Bu yöntem, mitokondriyal sağlık, enerji verimliliği ve enerji kullanımı gibi enerji alanında anahtar soruların cevapyardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı izole mitokondri oksijen tüketimi doğrudan ölçülür olmasıdır. Diğer hücre içi metabolik süreçler için sonuçların düzeltilmesi gerekmez.
Mitokondriyal verimliliğin yem verimliliğini nasıl etkilediğini incelemek istediğimizde ilk olarak süt sığırlarında bu yöntemi sürdürmeye karar verdik. Mitokondriyal izolasyondaki adımların anlaşılması zor olduğundan, tutarlı ve kesin olmaları gerektiğinden, bu yöntemin video gösterimi çok önemlidir. Karaciğer örneği kaldırıldıktan sonra en kısa sürede kırmızı kan hücrelerini kaldırmak için mitokondri izolasyon medya örnek yıkayın.
Makas kullanarak ince doku nemli tutmak için yeterli izolasyon ortamı içeren bir soğutulmuş kabıiçine doku kıyma. Kıyılmış karaciğeri mitokondri izolasyon uğrama içeren 30 mililitrelik cam şişeye aktarın. 0.16 milimetre lik bir açıklığa sahip ve buzda kuluçkaya yatan bir Teflon haşere ekleyin ve dakikada dört vuruşla bir dakika boyunca 500 RPM'de karaciğer örneğini homojenize edin.
Bundan sonra, mitokondri izolasyon ortamı içeren bir tüp için homojen aktarın ve bir buz dolu kabın içine yerleştirin. Santrifüj 500 kez G ve 10 dakika boyunca 4 santigrat derecede homojen. Pelet atın ve soğutulmuş bir santrifüj tüp için supernatant aktarın.
Mitokondriyal pelet elde etmek için 10, 000 kez G ve dört derece santigrat 10 dakika sonuçlanan supernatant santrifüj. Yağ asidiiçermeyen BSA ile 10 mililitre mitokondri izolasyon medyasında peleti yeniden askıya alın ve yıkayın. Sonra 8, 100 kez G ve 10 dakika boyunca 4 santigrat derece santrifüj.
Supernatant atın ve izolasyon medya 200 mikrolitre pelet resuspend. Oksijen tüketimi ve proton sızıntı kinetik tahliller için kullanıma hazır olana kadar buz bu yerleştirin. Standart olarak BSA kullanarak üreticinin talimatları başına bir bicinchoninic asit kiti kullanarak pelet süspansiyon protein konsantrasyonu belirleyin.
İlk olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi oksijen tüketim ortamı oluşturun. Oksijen tüketim ortamını 30 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, üreticinin talimatlarına göre oksigraf sistemi için solunum odası, pompa ve oksijen elektrotunu ayarlayın.
Daha sonra solunum odasına bir mililitre oksijen tüketimi ortamı yerleştirin. Sonra haznemine 0.35 miligram mitokondriyal protein ekleyin. Çözeltinin havayla doymasını sağlamak ve 30 santigrat derecelik bir sıcaklığı korumak için şiddetle karıştırın.
Oksijen tüketimini yaklaşık beş dakika kaydedin. Oksijen tüketimi azalan düz bir çizgi ile sabit hale geldiğinde, bunu temel oksijen tüketimi olarak kaydedin. Karmaşık bir inhibe etmek için dört milimolar rotenon çözeltisi 1.25 mikrolitre ekleyin, ve sonra solunum odasında beş milimolar succinate son konsantrasyonulaşmak için bir azı succinate çözeltisi beş mikrolitre ekleyin.
Bu durum IV oksijen tüketimidir. Bundan sonra, solunum odasında 100 mikromolar nihai konsantrasyonulaşmak için 100 milimolar ADP çözeltisi bir mikrolitre ekleyin. Oksijen tüketimi yaklaşık beş dakika azalacak ve daha sonra düz bir çizgi haline gelecektir.
Bu oksijen tüketimini durum III solunumu olarak kaydedin. Metin protokolünde belirtildiği gibi solunum kontrol oranını hesaplayın. Daha sonra tüm çözeltileri solunum odasından aspire edin.
Odayı birkaç kez çift deiyonize suyla durulayın. İlk olarak, bir mikrolitreden daha az eklenen etanol miktarını sınırlayan etanol de nigericin mililitre başına 80 nanogram bir çözüm hazırlamak. Ayrıca, etanol mililitre oligomisin başına sekiz mikrogram bir çözüm hazırlamak.
Odayı çift deiyonize suyla iyice duruladıktan sonra, oksijen tüketim ortamının bir mililitresini solunum odasına yerleştirin ve manyetik bir karıştırma çubuğuyla şiddetle karıştırın. Solunum odasına 0.35 miligram mitokondriyal protein ekleyin. Diğer ucunun bir pH metreye düzgün bir şekilde bağlı olduğundan emin olmak için oda kurulumuna metil trifenilfosfonyum duyarlı elektrot ekleyin.
Kompleks I.Record solunumu iki ila beş dakika boyunca inhibe etmek için dört milimolar rotenon çözeltisinin 1,25 mikrolitresini ekleyin. Sabit olduğunda oksijen tüketim değerini kaydedin. Daha sonra, ADP kullanımını inhibe etmek için bir oligomisin çözeltisi 0.56 mikrolitre ekleyin.
Solunumu yaklaşık 2-5 dakika kaydedin. Sabit olduğunda oksijen tüketim değerini kaydedin. Sonra mitokondriyal iç membran boyunca pH gradyanı kaldırmak için mililitre nigericin çözeltisi başına 80 nanogram 0.112 mikrolitre ekleyin.
Solunumu 2-5 dakika kaydedin ve sabit olduğunda oksijen tüketim değerine dikkat edin. Standart bir eğri hazırlamaya başlamak için mitokondriyal kuluçkaya beş mikrolitre 10 milimolar metil trifenifosfonyum çözeltisi ekleyin. Toplam 2,5 konsantrasyona kadar bu eklemeyi dört kez daha tekrarlayın.
mikromolar eklenmiştir. Bundan sonra, solunum başlatmak için odasına bir azı çözeltisi çözeltisi beş mikrolitre ekleyin. Kararlı bir iz elde edilene kadar solunumu kaydedin.
Daha sonra metin protokolünde belirtildiği gibi sistemi titre etmek için malonate ekleyin. Bu çalışmada, RCR ve proton kaçak kinetik süt 70 gün sonra süt bakır, çinko ve manganez farklı düzeylerde 28 gün beslendi sonra süt ölçülür. Devlet IV solunum manganez düşük düzeyde verilen en yüksek olarak görülür, henüz kontrol en düşük, manganez proton sızıntıbağımlı solunum en aza indirmek önemli bir rol oynadığını gösteren.
Hepatik proton sızıntıya bağımlı solunum analizi, bu solunumun düşük manganez ile tedavi edilen en yüksek, kontrol ise en düşük olduğunu ortaya koymaktadır. Bu sonuçlar düşük manganez grubunun en büyük durum IV solunumuna sahip olduğunu, kontrol grubunun ise en düşük olduğunu doğrulamaktadır. Düşük RFI boğalarından doğan Angus'larda yem verimi yüksek RFI boğalarına göre daha yüksek olsa da, bu mitokondriyal RCR'ye veya proton sızıntısı kinetiklerine yansımadı.
Bu işlemi gerçekleştirirken mitokondriyi işlerken tüm şişeleri ve gagaları buzda tutmak önemlidir. Bu teknik, geliştirilmesinden sonra süt ürünleri beslenmesi alanında araştırmacıların karaciğerde yem verimliliği ve mitokondriyal fonksiyondaki mitokondri verimliliğinin rolünü keşfetmelerinin önünü açmıştır. Rotenon ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven takmak, göz koruması ve uygun PPE gibi önlemler her zaman alınmalıdır.
