우리는 2004년에 금 나노 입자의 검출 및 분광법의 맥락에서 iSCAT를 처음 발표했습니다. 그 후 10 년 동안 우리는 바이러스및 작은 단백질과 같은 생물학적 나노 입자를 검출하고 추적하기 위한 이 기술을 더 개발했습니다. 이 기술의 본질은 아무리 작은 재료 물체가 유한한 소멸 단면을 가지고 있다는 것입니다.
이 기술의 주요 장점은 라벨이 없는 검출입니다. 이것은 우리가 충분히 과민하다면, 우리는 단 하나 세포에서 분비되는 단백질 또는 엑소좀 같이 다만 무엇이든을 검출할 수 있다는 것을 의미합니다. 주의해야 할 문제는 산란 배경을 치료하는 방법입니다.
iSCAT 현미경의 큰 장점은 완전히 가정 이 될 수 있으며 기존의 상용 현미경에 추가 할 수 있다는 것입니다. 이는 형광과 같은 다른 광학 기술과 쉽게 결합될 수 있다는 것을 의미하며, 이것은 많은 그룹이 현재 iSCAT 및 관련 기술을 사용하는 이유 중 하나입니다. 여기서 우리는 LUZ 세포를 개별 및 분비 단백질의 검출을 보여주기 위하여 모형 시스템으로 이용합니다.
그러나, 이 방법은 또한 분자 수준에서 거의 모든 생물학적 과정을 탐사하기 위하여 적용될 수 있다. 안정적인 현미경을 달성하기 위해, 축축한 광학 테이블과 샘플 단계에 대한 견고한 대규모 블록으로 시작합니다. 높은 수치 조리개 목표와 측면 샘플 번역뿐만 아니라 목표에 대한 초점 위치의 변경을 허용하는 번역 단위를 통합현미경 샘플 단계를 구축합니다.
45도 수직 커플링 미러와 50센티미터 초점 길이 단일 렌즈를 사용하여 파장 445 나노미터에서 다이오드 레이저의 빛을 목표의 뒤쪽 초점 평면에 집중시합니다. 이 넓은 필드 렌즈는 목표의 전방 초점에서 정렬된 빔을 생성하며, 이는 iSCAT 조명 소스가 됩니다. 목표에 침수 오일의 액적을 적용하고 현미경 단계의 샘플 평면에 유리 커버 슬립을 배치합니다.
이렇게 하면 이미징 목표를 통해 다시 반사되는 빔이 생성됩니다. 이미징 경로를 설정하려면 사고 빔에 비해 45도 각도로 반사 방지 코팅 빔스플리터를 도입하고 광야 렌즈 후 약 10cm를 소개합니다. 반사 방지 코팅이 레이저 소스를 향해 가리키는지 확인합니다.
두꺼운 빔 스플리터가 레이저가 더 이상 목표를 바로 입력하지 않도록 상당한 빔 변위를 도입할 때주의를 기울이게 됩니다. 필요한 경우 빔스플리터 앞에 레이저 빔 경로를 다시 정렬하여 목표를 통해 올바른 전파를 보장합니다. 샘플 평면과 카메라가 파초점인지 확인하려면 입사 빔 경로에서 와이드 필드 렌즈 후 5센티미터 의 위치에 45cm의 음수 초점 길이가 있는 오목렌즈를 배치하여 시작합니다.
이렇게 하면 정렬된 빔이 목표의 뒷구에 들어갑니다. 스크린이 간섭계의 반사 암에 배치되면 목표를 수직 방향으로 이동하여 거친 초점 위치를 찾습니다. 화면에 닿는 빔이 정렬될 때 초점이 맞춰져 있습니다.
거친 초점 초점이 완료되면 음의 초점 길이 렌즈와 화면을 모두 제거합니다. 두 번째 50센티미터 초점 길이 싱글 렌즈를 추가하여 산란된 빛을 집중하고 반사된 빛을 정렬합니다. 렌즈가 목표의 뒤쪽 초점 평면에서 50cm 떨어져 전달된 레이저 빔을 다시 정렬하도록 하십시오.
iSCAT 설정 어셈블리를 완료하려면 CMOS 카메라를 50센티미터 초점 길이 렌즈에서 50센티미터 떨어진 곳에 배치하고 빔을 칩 중앙에 직접 배치합니다. 추가 이미징 채널을 설정하려면 LED 광원의 출력을 장거리 작업 거리 목표에 결합합니다. 샘플 챔버 위에 기계 부품을 설치하여 LED 출력의 초점 배치 및 측면 위치를 샘플에 배치할 수 있습니다.
상위 목표를 측면으로 이동하여 상위 와이드 필드 목표와 낮은 iSCAT 목표가 공존할 수 있도록 합니다. 이는 화면을 낮은 목표 아래에 배치하고 화면에 전송된 LED 라이트의 강도를 최대화하여 결정됩니다. 이제 550나노미터 의 단락 이색 거울을 배치하여 iSCAT 레이저 경로에서 전달된 LED 라이트를 분할한다.
이 빔을 반사 8%, 92%의 변환형 빔스플리터로 두 개의 채널로 분할합니다. 92%의 경로는 형광 채널이며, 8%의 경로는 브라이트필드 이미징에 사용됩니다. 5센티미터 초점 길이 achromatic doublet 렌즈를 사용하여 밝은 필드 채널을 CMOS 카메라에 이미지합니다.
5센티미터 초점 길이 achromatic doublet 렌즈를 사용하여 별도의 CMOS 카메라에 형광 채널을 이미지합니다. 또한 600나노미터 의 롱패스 필터를 사용하여 흥분광을 차단합니다. 컴퓨터와 소프트웨어를 설정하려면 모든 카메라를 컴퓨터에 연결합니다.
완전히 조립된 설정에서 CMOS 카메라의 iSCAT 이미지를 관찰하고 유리 커버슬립에 잔류 먼지 나 먼지 입자를 찾아 초점을 맞춥니다. 파티클의 이미지가 원형 대칭 점 스프레드 함수인지 확인합니다. 레이저 빔이 현미경 목표에 약간의 각도로 진입하면 포인트 확산 함수는 원형 형상을 갖지 않습니다.
이것은 목표에 직선 결합을 보장하기 위해 45도 미러의 약간의 조정에 의해 수정 될 수있다. 밝은 필드와 형광 채널의 카메라 이미지를 비교합니다. 둘 다 초점을 맞추고 있는지 확인하고 형광 비드 또는 세포 샘플을 이미징하여 동일한 영역을 표시하십시오.
iSCAT 레이저의 위치가 이미지의 중심에 대략 있는지 확인하고 나중에 참조할 위치를 기록합니다. 밝은 필드와 형광 채널의 위치와 시야를 변경하려면 초점 렌즈와 관련하여 테이블에 카메라를 이동합니다. 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 실험을 준비합니다.
여기에는 세포 및 현미경 배지뿐만 아니라 현미경 샘플 큐벳의 준비가 포함됩니다. 레이저 빔이 차단되어 세포가 iSCAT 레이저 광에 직접 노출되는 것을 방지합니다. 준비된 세포 샘플의 약 3마이크로리터를 약간 떨어져 시료 큐벳에 주입한다.
파이펫 팁을 커버슬립에 부드럽게 터치하고 셀 용액을 천천히 주입합니다. 세포가 덮개 슬립에 정착하도록 허용합니다. iSCAT 레이저에 가까운 셀 수를 확인합니다.
셀 수가 너무 적으면 충분한 수를 사용할 수 있습니다 때까지 이 단계를 반복합니다. 세포의 엄호가 너무 조밀한 경우에, 커버슬립을 가로질러 세포를 분산시키기 위하여 추가 현미경 배지의 대략 20의 마이크로리터의 주입을 이용하십시오. 압전 번역 단계를 사용하여 샘플을 측면으로 이동하여 iSCAT 시야에 가까운 셀을 배치합니다.
445 나노미터 레이저 광에 직접 노출되어 세포에 유해할 수 있기 때문에 세포가 iSCAT 시야에 들어가지 않도록 하십시오. iSCAT 레이저 빔의 차단을 해제하고 커버슬립 표면이 여전히 초점에 있는지 확인합니다. 격리 테이블을 둘러싸서 주변 환경의 드리프트 및 음향 커플링을 최소화합니다.
iSCAT, 브라이트필드 및 형광 카메라에서 이미지를 획득하여 측정을 시작합니다. 주기적으로 셀의 생존가능성과 시스템의 초점을 확인합니다. 여기서, 자체 작성된 현미경 소프트웨어는 카메라 이미지를 표시하는 데 사용됩니다.
여기서, 차동 화상 진찰은 단백질 결합을 가시화하기 위하여 연속적인 프레임의 빼기에 의해 실시간으로 수행됩니다. 이렇게 하면 원시 카메라 이미지와 함께 화면에 표시되는 필터링된 이미지가 생성됩니다. iSCAT로 수행된 세포 분비 실험의 대표적인 결과가 여기에 나와 있다.
비디오는 2 분 동안 LAZ 셀의 분비를 보여줍니다. 왼쪽의 차동 iSCAT 이미지는 단일 단백질의 흡수를 커버글래스에 시각화합니다. 오른쪽의 밝은 필드 이미지와 형광 채널은 세포 생존 가능성을 모니터링하는 데 사용됩니다.
이 히스토그램은 2분 의 시간 내에 검출된 단백질과 대비 범위를 보여줍니다. 데이터는 사용자 지정 피크 추구 알고리즘을 사용하여 iSCAT 비디오 데이터의 각 프레임에서 개별 바인딩 이벤트를 분석하여 수집되었습니다. ISCAT 현미경 검사는 생체 감지뿐만 아니라 현미경 검사법에서도 나노 물체의 라벨없는 검출을 실시간으로 허용하기 때문에 강력한 도구입니다.
특히, 단백질의 확산 및 수송과 같은 다양한 공정에 적용될 수 있다. 빛 산란에 대한 절묘한 감도로 인해 iSCAT은 시야에서 어떤 단백질이나 실체도 감지할 수 있습니다. 물론, 이것은 또한 기술이 형광이 가져오는 특이성이 부족하다는 것을 의미합니다, 그러나 이 문제점을 극복하기 위하여, 하나는 관심있는 특정 단백질을 검출하기 위하여 표면 기능화와 같은 추가적인 방법을 적용할 수 있습니다.
레이저로 작업하는 것은 위험할 수 있으며 현미경을 조립하고 조정할 때 적절한 눈 보호가 항상 착용되어야한다는 것을 잊지 마십시오. 분비의 실시간 검출은 매우 흥미 진진하고 현재 훨씬 더 긴 시간을 필요로하고 단일 단백질 감도에서 매우 멀리 의료 진단의 주요 도약이다. 메서드의 성능을 개선하고 응용 프로그램을 확장할 수 있는 충분한 여지가 여전히 있습니다.
그래서 우리는이 비디오가 다른 그룹이 흥미 진진한 노력에 참여하는 데 도움이되기를 바랍니다.
