يتيح هذا البروتوكول الاستخدام المتكرر لمصفوفة الرئة السليمة خارج الخلية كركيزة ثلاثية الأبعاد لزراعة الأنسجة وإنتاجية معتدلة. الميزة الرئيسية لنظام أنسجة الرئة الهندسي هي مرونة المنصة. يمكن تكييف ELTs لاستخدام مختلف سقالات الأنسجة أو الخلايا أو وسائط الثقافة ذات الاهتمام.
بمجرد استخراج الرئتين ، املأ حقنة 10 ملليلتر بالأغاروز و HBSS بدون أحمر الفينول. قم بتضخيم الرئتين بحوالي 10 ملليلتر من الهواء عبر قنية القصبة الهوائية ، ثم حقن الأغاروز المحضر على الفور عبر قنية القصبة الهوائية حتى يتم تضخيم الأطراف البعيدة لفصوص الرئة. قم بتغطية القصبة الهوائية عن طريق إرفاق الغطاء الأبيض من ستوبكوك رباعي الاتجاهات إلى قفل اللوير الأنثوي لقنية القصبة الهوائية.
ضع الرئة في طبق بتري بقطر 150 ملم على الجليد للسماح للأغاروز بالتصلب. قم بإعداد شرائح الرئة وفقا للبروتوكول الموجود في المخطوطة ، ثم املأ طبق بتري 100 ملم بحجم 1/3 من PBS. انقل الكاسيت وعلامات التبويب إلى الطبق باستخدام الملقط.
إذا تم تجميد الشرائح ، فقم بإذابة طبق واحد في كل مرة عن طريق سكبها على PBS في درجة حرارة الغرفة. ثم انقل شريحة مذابة إلى طبق بتري بسعة 150 ملم. افتح الشريحة بلطف باستخدام ملقط ناعم أو مرقئ واستنشق PBS الزائد بعناية من جميع أنحاء الأنسجة.
ثم ، قم بقطع شريط بعرض ثلاثة ملليمترات ، بطول تسعة ملليمترات على الأقل من الشريحة عن طريق الضغط على الطول الكامل لشفرة الحلاقة بقوة على الطبق وهزه قليلا من جانب إلى آخر. لقص شريط الأنسجة في الكاسيت ، قم بتعويمه فوق الكاسيت ، مع توسيطه بعناية ليمتد إلى ما وراء الثقوب الموجودة في المشابك في كلا الطرفين. ضع علامة تبويب جزئيا في الحفرة في أحد طرفيها باستخدام ملقط ناعم ، وقم بتصويب الأنسجة بلطف ، واضبط علامة التبويب الثانية.
أخيرا ، استخدم الملقط للضغط على كل علامة تبويب بالكامل لتأمين الأنسجة. بعد قص جميع الجوانب ، انقل الطبق الذي يبلغ طوله 100 ملم والذي يحتوي على أشرطة الكاسيت إلى غطاء تدفق صفائحي. انقل الكاسيت إلى ألواح من ستة آبار تحتوي على أول حل لإزالة الخلايا باستخدام مرقئ منحني للإمساك بالجوانب المحززة.
ثم ضع الصفيحة المكونة من ستة آبار على شاكر مداري عند 30 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. استنشق السائل من كل بئر ، ثم استبدله بثلاثة ملليلترات من محلول إزالة الخلايا الثاني لكل بئر. ضع الصفيحة على شاكر مداري عند 30 دورة في الدقيقة واحتضنها لمدة خمس دقائق.
كرر هذه العملية مع كل حل كما هو موضح في بروتوكول إزالة الخلايا في المخطوطة. بعد الشطف النهائي باستخدام PBS ، قم بنقل الأنسجة إلى ألواح معقمة من ستة آبار تحتوي على PBS طازج مع المضادات الحيوية ومضادات الفطريات واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. بعد التعقيم بالمضادات الحيوية ومضادات الفطريات ، يمكن زرع سقالات أنسجة الرئة على الفور أو تخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى 30 يوما.
قبل استخدامها للزراعة ، احتضن السقالات المخزنة عند أربع درجات مئوية مع PBS الطازجة والمضادات الحيوية ومضادات الفطريات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية كخطوة تعقيم إضافية. ثم ، شطف السقالات مع PBS معقمة ، خمسة ملليلتر لكل بئر ، ثلاث مرات ، لمدة خمس دقائق لكل منهما. افحص السقالات تحت مجهر تباين الطور عند تكبير 5X لاختيار الأنسجة للبذر.
تحضير تعليق الخلايا البطانية في الوسط البطاني عند 5 ملايين خلية لكل ملليلتر مع خلايا كافية لزرع 500،000 خلية بطانية لكل شريحة. ضع حمامات البذر المعقمة في أطباق بتري 100 ملم وانقل سقالات الشطف بعناية رأسا على عقب إلى حمامات البذر. قم بتدوير تعليق الخلية المحضر بلطف للخلط.
ثم ، ماصة بعناية 100 ميكرولتر من الخلايا مباشرة فوق كل نسيج في قاعدة الآبار ، مع الحرص على عدم إتلاف الأنسجة بطرف الماصة. نقل الأنسجة البذرية إلى حاضنة زراعة الخلايا. بعد 24 ساعة من بذر الخلايا البطانية ، أضف 900 ميكرولتر من وسط الثقافة المسخن مسبقا إلى كل بئر باستخدام ماصة يدوية ، ثم أعد اللوحة إلى الحاضنة.
بعد 24 ساعة من بذر الخلايا ، قم بإزالة الوسط واستبدل ملليلتر واحد من الوسط البطاني الطازج لكل بئر. بعد 72 ساعة من بذر الخلايا البطانية ، عد AEC2s ، أو الخلايا الظهارية السنخية من النوع الثاني ، والخلايا الليفية باستخدام مقياس الدم وإعداد تعليق خلية 1: 1 في وسط نمو AEC2 عند 5 ملايين خلية لكل ملليلتر. ماصة الوسط من كل حمام البذر جيدا وتدور بلطف تعليق الخلية المعدة.
ماصة 100 ميكرولتر من الخلايا مباشرة فوق كل نسيج في قاعدة البئر. نقل الأنسجة البذرية إلى حاضنة زراعة الخلايا. بعد ساعتين ، أضف 900 ميكرولتر من وسط نمو AEC2 المسخن مسبقا إلى كل بئر ، ثم أعد اللوحة إلى الحاضنة.
بعد 24 ساعة من الزراعة باستخدام AEC2s والخلايا الليفية ، قم بإعداد صفيحة من 12 بئرا مع ملليلتر واحد من متوسط نمو AEC2 المسخن مسبقا لكل بئر ، لكل كاسيت. ماصة 800 ميكرولتر من الوسط من كل بئر من حمام البذر ، ثم قم بإزالة الكاسيت من حمام البذر ونقلها إلى الجانب الأيمن إلى اللوحة المعدة المكونة من 12 بئرا ، كاسيت واحد لكل بئر. قم بتغيير وسط الثقافة بعناية باستخدام ماصة باستور الزجاجية كل يومين لمدة الثقافة المطلوبة.
راقب درجة إعادة توطين الأنسجة عبر الفحص المجهري لتباين الطور عند تكبير 5X طوال مدة الزرع. أظهر تلطيخ H و E لسقالات الأنسجة بنية سنخية محفوظة بعد إزالة الخلايا مع عدم وجود نوى خلية مرئية. لوحظت الأنسجة السنخية عندما شوهدت سقالات المصفوفة خارج الخلية المنزوعة الخلايا عند تكبير 5X بواسطة الفحص المجهري لتباين الطور.
كانت الممرات الهوائية والسفن المتفرعة الكبيرة مرئية أيضا في بعض الشرائح. في اليوم السابع من الثقافة، أظهر الفحص المجهري لتباين المرحلة أن نمط إعادة التوطين في أنسجة الرئة المهندسة يحاكي البنية السنخية للأنسجة في حالات إعادة التوطين الناجحة. وكان ضعف إعادة التجميع واضحا أيضا.
أظهر تلطيخ H و E في اليوم السابع أو الثامن إعادة توطين الحاجز السنخي. كشفت مكانة التألق المناعي عن الخلايا الليفية الإيجابية من النوع الأول من الكولاجين ألفا 1 ، و AEC2s الإيجابية ABCA3 ، والخلايا البطانية الإيجابية CD31 ، و AEC2s الإيجابية SPB الوفيرة. علاوة على ذلك ، أظهر فحص الثيميدين العديد من AEC2s المنتشرة.
وقد سهلت هذه التقنية تطوير استراتيجيات لهندسة أنسجة الرئة ومكنت من إجراء تحقيقات في قوائم الانتظار التي تدعم تكاثر الخلايا من النوع الثاني والتمايز داخل الأسناخ.
