Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo energético, como saúde mitocondrial, eficiência energética e uso de energia. A principal vantagem dessa técnica é que o consumo de oxigênio de mitocôndrias isoladas é medido diretamente. Os resultados não precisam ser corrigidos para outros processos metabólicos intracelulares.
Decidimos primeiro buscar esse método no gado leiteiro quando queríamos examinar como a eficiência mitocondrial impacta a eficiência alimentar. A demonstração em vídeo deste método é fundamental, pois os passos do isolamento mitocondrial são difíceis de aprender porque precisam ser consistentes e precisos. O mais rápido possível depois que a amostra hepática é removida da vaca lave a amostra na mídia de isolamento das mitocôndrias para remover os glóbulos vermelhos.
Usando uma tesoura finamente pica o tecido em um béquer resfriado que contém mídia de isolamento suficiente para manter o tecido úmido. Transfira o fígado picado para um frasco de vidro de 30 mililitros contendo mídia de isolamento de mitocôndrias. Adicione um pilão de Teflon que tenha uma folga de 0,16 milímetros e que tenha sido incubado em gelo e homogeneize a amostra hepática a 500 RPM por um minuto com quatro golpes por minuto.
Depois disso, transfira o homogeneado para um tubo contendo mídia de isolamento mitocôndria e coloque-o em um béquer embalado no gelo. Centrífuga homogeneiza a 500 vezes G e 4 graus Celsius por 10 minutos. Descarte a pelota e transfira o supernatante para um tubo de centrífuga refrigerado.
Centrifugar o supernante resultante a 10.000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos para obter a pelota mitocondrial. Resuspend e lave a pelota em 10 mililitros de mídia de isolamento de mitocôndrias com BSA livre de ácidos graxos. Em seguida, centrífuga a 8,100 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos.
Descarte o supernatante e resuspenja a pelota em 200 microliters de mídia de isolamento. Coloque isso no gelo até estar pronto para usar para o consumo de oxigênio e ensaios cinéticos de vazamento de prótons. Determine a concentração proteica da suspensão da pelota usando um kit de ácido bicinchonínico por instruções do fabricante usando BSA como padrão.
Primeiro, crie mídia de consumo de oxigênio conforme descrito no protocolo de texto. Incubar a mídia de consumo de oxigênio a 30 graus Celsius. Em seguida, configure a câmara de respiração, bomba e eletrodo de oxigênio para o sistema de oxígrafo de acordo com as instruções do fabricante.
Em seguida, coloque um mililitro de mídia de consumo de oxigênio na câmara de respiração. Em seguida, adicione 0,35 miligramas de proteína mitocondrial à câmara. Mexa vigorosamente para garantir que a solução fique saturada de ar e mantenha uma temperatura de 30 graus Celsius.
Regisso o consumo de oxigênio por aproximadamente cinco minutos. Quando o consumo de oxigênio se torna constante representado por uma linha reta decrescente, regise isso como o consumo de oxigênio na linha de base. Adicione 1,25 microlitres de uma solução rotenona de quatro milimilas para inibir um complexo e, em seguida, adicione cinco microliters de uma solução de succinita molar para alcançar uma concentração final de cinco milimilas de succinato na câmara respiratória.
Isto é consumo de oxigênio iv estadual. Depois disso, adicione um microliter de uma solução ADP de 100 milimões para atingir uma concentração final de 100 micromolares na câmara de respiração. O consumo de oxigênio diminuirá por aproximadamente cinco minutos e, em seguida, se tornará uma linha reta.
Regisso consumo de oxigênio como o estado III respiração. Calcule a razão de controle respiratório conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, aspire todas as soluções para fora da câmara de respiração.
Enxágüe a câmara várias vezes com água deionizada dupla. Primeiro, prepare uma solução de 80 nanogramas por mililitro de nigericin no etanol limitando a quantidade de etanol adicionada a menos de um microliter. Além disso, prepare uma solução de oito microgramas por oligomicina mililitro no etanol.
Depois de enxaguar completamente a câmara com água deionizada dupla, coloque um mililitro da mídia de consumo de oxigênio na câmara de respiração e mexa vigorosamente com uma barra de agitação magnética. Adicione 0,35 miligramas de proteína mitocondrial à câmara de respiração. Adicione um eletrodo sensível ao triphenylphosphonium à configuração da câmara certificando-se de que a outra extremidade esteja adequadamente conectada a um medidor de pH.
Adicione 1,25 microliters de uma solução rotenona de quatro milimonas para inibir o Complexo I.Grave a respiração por dois a cinco minutos. Regissue o valor de consumo de oxigênio quando se tornar constante. Em seguida, adicione 0,56 microliters de uma solução de oligomicina para inibir a utilização de ADP.
Regisso o tempo por cerca de dois a cinco minutos. Regissue o valor de consumo de oxigênio quando se tornar constante. Em seguida, adicione 0,112 microliters de uma solução de 80 nanogramas por mililitro nigericin para abolir o gradiente de pH através da membrana interna mitocondrial.
Regissão a respiração por dois a cinco minutos e observe o valor de consumo de oxigênio quando ele se torna constante. Adicione cinco microliters de 10 milimolars de solução de triphenylphosphonium de metila à incubação mitocondrial para começar a preparar uma curva padrão. Repita esta adição quatro vezes adicionais até uma concentração total de 2,5.
micromolar foi adicionado. Depois disso, adicione cinco microliters de uma solução de succinita molar à câmara para iniciar a respiração. Regisso a respiração até que um traço estável seja alcançado.
Em seguida, adicione malonato para titular o sistema conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, a cinética de vazamento de RCR e prótons é medida no leite de vacas leiteiras holstein 70 dias após as vacas leiteiras terem sido alimentadas com diferentes níveis de cobre, zinco e manganês por 28 dias. A respiração do Estado IV é vista como a mais alta em vacas, dado baixos níveis de manganês, mas é mais baixa nas vacas de controle, indicando que o manganês desempenha um papel importante na minimização da respiração dependente de vazamento de prótons.
A análise da respiração hepática dependente de vazamento de prótons revela que essa respiração é maior em vacas tratadas com baixo manganês, e a mais baixa em vacas de controle. Esses resultados confirmam que o grupo de baixo manganês tem a maior respiração iv estadual, enquanto o grupo controle tem o menor. Embora a eficiência alimentar seja maior em bois Angus nascidos de touros de RFI baixos do que touros RFI altos, isso não se refletiu no RCR mitocondrial ou na cinética de vazamento de prótons.
Ao realizar este procedimento é importante manter todos os frascos e béquers no gelo enquanto processam as mitocôndrias. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de nutrição leiteira explorarem o papel da eficiência das mitocôndrias na eficiência alimentar e na função mitocondrial no fígado. Não se esqueça que trabalhar com rotenone pode ser perigoso, e precauções como usar luvas, proteção ocular e EPI adequado devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
