金ナノ粒子の検出と分光法の文脈で、2004年に初めてiSCATを発表しました。その後の10年間で、ウイルスや小タンパク質などの生体ナノ粒子の検出と追跡のために、この技術をさらに開発しました。技術の本質は、どんなに小さくても、どんな物質物体でも有限の絶滅断面を有するということです。
この手法の主な利点は、ラベルなしの検出です。これは、十分に敏感であれば、単一細胞から分泌されるタンパク質やエキソソームなど、何でも検出できることを意味します。注意しなければならない問題は、散乱背景をどのように扱うかです。
iSCAT顕微鏡の大きな利点は、それが完全に家に建てることができ、既存の商業用顕微鏡に追加することができるということです。これは、蛍光などの他の光学技術と簡単に組み合わせることができることを意味し、これは多くのグループが現在iSCATおよび関連技術を採用している理由の1つです。ここでは、LUZ細胞をモデルシステムとして利用し、個々の分泌タンパク質の検出を示します。
しかし、この方法は、分子レベルでのほぼすべての生物学的プロセスをプローブするためにも適用することができる。安定した顕微鏡を実現するには、減衰した光学表とサンプルステージ用の剛性の大きなブロックから始めます。高い数値開口の目的と、横方向のサンプル翻訳と目的の焦点位置の変更を可能にする翻訳単位を組み込んだ顕微鏡サンプルステージを構築します。
45度の垂直カップリングミラーと50センチメートルの焦点距離一重レンズを使用して、波長445ナノメートルのダイオードレーザーの光を目的の背面焦点面に焦点を合わせます。この広視野レンズは、iSCAT照明源となる目的の前方焦点にコリメートビームを作成します。液浸油の液滴を目的に塗布し、顕微鏡ステージのサンプルプレーンにガラスカバースリップを配置します。
これにより、撮像目的を通して反射するビームが得られます。撮像経路を設定するには、入射ビームに対して45度の角度で、広視野レンズの約10センチメートル後に反射被覆ビームスプリッターを導入します。反射防止コーティングがレーザー光源を指していることを確認します。
レーザーが目的にまっすぐに入らないように、厚いビームスプリッターが重要なビーム変位をもたらすので注意してください。必要に応じて、レーザービームパスをビームスプリッターの前に再調整して、目的を通して正しい伝播を確実にします。サンプルプレーンとカメラがパーフォーカルであることを確認するには、入射ビームパスの広視野レンズの後の5センチメートルの位置に45センチメートルの負の焦点距離の凹型レンズを配置して開始します。
これにより、コリメートされたビームが目的の背面開口に入ります。画面を干渉計の反射アームに配置して、目標を垂直方向に移動して、粗い焦点位置を見つけます。目的は、画面に当たるビームがコリメートされたときに焦点を合わせられます。
粗焦点が完了したら、負の焦点レンズと画面の両方を取り外します。2つ目の50センチメートルの焦点距離一重レンズを追加して、散乱光を焦点を合わせ、反射光をコリメートします。レンズが目的のバック焦点面から50センチメートル配置され、送信されたレーザー光が再びコリメートされるようにします。
iSCAT セットアップアセンブリを完成するには、CMOS カメラを 50 センチメートルの焦点距離レンズから 50 cm 離れた場所に置き、ビームをチップの中央に直接配置します。追加のイメージングチャンネルを設定するには、LED光源の出力を長距離の目標に結合します。LED出力の焦点を合わせ、サンプルに横位置を設定できる、サンプルチャンバの上に機械部品を取り付けます。
上の目標を横方向に移動して、上幅フィールドの目標と下側の iSCAT 目標が共線型になるようにします。これは、低い目標の下に画面を配置し、画面上の送信LEDライトの強度を最大化することによって決定されます。次に、550ナノメートルのショートパス二色鏡を設置し、iSCATレーザー経路から送信されたLED光を分割します。
このビームを、8%の反射、92%の透過性ビームスプリッタを備えた2つのチャネルに分割します。92%のパスは蛍光チャネルで、8パーセントのパスは明視野イメージングに使用されます。5センチメートルの焦点距離の同色性のダブレットレンズを使用して、CMOSカメラに明視野チャネルをイメージします。
5センチメートルの焦点距離の同色性の倍田レンズを使用して、別のCMOSカメラに蛍光チャネルを画像化します。また、600ナノメートルのロングパスフィルタを使用して励起光を遮断します。コンピュータとソフトウェアをセットアップするには、すべてのカメラをコンピュータに接続します。
完全に組み立てられた設定では、CMOSカメラのiSCAT画像を観察し、ガラスカバースリップに残りのほこりや汚れの粒子を見つけることによって、それが焦点であることを確認します。パーティクルの画像が円対称点広がり関数であることを確認します。レーザービームがわずかな角度で顕微鏡の目的に入った場合、点広がり関数は円形を持たない。
これは、45度ミラーのわずかな調整によって、目的への直線結合を確実にすることによって修正することができる。明視野と蛍光チャネルのカメラ画像を比較します。両方が焦点を合わせ、蛍光ビーズまたは細胞サンプルをイメージングして同じ領域を表示します。
iSCATレーザーの位置が画像の中心に近い位置であることを確認し、後で参照できるようにその位置をメモします。明視野と蛍光チャネルの位置と視野を変更するには、焦点を合わせるレンズに対してテーブル上のカメラを動かします。テキスト プロトコルで説明されているように、実験の準備をします。
これには、細胞および顕微鏡検査媒体の調製、ならびに顕微鏡サンプルキュベットが含まれる。細胞が直接iSCATレーザー光にさらされるのを防ぐために、レーザー光が遮断されていることを確認してください。調製したセルサンプルの約3マイクロリットルをサンプルキュベットにわずかに中心から外して注入します。
ピペットチップをカバースリップにそっと触れ、ゆっくりとセル溶液を注入します。セルがカバースリップに落ち着くようにします。iSCATレーザーに近いセルの数を確認します。
セル数が少なすぎる場合は、十分な数が使用可能になるまでこの手順を繰り返します。細胞の被覆が高すぎる場合は、約20マイクロリットルの追加顕微鏡媒体を注入して、カバースリップ全体に細胞を分散させます。圧電変換段階を使用して、サンプルを横に動かして、iSCAT視野に近いセルを配置します。
445ナノメートルのレーザー光への直接暴露は細胞にとって有害である可能性があるため、細胞がiSCAT視野に入らないようにしてください。iSCATレーザービームのブロックを解除し、カバースリップ面が焦点を合わせ続けていることを確認します。周囲からのドリフトと音響結合を最小限に抑えるために、分離テーブルを囲みます。
iSCAT、明視野カメラ、蛍光カメラから画像を取得して測定を開始します。定期的に細胞の生存率とシステムのフォーカスをチェックします。ここでは、カメラ画像を表示するために自己記述顕微鏡ソフトウェアを使用する。
ここで、微分イメージングは、連続したフレームの減算によってリアルタイムに行われ、タンパク質結合を可視化する。これにより、フィルター処理された画像が、生のカメライメージと共に画面に表示されます。iSCATを用いて行った細胞分泌実験の代表的な結果を以下に示す。
ビデオは、2分間にわたってLAZセルの分泌物を示しています。左の微分iSCAT画像は、カバーグラスへの単一のタンパク質の吸収を可視化します。右側の明視野画像と蛍光チャネルは、細胞の生存率を監視するために使用されます。
このヒストグラムは、検出されたタンパク質とそのコントラスト範囲を、その 2 分間の期間内に示しています。データは、カスタムピークシークアルゴリズムを使用して、iSCATビデオデータの各フレーム内の個々のバインディングイベントを分析することによって収集されました。ISCAT顕微鏡は、ナノオブジェクトの標識のない検出をリアルタイムで可能にするため、バイオセンシングだけでなく顕微鏡でも強力なツールです。
特に、タンパク質の拡散や輸送などの様々なプロセスに適用することができる。光散乱に対する絶妙な感度により、iSCATは視野の任意のタンパク質またはエンティティを検出することができます。もちろん、これは蛍光がもたらす特異性を欠いていることを意味しますが、この問題を回避するために、表面官能化のような追加の方法を適用して目的の特定のタンパク質を検出することができます。
レーザーを使用すると危険な作業が可能であり、顕微鏡を組み立てて調整する際には、適切な眼保護を常に着用する必要があります。分泌物のリアルタイム検出は非常にエキサイティングであり、現在ははるかに長い時間を必要とし、単一のタンパク質感受性から非常に遠い医療診断の大きな飛躍です。メソッドのパフォーマンスを向上させ、そのアプリケーションを拡張するための十分な余地がまだあります。
だから私たちは、このビデオは、他のグループがこのエキサイティングな努力に参加するのに役立つことを願っています.
