הצגנו לראשונה iSCAT בשנת 2004 בהקשר של זיהוי וספקטרוסקופיה של חלקיקי זהב. ב-10 השנים שלאחר מכן פיתחנו טכניקה זו לגילוי ומעקב אחר חלקיקים ביולוגיים כמו וירוסים וחלבונים קטנים. מהות הטכניקה היא שלאובייקט חומרי כלשהו, לא משנה כמה קטן, יש חתך סופי של הכחדה.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא זיהוי ללא תווית. זה אומר שאם אנחנו רגישים מספיק, אנחנו יכולים לזהות כמעט כל דבר, כמו חלבונים או אקסוזומים המופרשים מתאים בודדים. הנושא שאנחנו צריכים להיות זהירים לגבי הוא איך לטפל ברקע פיזור.
יתרון גדול של מיקרוסקופ iSCAT הוא שזה יכול להיות בנוי לחלוטין הביתה וזה יכול להתווסף מיקרוסקופ מסחרי קיים. משמעות הדבר היא כי ניתן לשלב אותו בקלות עם טכניקות אופטיות אחרות, כגון פלואורסצנטיות, וזו אחת הסיבות כי קבוצות רבות גם עכשיו מעסיקים iSCAT וטכניקות קשורות. כאן אנו משתמשים בתאי LUZ כמערכת מודל כדי להראות את הגילוי של חלבונים בודדים הפרשה.
עם זאת, שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם כדי לחקור כמעט כל תהליך ביולוגי ברמה המולקולרית. כדי להשיג מיקרוסקופ יציב, התחל עם שולחן אופטי מעומעם ובלוק מסיבי נוקשה לשלב המדגם. לבנות שלב מדגם מיקרוסקופ המשלב מטרה צמצם מספרי גבוה יחידת תרגום המאפשר תרגום מדגם משני, כמו גם שינוי מיקום המיקוד עבור המטרה.
השתמש במראה צימוד אנכית של 45 מעלות ובעדשת יחיד באורך מוקד של 50 ס"מ כדי למקד את האור של לייזר דיודה באורך גל של 445 ננומטר אל מישור המוקד האחורי של המטרה. עדשת שדה רחבה זו יוצרת קרן איסוף בפוקוס הקדמי של המטרה, שתהפוך למקור התאורה של iSCAT. החל טיפה של שמן טבילה על המטרה ולהחיל כיסוי זכוכית במישור מדגם של שלב המיקרוסקופ.
התוצאה תהיה קרן המשקפת חזרה למטה דרך מטרת ההדמיה. כדי להגדיר את נתיב ההדמיה, הציגו קרן מצופה נגד השתקפות בזווית של 45 מעלות ביחס לקרן האירוע וכ-10 ס"מ לאחר עדשת השדה הרחבה. ודא כי הציפוי נגד השתקפות מצביע לכיוון מקור הלייזר.
שים לב כמו beamsplitter עבה יציג תזוזה משמעותית קרן, כך הלייזר לא יכול להיכנס המטרה ישר יותר. במידת הצורך, יישר מחדש את נתיב קרן הלייזר לפני הקרן כדי להבטיח את ההפצה הנכונה דרך המטרה. כדי להבטיח כי המטוס המדגם והמצלמה הם parfocal, להתחיל על ידי הצבת עדשה קעורה עם אורך מוקד שלילי של 45 ס"מ בעמדה חמישה סנטימטרים לאחר עדשת השדה הרחב בנתיב קרן האירוע.
זה יגרום קרן איסוף נכנס הצמצם האחורי של המטרה. כאשר המסך ממוקם בזרוע המחזירנית של האינטרפרומטר, הזז את המטרה בכיוון האנכי כדי למצוא את מיקום המוקד גס. המטרה היא בפוקוס כאשר הקרן להכות את המסך הוא איסוף.
הסר הן את עדשת אורך המוקד השלילי והן את המסך כאשר השלמת התמקדות גסה. הוסף עדשה שנייה באורך מוקד של 50 ס"מ כדי למקד את האור המפוזר ולאסוף את האור המוחזר. ודא כי העדשה ממוקמת 50 ס"מ ממישור המוקד האחורי של המטרה, כך קרן הלייזר המשודרת נאסף שוב.
כדי להשלים את מכלול ההתקנה של iSCAT, הנח את מצלמת ה- CMOS במרחק של 50 ס"מ מהעדשה באורך המוקד של 50 ס"מ, והצב את הקרן ישירות במרכז השבב. כדי להקים ערוצי הדמיה נוספים, חבר את הפלט של מקור אור LED למטרה למרחק עבודה ארוך. התקן רכיבים מכניים מעל תא המדגם המאפשרים התמקדות ומיקום לאורך של פלט LED על המדגם.
הזז את המטרה העליונה לרוחב כך שמטרת השדה הרחב העליון והמטרה iSCAT התחתונה הם colinear. זה נקבע על ידי הצבת מסך תחת המטרה התחתונה ומקסום עוצמת אור LED משודר על המסך. עכשיו, למקם מראה dichroic 550 ננומטר קצר כדי לפצל את אור LED משודרת משביל לייזר iSCAT.
לפצל את הקרן לשני ערוצים עם 8 אחוז רפלקטיבי, 92 אחוז טרנסמיסיבי, beamsplitter. הנתיב של 92 אחוזים הוא ערוץ הפלואורסצנטיות, והנתיב בן שמונה האחוזים משמש להדמיית שדה בהיר. צלם את ערוץ השדה הבהיר במצלמת CMOS באמצעות עדשת כפולה אקהומטית באורך 5 ס"מ.
צלם את ערוץ הפלואורסצנטיות במצלמת CMOS נפרדת באמצעות עדשת כפולה אקהומטית באורך 5 ס"מ. כמו כן, השתמש במסנן longpass 600 ננומטר כדי לחסום את אור העירור. כדי להגדיר את המחשב והתוכנה, חבר את כל המצלמות למחשב.
על ההתקנה שהורכבה במלואה, התבונן בתדמית iSCAT במצלמת CMOS וודא שהיא ממוקדת על ידי מציאת שאריות אבק או חלקיק עפר על מכסה הזכוכית. ודא שתדמית החלקיק היא פונקציית כפולת נקודה סימטרית מעגלית. פונקציית התפשטות הנקודה לא תהיה צורה מעגלית אם קרן הלייזר נכנסת למטרת המיקרוסקופ בזווית קלה.
זה יכול להיות מתוקן על ידי התאמה קלה של המראה 45 מעלות כדי להבטיח צימוד ישר לתוך המטרה. השווה את תמונות המצלמה של שדה האור וערוצי הפלואורסצנטיות. ודא ששניהם נמצאים בפוקוס, והצג את אותו אזור על-ידי הדמיית חרוז פלואורסצנטי או דגימת תא.
ודא כי המיקום של לייזר iSCAT הוא בערך במרכז התמונה, ושים לב למיקום שלה לעיון מאוחר יותר. כדי לשנות את המיקום ואת שדה המבט של שדה האור וערוץ הפלואורסצנטיות, הזז את המצלמות על השולחן ביחס בעדשות ההתמקדות. היכונו לניסוי כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
זה כולל הכנת התאים ומיקרוסקופיה בינונית, כמו גם את מדגם מיקרוסקופ cuvette. ודא כי קרן הלייזר חסומה כדי למנוע מהתאים להיחשף ישירות לאור הלייזר iSCAT. להזריק כשלושה microliters של דגימת התא המוכן מעט את המרכז לתוך cuvette מדגם.
גע בעדינות בקצה פיפטה לכיסוי והזריק לאט את תסכול התא. אפשר לתאים להתיישב על המכסה. בדוק את מספר התאים הקרובים ללייזר iSCAT.
אם מספר התאים נמוך מדי, חזור על שלב זה עד שמספר מספיק יהיה זמין. אם כיסוי התאים צפוף מדי, השתמש בהזרקה של כ-20 מיקרוליטרים של מדיום מיקרוסקופי נוסף כדי לפזר את התאים על פני הכיסוי. באמצעות שלב התרגום הפיזואלקטרי, הזז את הדגימה באופן עוצב כדי למקם תא קרוב לשדה התצוגה של iSCAT.
ודא כי התא אינו נכנס לשדה התצוגה iSCAT כמו חשיפה ישירה לאור לייזר 445 ננומטר עלול להזיק לתא. בטלו את החסימה של קרן הלייזר iSCAT והבטיחו כי משטח הכיסוי עדיין בפוקוס. הקיפו את שולחן הבידוד כדי למזער את הסחף ואת הצימוד האקוסטי מסביבת הסביבה.
התחל את המדידה על-ידי רכישת תמונות ממצלמות iSCAT, שדה בהיר ונוהורסצנטי. בדוק מעת לעת את הכדאיות של התא ואת מוקד המערכת. כאן, תוכנת מיקרוסקופ עצמית משמשת להצגת תמונות המצלמה.
כאן, הדמיה דיפרנציאלית מתבצעת בזמן אמת על ידי חיסור של מסגרות רצופות כדי להפוך את כריכות החלבון גלוי. התוצאה היא תמונה מסוננת הגלויה על המסך יחד עם תמונת המצלמה הגולמית. תוצאות מייצגות של ניסוי הפרשה סלולרית שבוצע עם iSCAT מוצגות כאן.
הסרטון מראה הפרשות של תא LAZ במהלך שתי דקות. תמונות iSCAT דיפרנציאליות משמאל מדמיינות את ספיגת החלבונים הבודדים בכיסוי. תמונות השדה הבהיר וערוץ הפלואורסצנטיות מימין משמשים לניטור הכדאיות של התאים.
היסטוגרמה זו מציגה את החלבונים שזוהו ואת טווח הניגודיות שלהם בתוך אותה תקופת זמן של שתי דקות. הנתונים נאספו על ידי ניתוח אירועי איגוד בודדים בכל מסגרת של נתוני הווידאו של iSCAT באמצעות אלגוריתם חיפוש שיא מותאם אישית. מיקרוסקופיה ISCAT הוא לא רק כלי רב עוצמה biosensing, אלא גם מיקרוסקופיה, כי זה מאפשר זיהוי ללא תווית של ננו עצמים בזמן אמת.
בפרט, זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של תהליכים כגון דיפוזיה והובלה של חלבונים. בשל רגישותו המעודנת פיזור אור, iSCAT יכול לזהות כל חלבון או ישות בתחום הנוף. כמובן, זה גם אומר כי הטכניקה חסרה את הספציפיות כי פלואורסצנטיות מביא יחד, אבל כדי לקבל סביב בעיה זו, אפשר ליישם שיטות נוספות כמו פונקציונליזציה פני השטח כדי לזהות חלבונים ספציפיים של עניין.
אל תשכח כי עבודה עם לייזרים יכול להיות מסוכן, והגנה על העיניים המתאים תמיד צריך להיות משוחק בעת הרכבת והתאמת המיקרוסקופ. גילוי בזמן אמת של secretomes הוא מרגש מאוד קפיצה משמעותית באבחון רפואי, אשר כיום דורש זמן רב יותר והוא רחוק מאוד רגישות חלבון יחיד. יש עדיין הרבה מקום לשיפור הביצועים של השיטה והארכת היישומים שלה.
אז אנחנו מקווים שהסרטון הזה עוזר לקבוצות אחרות להצטרף למאמץ המרגש הזה.
