يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول إنزيمات phosphotransfer بما في ذلك خصوصية الركيزة الإنزيمية وحركية التفاعل. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بجمع سريع لمجموعات بيانات متعددة متسقة للغاية، مما يتيح تحديد كمية قوية إحصائيا لنشاط الإنزيم. إن البرهان المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية لأن اكتشاف التفاعلات على لوحات TLC وتحديد الأنواع المشعة في التفاعلات أسهل بكثير من الشرح.
بالإضافة إلى Astha، فإن الإجراء الذي يوضحه سيكون آسيا بودل، وهي طالبة دراسات عليا أخرى من مختبري. ابدأ هذا البروتوكول مع فرط التعبير غير القابل للانصات من بروتين الموسومة بالهستيدين كما هو موضح في بروتوكول النص. إعداد ملليلتر واحد من راتنج حمض نيتريلواستيك النيكل في عمود الجاذبية لتنقية البروتين.
في اليوم السابق للاستخدام، توازن العمود بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية مع ميليلترين من العازلة التوازن. في اليوم التالي جلب العمود من أربع درجات مئوية إلى درجة حرارة الغرفة قبل تحميل lysate أوضح والسماح لها الوقوف لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات تقريبا. ثم إعادة تعليق بيليه في العازلة تحلل.
Sonicate الخلايا على الجليد لمدة 10 مرات 10 ثانية فترات، والتوقف 30 ثانية بين البقول. توضيح lysate بواسطة الطرد المركزي في 3، 080 مرات ز لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية باستخدام microcentrifuge. إعداد lysate clarified مع وحدات التخزين متساوية من المخزن المؤقت تحلل، ثم تطبيق prepped، clarified lysate إلى العمود وجمع تدفق من خلال.
إعادة تطبيق تدفق lysate clarified إلى العمود وجمع تدفق الثانوية من خلال. ثم غسل العمود مع خمسة ملليلتر من غسل العازلة واحدة وجمع تدفق من خلال. غسل العمود مرة أخرى مع خمسة ملليلتر من غسل العازلة اثنين وجمع تدفق من خلال.
الآن تطبيق مليلتر اثنين من عازلة elution. جمع تدفق من خلال في كسرين من ملليلتر واحد لكل منهما. أثناء تنقية البروتين، إدراج كلوريد المغنيسيوم في مخازن التنقية، تعديل بروتوكول الشركة المصنعة، ضروري للنشاط الأنزيمي.
لتقييم نوعي لتنقية البروتين من قبل SDS-PAGE، تشغيل 20 aliquots ميكرولتر من جميع الكسور العمود على التراص 4٪، 10٪ تشغيل هلام بولياكريلاميد لمدة 60 دقيقة في 170 فولت. وصمة عار هلام مع 0.1٪ Coomassie الأزرق في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس ساعات، هزاز بلطف على الروك benchtop. ثم destain هلام في 40٪ الميثانول-10٪ حمض الخليك الجليدي بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، هزاز على الروك benchtop.
Dialyze الكسر مائل اثنين ضد عازلة غسيل الكلى في نسبة 200:1 باستخدام جهاز غسيل الكلى ملليلتر واحد مع 20 كيلودالون قطع الوزن الجزيئي بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. تحديد تركيز عينة البروتين dialyzed عن طريق قياس الامتصاص في 280 نانومتر واستخدام معامل الانقراض الضرس المحسوب. تخزين 100 ميكرولتر aliquots من عينة البروتين dialyzed في ناقص 80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
قبل إجراء التفاعل، قم بإعداد لوحات الكروماتوغرافيا طبقة رقيقة من السليلوز PEI عن طريق غسلها في المياه الأيونية. ضع اللوحات في غرفة زجاجية مع ماء مقطر مزدوج على عمق حوالي 0.5 سنتيمتر. بعد السماح للمياه بالهجرة إلى أعلى اللوحة، أخرج اللوحات من الحجرة الزجاجية واتركها على رف على مقاعد البدلاء لتجف بين عشية وضحاها.
وضع علامة على اللوحات المجففة على بعد سنتيمترين من حافة واحدة مع قلم رصاص ناعم للإشارة إلى مكان تطبيق العينات على TLC. بالنسبة لعينات ميكرولترتين، ضعي عينات لا تقل عن سنتيمتر واحد. عند التخطيط للتجارب، اترك دائمًا نقطة واحدة على كل لوحة غير مستخدمة لتكون بمثابة ممر فارغ لتحديد كمية العينات.
لإجراء تحليل نشاط الإنزيم، قم بإعداد التفاعلات الفردية باستخدام GAMMA P32 ATP كما هو موضح في بروتوكول النص. إضافة RSH بعد أن تم خلط المكونات الأخرى، كما إضافة RSH إلى المزيج المحتوي على النيوكليوتيد يبدأ مقايسة النشاط الأنزيمية. للسيطرة على التحليل المائي ATP من تلوث نشاط النوى، وتجميع رد فعل 10 ميكرولتر لا تحتوي على البروتين واحتضان ذلك في موازاة ذلك.
بقعة عينات اثنين microliter في T يساوي صفر وفي نهاية التجربة لضمان أن ATP لم يتم تحللها في غياب البروتين. فور إضافة RSH، قم بإزالة اثنين من ميكروليتر وبقعتها على لوحة PEI-cellulose التي تحمل علامة T تساوي عينة دقيقة صفر. احتضان رد الفعل في 37 درجة مئوية، وإزالة اثنين من microliter aliquots في النقاط الزمنية المطلوبة.
بعد جمع جميع aliquots ، قم بإجراء كروماتوغرافيا رقيقة عن طريق ملء غرفة الكروماتوغرافيا مع فوسفات البوتاسيوم أحادية البابس 1.5 مولر إلى عمق 0.5 سنتيمتر. تزج الحافة السفلية من لوحة في المذيبات والسماح للمذيبات إلى الهجرة إلى أعلى لوحة على مدى 90 دقيقة تقريبا. قم بإزالة اللوحة من خزان الكروماتوغرافيا ووضعها على رف تجفيف على مقاعد البدلاء للهواء الجاف بين عشية وضحاها.
بعد أن يجف الطبق، لف اللوحة في فيلم بلاستيكي لتجنب نقل المواد المشعة إلى كاسيت التصوير وتحليلها عن طريق التصوير الآلي. اعرض لوحة PEI-cellulose التي تحتوي على ردود فعل منفصلة على كاسيت فوسفورمامر لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة. بعد التعرض، صورة كاسيت على phosphorimager.
باستخدام برامج التصوير مع واجهة المستخدم الرسومية، رسم المناطق ذات الاهتمام أو ROIs عن طريق تحديد أولا رسم مستطيل، ثم استخدام الماوس لرسم ROIs مستطيلة حول حارة واحدة كاملة و ATP وguanosine-tetraphosphate البقع الواردة داخل هذا الممر. استخدم أوامر التحديد والنسخ واللصق لرسم ROIs متطابقة داخل الممرات الأخرى للتأكد من أن مؤشر الـ ROIs يقيس الإشارة داخل مناطق متطابقة في كل حارة. قم بتضمين ROIs من حارة غير مستخدمة لاستخدامها كفراغات.
باستخدام تحليل ، أدوات ، مدير ROI ، إضافة أوامر من برنامج التصوير ، حدد كل من ROIs رسمها على لوحة PEI - السليلوز. الآن استخدام تحليل، تعيين القياسات، قياس الأوامر لتحديد كثافة الإشارة داخل كل عائد الاستثمار وتصدير القياسات باعتباره spreadsheeet. في جدول البيانات، اطرح قيم عائد الاستثمار فارغة من الإشارات التجريبية.
إن تحويل البيانات إلى النسبة المئوية من الـ guanosine-tetraphosphate synthetized أمر بالغ الأهمية، لأنه يضمن أن مجموعات البيانات التي يتم جمعها في أيام مختلفة مع دفعات مختلفة من البروتين أو مختلف الغاما P32 ATP متسقة ويمكن تجميعها للصرامة الإحصائية. يوضح هذا الكرتون كيفية استخدام المناطق ذات الأهمية لتحديد حارة تحتوي على الإشارة المشعة الكلية في عينة ومكونات ATP المشعة و مناطق تترافوسفات جوانوسين ذات الأهمية. يتم تطبيع إشارات ATP و guanosine tetraphosphate إلى الإشارة الكلية بدلاً من الإبلاغ عن القيم المطلقة لأن خطأ الأنابيب أو اضمحلال الركيزة المشعة يمكن أن يؤثر على الإشارة الكلية في العينة ولكن لا تؤثر على نشاط الإنزيم.
يظهر هنا هو لوحة TLC الفعلية من رد فعل نفذت باستخدام تنقية C.difficile RSH. تفاعل التحكم الذي لا يحتوي على البروتين يسمح بالتكون الكمي من التحلل المائي ATP غير المُخلَف في حين أن حارة فارغة تسمح بدقة تحديد كمية الإشارة. وفي بقع ATP وguanosine-tetraphosphate، ينقل الإنزيم الفوسفات المشع من ركيزة ATP إلى سلائف الناتج المحلي الإجمالي، مما يخلق رابع فوسفات الغانوزين المشع.
وهذا يؤكد أن synthetase من c.difficile هو الانزيم هو مُفتَهَلِ. عن طريق أخذ العينات رد الفعل على فترات، يمكن ملاحظة التقدم. هنا يتم ملاحظة الإشارة الخام في كل نقطة زمنية.
ATP آخذ في التناقص و جوانوسين رباعي الفوسفات آخذ في الازدياد. تظهر هنا البيانات التي تم تسويتها. أشرطة الخطأ أصغر بكثير لأن الحسابات الحسابات التهيئة لأي خطأ pipetting.
أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تكون حذراً من خدش الراتنج على لوحة TLC، لأن هذا يمكن أن تتداخل مع الهجرة المذيبات. هذه تقنية يمكن الوصول إليها للغاية مع تحليل البيانات المباشر الذي يمكن أن يوفر بسرعة تحديد كمي قوي لنشاط الإنزيم. لقد استخدمناه لتأكيد أن كلوستريديوم difficile يجمع بين رهاب الـ (جوانوسين) رباعي الفوسفات، والذي لم يتم الإبلاغ عنه من قبل.
لا تنس أن العمل مع النشاط الإشعاعي يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب اتباع قواعد المؤسسة لتخزين واستخدام المواد المشعة أثناء تنفيذ هذا الإجراء. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة في تخليق رباعي الفوسفات الجانوسين ولكن يمكن أيضا أن تطبق على ردود فعل phosphotransfer الأخرى, بما في ذلك نشاط كيناز البروتين وتوليف diguanylate دوري.
