد على تسرب البروتون الكبدي أن هذا التنفس هو الأكبر في الأبقار المعالجة بالمنغنيز المنخفض، وأدنى الأبقار المسيطرة. هذه النتائج تؤكد أن مجموعة المنغنيز المنخفضة لديها أكبر حالة التنفس الرابع في حين أن مجموعة التحكم لديها أدنى. في حين أن كفاءة الأعلاف أعلى في أنجوس توجه ولدت من الثيران RFI منخفضة من الثيران RFI عالية، وهذا لم ينعكس في RCR الميتوكوندريا أو حركية تسرب البروتون.
أثناء تنفيذ هذا الإجراء من المهم الحفاظ على جميع القوارير والقارور على الجليد أثناء معالجة الميتوكوندريا. بعد تطورها مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التغذية الألبان لاستكشاف دور كفاءة الميتوكوندريا في كفاءة الأعلاف ووظيفة الميتوكوندريا في الكبد. لا تنس أن العمل مع الروتينون يمكن أن يكون خطيرا، وينبغي اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات وحماية العين والمعدات الشخصية المناسبة دائما أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
