Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo energetico, come la salute mitocondriale, l'efficienza energetica e l'utilizzo di energia. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il consumo di ossigeno dei mitocondri isolati viene misurato direttamente. I risultati non devono essere corretti per altri processi metabolici intracellulari.
Abbiamo deciso per la prima volta di perseguire questo metodo nei bovini da latte quando volevamo esaminare in che modo l'efficienza mitocondriale influisce sull'efficienza dei mangimi. La dimostrazione video di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi nell'isolamento mitocondriale sono difficili da imparare perché devono essere coerenti e precisi. Il prima possibile dopo che il campione di fegato è stato rimosso dalla mucca lavare il campione in mezzi di isolamento mitocondri per rimuovere i globuli rossi.
L'uso di forbici trita finemente il tessuto in un becher refrigerato che contiene abbastanza mezzi di isolamento per mantenere il tessuto umido. Trasferire il fegato tritato in una fiala di vetro da 30 millilitri contenente mezzi di isolamento dei mitocondri. Aggiungere un pestello di Teflon che ha una clearance di 0,16 millimetri e che è stato incubato nel ghiaccio e omogeneizzare il campione di fegato a 500 giri/min per un minuto con quattro colpi al minuto.
Successivamente, trasferire l'omogeneato in un tubo contenente mezzi di isolamento dei mitocondri e posizionare questo in un becher pieno di ghiaccio. Centrifuga omogeneizzare a 500 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Scartare il pellet e trasferire il supernatante in un tubo di centrifuga refrigerato.
Centrifugare il supernatante risultante a 10.000 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti per ottenere il pellet mitocondriale. Resuspend e lavare il pellet in 10 millilitri di mezzi di isolamento dei mitocondri con BSA privo di acidi grassi. Quindi centrifugare a 8,100 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 200 microlitri di mezzi di isolamento. Mettere questo sul ghiaccio fino a quando non è pronto per l'uso per il consumo di ossigeno e test cinetici di perdita di protoni. Determinare la concentrazione proteica della sospensione a pellet utilizzando un kit di acido bicinchoninico per istruzioni del produttore utilizzando BSA come standard.
In primo luogo, creare supporti di consumo di ossigeno come delineato nel protocollo di testo. Incubare il supporto di consumo di ossigeno a 30 gradi Celsius. Successivamente, impostare la camera di respirazione, la pompa e l'elettrodo di ossigeno per il sistema di ossimoro secondo le istruzioni del produttore.
Quindi posizionare un millilitro di mezzi di consumo di ossigeno nella camera respiratoria. Quindi aggiungere 0,35 milligrammi di proteine mitocondriali alla camera. Mescolare vigorosamente per assicurarsi che la soluzione diventi satura d'aria e mantenere una temperatura di 30 gradi Celsius.
Registrare il consumo di ossigeno per circa cinque minuti. Quando il consumo di ossigeno diventa costante rappresentato da una linea retta decrescente, registrarlo come consumo di ossigeno di base. Aggiungere 1,25 microlitri di una soluzione di rotenone a quattro millimolari per inibire uno complesso, quindi aggiungere cinque microlitri di una soluzione succinata molare per raggiungere una concentrazione finale di cinque succinati millimolari nella camera respiratoria.
Questo è il consumo di ossigeno dello stato IV. Successivamente, aggiungere un microlitro di una soluzione ADP da 100 millimolare per raggiungere una concentrazione finale di 100 micromolari nella camera di respirazione. Il consumo di ossigeno diminuirà per circa cinque minuti e diventerà quindi una linea retta.
Registrare questo consumo di ossigeno come respirazione di stato III. Calcolare il rapporto di controllo respiratorio come indicato nel protocollo di testo. Quindi aspirare tutte le soluzioni fuori dalla camera respiratoria.
Risciacquare la camera più volte con doppia acqua deionizzata. In primo luogo, preparare una soluzione di 80 nanogrammi per millilitro di nigericina in etanolo limitando la quantità di etanolo aggiunto a meno di un microlitro. Inoltre, preparare una soluzione di otto microgrammi per oligomicina millilitro in etanolo.
Dopo aver risciacquato accuratamente la camera con doppia acqua deionizzata, posizionare un millilitro del supporto di consumo di ossigeno nella camera di respirazione e mescolare vigorosamente con una barra di agitazione magnetica. Aggiungere 0,35 milligrammi di proteine mitocondriali alla camera respiratoria. Aggiungere un elettrodo metil tripfenilfosfonico sensibile alla configurazione della camera assicurandosi che l'altra estremità sia correttamente collegata a un misuratore di pH.
Aggiungere 1,25 microlitri di una soluzione di rotenone da quattro millimolare per inibire il complesso I.Registrare la respirazione per due o cinque minuti. Registrare il valore di consumo di ossigeno quando diventa costante. Successivamente, aggiungere 0,56 microlitri di una soluzione di oligomicina per inibire l'utilizzo dell'ADP.
Registrare la respirazione per circa due o cinque minuti. Registrare il valore di consumo di ossigeno quando diventa costante. Quindi aggiungere 0,112 microlitri di una soluzione di nigericina da 80 nanogrammi per millilitro per abolire il gradiente di pH attraverso la membrana interna mitocondriale.
Registrare la respirazione per due o cinque minuti e notare il valore di consumo di ossigeno quando diventa costante. Aggiungere cinque microlitri di 10 millimolare soluzione di trifenilfosfonio all'incubazione mitocondriale per iniziare a preparare una curva standard. Ripetere questa aggiunta quattro volte in più fino a una concentrazione totale di 2,5.
micromolare è stato aggiunto. Successivamente, aggiungere cinque microlitri di una soluzione di succinato molare alla camera per avviare la respirazione. Registrare la respirazione fino a ottenere una traccia stabile.
Quindi aggiungere il malonato per titolare il sistema come delineato nel protocollo di testo. In questo studio, l'RCR e la cinetica della perdita di protoni vengono misurate nel latte delle vacche da latte Holstein 70 giorni dopo che le vacche da latte erano state nutrite con diversi livelli di rame, zinco e manganese per 28 giorni. La respirazione di Stato IV è considerata la più alta nelle mucche dati bassi livelli di manganese, ma è più bassa nelle mucche di controllo, indicando che il manganese svolge un ruolo importante nel ridurre al minimo la respirazione dipendente dalla perdita di protoni.
L'analisi della respirazione epatica dipendente dalla perdita di protoni rivela che questa respirazione è maggiore nelle mucche trattate con manganese basso e le mucche di controllo più basse. Questi risultati confermano che il gruppo del manganese basso ha la più grande respirazione di stato IV mentre il gruppo di controllo ha il più basso. Mentre l'efficienza dei mangimi è più elevata nei manzi Angus nati da tori RFI bassi rispetto ai tori RFI alti, questo non si riflette nell'RCR mitocondriale o nella cinetica della perdita di protoni.
Durante l'esecuzione di questa procedura è importante tenere tutte le fiale e i becher sul ghiaccio durante l'elaborazione dei mitocondri. Dopo il suo sviluppo questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della nutrizione lattiero-casearia per esplorare il ruolo dell'efficienza dei mitocondri nell'efficienza dei mangimi e nella funzione mitocondriale nel fegato. Non dimenticare che lavorare con rotenone può essere pericoloso e precauzioni come indossare guanti, protezione degli occhi e DPI adeguati dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
