Abbiamo presentato iSCAT per la prima volta nel 2004 nel contesto della rilevazione e spettroscopia di nanoparticelle d'oro. Nei 10 anni successivi abbiamo sviluppato ulteriormente questa tecnica per il rilevamento e il tracciamento di nanoparticelle biologiche come virus e piccole proteine. L'essenza della tecnica è che ogni oggetto materiale, non importa quanto piccolo, abbia una sezione trasversale a estinzione finita.
Il principale vantaggio di questa tecnica è il rilevamento senza etichette. Ciò significa che se siamo abbastanza sensibili, possiamo rilevare qualsiasi cosa, come proteine o esosomi secreti da singole cellule. Il problema su cui bisogna stare attenti è come trattare lo sfondo di dispersione.
Un grande vantaggio di un microscopio iSCAT è che può essere completamente costruito in casa e può essere aggiunto a un microscopio commerciale esistente. Ciò significa che può essere facilmente combinato con altre tecniche ottiche, come la fluorescenza, e questa è una delle ragioni per cui molti gruppi stanno anche impiegando iSCAT e tecniche correlate. Qui utilizziamo le cellule LUZ come sistema modello per mostrare il rilevamento di proteine individuali e secretorie.
Tuttavia, questo metodo può anche essere applicato per sondare quasi tutti i processi biologici a livello molecolare. Per ottenere un microscopio stabile, inizia con un tavolo ottico smorzato e un blocco massiccio rigido per lo stadio del campione. Costruisci uno stadio campione al microscopio che incorpora un obiettivo ad alta apertura numerica e un'unità di traduzione che consenta la traduzione laterale del campione e il cambio della posizione di messa a fuoco per l'obiettivo.
Utilizzare uno specchio di accoppiamento verticale di 45 gradi e una lente singlet di lunghezza focale di 50 centimetri per focalizzare la luce di un laser a diodi a lunghezza d'onda di 445 nanometri sul piano focale posteriore dell'obiettivo. Questa lente a campo largo crea un fascio collimato a fuoco in avanti dell'obiettivo, che diventerà la fonte di illuminazione iSCAT. Applicare una goccia di olio ad immersione sull'obiettivo e posizionare una coverlip di vetro nel piano campione dello stadio del microscopio.
Ciò si tradurrà in un fascio che si riflette di nuovo verso il basso attraverso l'obiettivo di imaging. Per impostare il percorso di imaging, introdurre un beamsplitter rivestito anti-riflessione con un angolo di 45 gradi rispetto al fascio incidente e circa 10 centimetri dopo l'obiettivo a campo largo. Assicurarsi che il rivestimento anti-riflessione punti verso la sorgente laser.
Presta attenzione poiché uno spesso beamsplitter introdurrà uno spostamento significativo del fascio in modo che il laser non possa più entrare nel rettilineo obiettivo. Se necessario, riallineare il percorso del raggio laser prima dellosplitter del fascio per garantire la corretta propagazione attraverso l'obiettivo. Per assicurarsi che il piano campione e la fotocamera siano parfocali, iniziare posizionando un obiettivo concavo con una lunghezza focale negativa di 45 centimetri in posizione cinque centimetri dopo l'obiettivo a campo largo nel percorso del fascio incidente.
Ciò si tradurrà in una trave collimata che entra nell'apertura posteriore dell'obiettivo. Con lo schermo posizionato nel braccio riflettente dell'interferometro, spostare l'obiettivo in direzione verticale per trovare la posizione focale grossolana. L'obiettivo è a fuoco quando il fascio che colpisce lo schermo viene collimato.
Rimuovere sia l'obiettivo di lunghezza focale negativa che lo schermo al termine della messa a fuoco grossolana. Aggiungere una seconda lente singlet di lunghezza focale di 50 centimetri per mettere a fuoco la luce diffusa e collimare la luce riflessa. Assicurarsi che l'obiettivo sia posizionato a 50 centimetri dal piano focale posteriore dell'obiettivo in modo che il raggio laser trasmesso sia nuovamente collimato.
Per completare l'assieme di configurazione iSCAT, posizionare la fotocamera CMOS a 50 centimetri di distanza dall'obiettivo di lunghezza focale di 50 centimetri e posizionare il fascio direttamente al centro del chip. Per impostare canali di imaging aggiuntivi, accoppiare l'uscita di una sorgente luminosa a LED in un obiettivo a lunga distanza di lavoro. Installare componenti meccanici sopra la camera campione che consentono la messa a fuoco e il posizionamento laterale dell'uscita LED sul campione.
Spostare lateralmente l'obiettivo superiore in modo che l'obiettivo del campo largo superiore e l'obiettivo iSCAT inferiore siano colineari. Ciò viene determinato posizionando uno schermo sotto l'obiettivo inferiore e massimizzando l'intensità della luce LED trasmessa sullo schermo. Ora, posizionare uno specchio dicroico shortpass di 550 nanometri per dividere la luce LED trasmessa dal percorso laser iSCAT.
Dividi questo fascio in due canali con un otto per cento riflettente, il 92 per cento trasmissivo, beamsplitter. Il percorso del 92% è il canale di fluorescenza, e il percorso dell'otto per cento viene utilizzato per l'imaging a campi luminosi. Immagine del canale brightfield su una fotocamera CMOS utilizzando un obiettivo a doppiotto acromatico di lunghezza focale di cinque centimetri.
Immagine del canale di fluorescenza su una fotocamera CMOS separata utilizzando un obiettivo a doppiotto cromatico di lunghezza focale di cinque centimetri. Inoltre, utilizzare un filtro longpass di 600 nanometri per bloccare la luce di eccitazione. Per configurare il computer e il software, collegare tutte le telecamere a un computer.
Sulla configurazione completamente assemblata, osservare l'immagine iSCAT sulla fotocamera CMOS e assicurarsi che sia a fuoco trovando una polvere residua o una particella di sporco sul coperchio del vetro. Verificate che l'immagine della particella sia una funzione di diffusione del punto simmetrica circolare. La funzione di diffusione del punto non avrà una forma circolare se il raggio laser entra nell'obiettivo del microscopio con un leggero angolo.
Questo può essere corretto con una leggera regolazione dello specchio di 45 gradi per garantire un accoppiamento dritto nell'obiettivo. Confrontare le immagini della fotocamera del campo luminoso e i canali di fluorescenza. Assicurarsi che entrambi siano a fuoco e visualizzare la stessa area mediante l'imaging di un tallone fluorescente o di un campione di cella.
Verificare che la posizione del laser iSCAT sia approssimativamente al centro dell'immagine e prendere nota della sua posizione per riferimento successivo. Per cambiare la posizione e il campo visivo del campo luminoso e del canale di fluorescenza, spostare le telecamere sul tavolo rispetto agli obiettivi di messa a fuoco. Prepararsi per l'esperimento come descritto nel protocollo di testo.
Ciò include la preparazione delle cellule e del mezzo di microscopia, nonché la cuvetta del campione al microscopio. Assicurarsi che il raggio laser sia bloccato per evitare che le cellule siano direttamente esposte alla luce laser iSCAT. Iniettare circa tre microlitri del campione di cellule preparato leggermente fuori centro nella cuvetta del campione.
Toccare delicatamente la punta della pipetta sul coperchio e iniettare lentamente la soluzione cellulare. Lasciare che le celle si sistemino sul coverslip. Controllare il numero di celle vicine al laser iSCAT.
Se il numero di celle è troppo basso, ripetere questo passaggio fino a quando non è disponibile un numero sufficiente. Se la copertura delle cellule è troppo densa, utilizzare un'iniezione di circa 20 microlitri di mezzo di microscopia aggiuntivo per disperdere le cellule attraverso il coverslip. Utilizzando la fase di traslazione piezoelettrica, spostare il campione lateralmente per posizionare una cella vicino al campo visivo iSCAT.
Assicurarsi che la cella non entri nel campo visivo iSCAT poiché l'esposizione diretta alla luce laser di 445 nanometri potrebbe essere dannosa per la cellula. Sblocca il raggio laser iSCAT e assicurati che la superficie del coverslip sia ancora a fuoco. Racchiudere il tavolo di isolamento per ridurre al minimo la deriva e l'accoppiamento acustico dall'ambiente circostante.
Inizia la misurazione acquisendo immagini dalle telecamere iSCAT, brightfield e fluorescenza. Controllare periodicamente la vitalità della cella e la messa a fuoco del sistema. Qui, il software di microscopio auto-scritto viene utilizzato per visualizzare le immagini della fotocamera.
Qui, l'imaging differenziale viene eseguito in tempo reale sottraendo fotogrammi consecutivi per rendere visibili i legamenti proteici. Ciò si traduce in un'immagine filtrata visibile sullo schermo insieme all'immagine della fotocamera non elaborati. Qui sono riportati i risultati rappresentativi di un esperimento di secrezione cellulare effettuato con iSCAT.
Il video mostra le secrezioni di una cella LAZ nel corso di due minuti. Le immagini iSCAT differenziali a sinistra visualizzano l'assorbimento di singole proteine sul coverglass. Le immagini a campo luminoso e il canale di fluorescenza a destra vengono utilizzati per monitorare la vitalità delle cellule.
Questo istogramma mostra le proteine rilevate e il loro intervallo di contrasto entro quel periodo di tempo di due minuti. I dati sono stati raccolti analizzando singoli eventi di associazione in ogni fotogramma dei dati video iSCAT utilizzando un algoritmo di ricerca di picchi personalizzato. La microscopia ISCAT non è solo un potente strumento di biosensing, ma anche in microscopia, perché consente il rilevamento senza etichette di nano-oggetti in tempo reale.
In particolare, può essere applicato a una varietà di processi come la diffusione e il trasporto di proteine. Grazie alla sua squisita sensibilità allo scattering della luce, iSCAT è in grado di rilevare qualsiasi proteina o entità nel campo visivo. Naturalmente, questo significa anche che la tecnica manca della specificità che la fluorescenza porta con sé, ma per aggirare questo problema, si possono applicare metodi aggiuntivi come la funzionalizzazione superficiale per rilevare specifiche proteine di interesse.
Non dimenticare che lavorare con i laser può essere pericoloso e un'adeguata protezione degli occhi dovrebbe sempre essere indossata quando si assembla e si regola il microscopio. Il rilevamento in tempo reale dei secretomi è molto eccitante e un grande salto nella diagnostica medica, che attualmente richiede molto più tempo ed è molto lontano dalla sensibilità di singole proteine. C'è ancora molto spazio per migliorare le prestazioni del metodo ed estendere le sue applicazioni.
Quindi speriamo che questo video aiuti altri gruppi a unirsi a questo entusiasmante sforzo.
