وقدمنا iSCAT لأول مرة في عام 2004 في سياق الكشف عن الطيف من الجسيمات النانوية الذهب. في السنوات العشر التي تلت ذلك قمنا بتطوير هذه التقنية للكشف عن وتتبع الجسيمات النانوية البيولوجية مثل الفيروسات والبروتينات الصغيرة. جوهر هذه التقنية هو أن أي كائن مادي ، مهما كان صغيرا ، لديه مقطع عرضية للانقراض محدود.
والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الكشف عن التسمية خالية. وهذا يعني أنه إذا كنا حساسين بما فيه الكفاية، يمكننا اكتشاف أي شيء تقريبا، مثل البروتينات أو الكوسومات التي تفرز من خلايا مفردة. المسألة التي يجب على المرء أن يكون حذرا حول كيفية التعامل مع خلفية مبعثر.
ميزة كبيرة من المجهر iSCAT هو أنه يمكن أن يكون المنزل بنيت تماما ويمكن إضافتها إلى المجهر التجاري القائم. وهذا يعني أنه يمكن دمجها بسهولة مع التقنيات البصرية الأخرى ، مثل الفلوريسنس ، وهذا هو أحد الأسباب التي تجعل العديد من المجموعات تستخدم الآن iSCAT والتقنيات ذات الصلة. هنا نستخدم خلايا LUZ كنظام نموذجي لإظهار الكشف عن البروتينات الفردية والإفرازية.
ومع ذلك، يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على التحقيق في أي عملية بيولوجية تقريباً على المستوى الجزيئي. لتحقيق مجهر مستقر، تبدأ مع جدول بصرية مبللة وكتلة ضخمة جامدة لمرحلة العينة. بناء مرحلة عينة المجهر التي تتضمن هدفا الفتحة الرقمية عالية ووحدة الترجمة التي تسمح للترجمة العينة الجانبي فضلا عن تغيير موقف التركيز للهدف.
استخدام مرآة اقتران عمودي 45 درجة و 50 سنتيمترا عدسة أحادية البعد البؤري لتركيز ضوء ليزر ثنائي في الطول الموجي 445 نانومتر على الطائرة البؤرية الخلفية للهدف. هذه العدسة مجال واسع يخلق شعاع كومبينت في التركيز على الهدف إلى الأمام، والتي سوف تصبح مصدر الإضاءة iSCAT. تطبيق قطرة من زيت الغمر على الهدف ووضع غطاء زجاجي في الطائرة عينة من مرحلة المجهر.
وهذا سيؤدي إلى شعاع يعكس التراجع من خلال الهدف التصوير. لإعداد مسار التصوير، أدخل شعاعًا مغلفًا مضادًا للانعكاسات بزاوية 45 درجة نسبيًا لشعاع الحادث وحوالي 10 سنتيمترات بعد عدسة الحقل الواسعة. تأكد من أن طلاء المضادة للانعكاسات يشير نحو مصدر الليزر.
إيلاء الاهتمام كما سوف beamsplitter سميكة إدخال تشريد شعاع كبير بحيث الليزر قد لا تدخل الهدف على التوالي بعد الآن. إذا لزم الأمر، قم بإعادة تنظيم مسار شعاع الليزر قبل الحزمة لضمان الانتشار الصحيح من خلال الهدف. لضمان أن الطائرة عينة والكاميرا هي parfocal، تبدأ من خلال وضع عدسة مقعرة مع طول بؤري سلبي من 45 سم في موقف خمسة سنتيمترات بعد عدسة حقل واسع في مسار شعاع الحادث.
وهذا سيؤدي إلى شعاع كُرّم يدخل الفتحة الخلفية للهدف. مع وضع الشاشة في الذراع العاكسة لمقياس التداخل، حرك الهدف في الاتجاه الرأسي للعثور على موضع التنسيق الخشن. والهدف هو في التركيز عندما يتم collimated شعاع ضرب الشاشة.
إزالة كل من عدسة طول البؤر السلبية والشاشة عند الانتهاء من التركيز الخشن. أضف ثانية 50 سم البؤري طول عدسة مفردة لتركيز الضوء المتناثرة collimate الضوء المنعك. تأكد من وضع العدسة على بعد 50 سنتيمترًا من الطائرة البؤرية الخلفية للهدف بحيث يتم تجميع شعاع الليزر المُرسل مرة أخرى.
لإكمال تجميع إعداد iSCAT، ضع كاميرا CMOS على بعد 50 سنتيمترًا من عدسة الطول البؤري التي تبلغ 50 سنتيمترًا، ثم ضع الشعاع مباشرةً في منتصف الشريحة. لإعداد قنوات تصوير إضافية، زوجين إخراج مصدر ضوء LED إلى هدف مسافة العمل الطويل. تثبيت المكونات الميكانيكية فوق غرفة العينة التي تسمح للتركيز وتحديد المواقع الجانبي من الناتج الصمام على العينة.
نقل الهدف العلوي من الناحية الجانبية بحيث هدف حقل واسع العلوي والهدف iSCAT أقل هي colinear. يتم تحديد هذا عن طريق وضع شاشة تحت الهدف السفلي وتعظيم كثافة الضوء الصمام المرسلة على الشاشة. الآن، ضع مرآة قصيرة 550 نانومتر قصيرة لتقسيم ضوء LED المنقولة من مسار الليزر iSCAT.
تقسيم هذا الشعاع إلى قناتين مع ثمانية في المئة عاكسة، 92 في المئة العابرة، beamsplitter. المسار 92 بالمائة هو قناة الفلوريسنس، ويتم استخدام مسار ثمانية بالمائة للتصوير في الحقول الساطعة. صورة قناة brightfield على كاميرا CMOS باستخدام عدسة طول بؤري خمسة سنتيمترات مزدوجة اللونية.
صورة قناة الفلوريسنس على كاميرا CMOS منفصلة باستخدام عدسة طول بؤري خمسة سنتيمترات مزدوجة. أيضا، استخدام 600 نانومتر longpass مرشح لمنع ضوء الإثارة. لإعداد الكمبيوتر والبرامج، قم بتوصيل كافة الكاميرات بالكمبيوتر.
على الإعداد تجميعها بالكامل، مراقبة صورة iSCAT على كاميرا CMOS والتأكد من أنها في التركيز من خلال العثور على الغبار المتبقية أو الجسيمات الترابية على غطاء الزجاج. تحقق من أن صورة الجسيم هي وظيفة انتشار نقطة متماثلة بشكل دائري. لن يكون لمهمة نقطة الانتشار شكل دائري إذا دخل شعاع الليزر إلى هدف المجهر بزاوية طفيفة.
ويمكن تصحيح هذا عن طريق تعديل طفيف من مرآة 45 درجة لضمان اقتران مستقيم في الهدف. قارن صور الكاميرا من brightfield وقنوات التألق. تأكد من أن كليهما في التركيز، وعرض نفس المنطقة عن طريق تصوير عينة من الخرز أو الخلية الفلورية.
تحقق من أن موضع الليزر iSCAT هو تقريبا في وسط الصورة، وأخذ علما من موقعها للرجوع إليها لاحقا. لتغيير موضع ومجال الرؤية في الحقل الساطع وقناة الفلورس، قم بتحريك الكاميرات على الطاولة فيما يتعلق بعدسات التركيز. التحضير للتجربة كما هو مفصل في بروتوكول النص.
وهذا يشمل إعداد الخلايا والمجهر المتوسط، فضلا عن cuvette عينة المجهر. تأكد من حظر شعاع الليزر لمنع تعرض الخلايا مباشرة لضوء الليزر iSCAT. حقن ما يقرب من ثلاثة ميكرولترات من عينة الخلية المعدة قليلا قبالة مركز في cuvette عينة.
لمس بلطف تلميح ماصة إلى غطاء وحقن ببطء حل الخلية. السماح للخلايا لتسوية على غطاء. تحقق من عدد الخلايا القريبة من ليزر iSCAT.
إذا كان عدد الخلايا منخفض جداً، كرر هذه الخطوة حتى يتوفر عدد كاف. إذا كانت تغطية الخلايا كثيفة جدا، استخدم حقن ما يقرب من 20 ميكرولترات من المجهر المتوسط إضافية لتفريق الخلايا عبر الغطاء. باستخدام مرحلة الترجمة الكهروضوئية، قم بتحريك العينة بشكلٍ عرضي لوضع خلية قريبة من مجال الرؤية.
تأكد من أن الخلية لا تدخل مجال iSCAT للعرض كتعرض مباشر للضوء الليزر 445 نانومتر قد تكون ضارة للخلية. فك حظر شعاع الليزر iSCAT والتأكد من أن سطح الغطاء لا يزال في التركيز. ضع طاولة العزل لتقليل الانجراف والاقتران الصوتي من المناطق المحيطة.
ابدأ القياس من خلال الحصول على صور من كاميرات iSCAT و Brightfield و fluorescence. التحقق دوريا من صلاحية الخلية والتركيز على النظام. هنا، يتم استخدام برنامج المجهر الذاتي مكتوب لعرض صور الكاميرا.
هنا، يتم تنفيذ التصوير التفاضلي في الوقت الحقيقي عن طريق طرح إطارات متتالية لجعل ربطات البروتين مرئية. ينتج عن ذلك صورة تمت تصفيتها مرئية على الشاشة مع صورة الكاميرا الخام. تظهر هنا النتائج التمثيلية لتجربة إفراز خلوي نفذت مع iSCAT.
يُظهر الفيديو إفرازات لخلية LAZ على مدى دقيقتين. صور iSCAT التفاضلي على اليسار تصور امتصاص البروتينات واحدة إلى الغطاء. وتستخدم الصور brightfield وقناة الفلوريسنس على اليمين لرصد صلاحية الخلية.
يُظهر هذا الرسم البياني البروتينات المكتشفة ونطاق تباينها خلال فترة زمنية دقيقة. تم جمع البيانات من خلال تحليل أحداث الربط الفردية في كل إطار من بيانات الفيديو iSCAT باستخدام خوارزمية بحث ذروة مخصصة. المجهر ISCAT ليس فقط أداة قوية في الاستشعار الحيوي، ولكن أيضا في المجهر، لأنه يسمح للكشف خالية من التسمية من الكائنات النانوية في الوقت الحقيقي.
ويمكن تطبيقها على وجه الخصوص على مجموعة متنوعة من العمليات مثل نشر ونقل البروتينات. نظرا لحساسية رائعة لتناثر الضوء، يمكن أن iSCAT الكشف عن أي بروتين أو كيان في مجال الرؤية. بالطبع ، وهذا يعني أيضا أن هذه التقنية تفتقر إلى خصوصية أن fluorescence يجلب على طول ، ولكن للالتفاف على هذه المسألة ، يمكن للمرء تطبيق أساليب إضافية مثل وظائفية السطح للكشف عن بروتينات محددة من الفائدة.
لا تنس أن العمل مع الليزر يمكن أن يكون خطيرا، وينبغي دائما أن تكون مناسبة لحماية العين يرتديها عند تجميع وضبط المجهر. الكشف في الوقت الحقيقي من secretomeomes مثيرة للغاية وقفزة كبيرة في التشخيص الطبي، والتي تتطلب حاليا وقتا أطول بكثير وبعيد جدا عن حساسية البروتين واحد. لا يزال هناك الكثير من المجال لتحسين أداء الأسلوب وتوسيع تطبيقاتها.
لذلك نأمل أن يساعد هذا الفيديو مجموعات أخرى على الانضمام إلى هذا الجهد المثير.
