이 방법은 효소 기판 특이성 및 반응 운동제를 포함하여 인전달 효소에 대한 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 매우 일관된 여러 데이터 세트를 신속하게 수집하여 효소 활성의 통계적으로 강력한 정량화를 가능하게 한다는 것입니다. 이 방법의 시각적 데모는 TLC 플레이트에 대한 반응을 발견하고 반응에서 방사성 종을 정량화하는 것이 설명하는 것보다 훨씬 쉽게 입증되기 때문에 중요합니다.
Astha 이외에, 절차를 보여주는 아시아 Poudel, 내 실험실에서 또 다른 대학원생이 될 것입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 히스티딘 태그 단백질의 유도할 수 없는 과발현으로 이 프로토콜을 시작합니다. 단백질을 정화하기 위해 중력 컬럼에 니켈 니릴로아세산 수지 1밀리리터를 준비합니다.
사용하기 전날, 평형 버퍼의 두 밀리리터와 섭씨 4도에서 하룻밤 컬럼을 평형. 다음 날은 명확한 lysate를로드하기 전에 4섭씨에서 실온으로 기둥을 가져와 약 2 ~ 3 시간 동안 방치하십시오. 그런 다음 리시스 버퍼에서 펠릿을 다시 일시 중지합니다.
10회 10초 간격으로 얼음 에 세포를 초음파 처리하여 펄스 사이에 30초 간 멈췄습니다. 미세 원심 분리기를 사용하여 섭씨 4도에서 30분 동안 3, 080배 g에서 원심분리로 lysate를 명확히 합니다. 동일한 양의 용해 버퍼로 명확히 된 lysate를 준비한 다음, 준비된 명확한 lysate를 열에 적용하고 흐름을 수집합니다.
명확히 된 lysate 흐름을 컬럼에 다시 적용하고 보조 흐름을 수집합니다. 그런 다음 5 밀리리터의 세척 버퍼 1로 컬럼을 씻고 흐름을 수집합니다. 5밀리리터의 워시 버퍼 2로 컬럼을 다시 씻고 흐름을 수집합니다.
이제 용출 버퍼의 두 밀리리터를 적용합니다. 각각 1 밀리리터의 두 분수로 흐름을 수집합니다. 단백질 정화 중에 정제 완충제에 염화물 마그네슘을 포함하면 제조업체의 프로토콜을 수정하는 것이 효소 활성에 필수적입니다.
SDS-PAGE에 의한 단백질 정제를 질적으로 평가하기 위해 모든 컬럼 분획의 20마이크로리터 알리쿼트를 4%스태킹에 실행하고, 170볼트에서 60분 동안 폴리아크릴아미드 젤을 10% 실행합니다. 5시간 동안 실온에서 0.1% 쿠마시 블루로 젤을 더럽히고 벤치탑 로커를 부드럽게 흔들어 보냅니다. 그런 다음 40% 메탄올-10% 빙하 아세트산으로 밤새 실온에서 젤을 데스테인하여 벤치탑 로커에 흔들리고 있습니다.
20킬로달톤의 분자량 컷오프가 섭씨 4도에서 하룻밤 사이에 1밀리리터 투석 장치를 사용하여 투석 버퍼에 대해 200:1 비율로 용출된 분획 2개를 투석합니다. 280 나노미터에서 흡광도를 측정하고 계산된 어금니 소멸 계수를 사용하여 투석 단백질 샘플의 농도를 결정합니다. 투석 단백질 샘플의 100 마이크로리터 알리쿼트를 사용 전까지 영하 80도에서 보관하십시오.
반응을 수행하기 전에, 탈온 화 물에 그들을 세척하여 PEI 셀룰로오스 얇은 층 크로마토그래피 플레이트를 준비합니다. 접시를 이중 증류수가 있는 유리 챔버에 약 0.5cm 깊이로 놓습니다. 물이 접시 의 상단으로 이동 할 수 있도록 한 후, 유리 챔버에서 접시를 가지고 하룻밤 건조 벤치 탑 랙에 둡니다.
말린 플레이트를 부드러운 연필로 한 가장자리에서 2센티미터 떨어진 곳에 표시하여 TLC에 시료가 적용되는 위치를 나타냅니다. 2마이크로리터 샘플의 경우 샘플을 1센티미터 이하로 적용합니다. 실험을 계획할 때는 항상 각 플레이트에 한 자리를 두어 샘플 정량화를 위한 빈 차선역할을 합니다.
효소 활성 분석작업을 수행하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 감마 P32 ATP를 사용하여 개별 반응을 준비한다. 다른 성분이 혼합된 후 RSH를 첨가하고, 뉴클레오티드 함유 믹스에 RSH를 첨가하여 효소 활성 분석서를 개시한다. 핵활성을 오염시키는 ATP 가수분해를 제어하려면 단백질을 함유한 10마이크로리터 반응을 조립하고 병렬로 배양한다.
T에서 2마이크로리터 샘플을 반점0과 실험이 끝날 때 ATP가 단백질이 없는 상태에서 가수분해되지 않았는지 확인합니다. RSH를 첨가한 즉시 2개의 마이크로리터를 제거하고 T가 0분 샘플과 같기 때문에 표지된 PEI 셀룰로오스 플레이트에 반점하십시오. 37°C의 반응에 따라 원하는 시점에서 2마이크로리터 알리쿼트를 제거합니다.
모든 알리쿼트가 수집된 후, 크롬토그래피 챔버를 1.5m의 단백칼륨 인산염을 0.5센티미터 깊이로 채우어 얇은 층 크로마토그래피를 수행한다. 플레이트의 하단 가장자리를 용매에 담그고 용매가 약 90분 동안 플레이트 의 상단으로 이동할 수 있도록 합니다. 크롬 토그래피 탱크에서 접시를 제거하고 밤새 공기 건조 벤치 탑 건조 랙에 배치합니다.
플레이트가 건조한 후, 방사성 물질의 방사성 물질을 이미징 카세트로 옮기지 않도록 플라스틱 필름으로 플레이트를 감싸고 사인방사선에 의해 분석한다. 실온에서 4시간 동안 인광상기 카세트에 분리된 반응을 포함하는 PEI 셀룰로오스 플레이트를 노출한다. 노출 후, 인산화기형기의 카세트를 이미지화합니다.
그래픽 사용자 인터페이스가 있는 이미징 소프트웨어를 사용하여 먼저 사각형 그리기를 선택하여 관심 영역또는 ROI 영역을 그린 다음 마우스를 사용하여 전체 차선과 해당 차선에 포함된 ATP 및 구아노신 테트라포산염 반점 주위에 직사각형 ROI를 그립니다. 선택, 복사 및 붙여넣기 명령을 사용하여 다른 차선 내에서 동일한 ROI를 그려 ROI가 각 차선의 동일한 영역 내에서 신호를 측정하고 있는지 확인합니다. 비무장 차선에서 비무장 차선에서 ROI를 포함하여 공백으로 사용할 수 있습니다.
분석, 도구, ROI 관리자, 이미징 소프트웨어의 추가 명령을 사용하여 PEI 셀룰로오스 플레이트에 그려진 모든 RO를 선택합니다. 이제 분석, 설정 측정, 측정 명령을 사용하여 각 ROI 내의 신호 강도를 정량화하고 측정값을 스프레드쉬에트로 내보냅니다. 스프레드시트에서 빈 ROI 값을 실험 신호에서 빼는 것입니다.
데이터를 구아노신-테트라포산염 합성퍼센트로 변환하는 것은 단백질의 다른 배치 또는 다른 감마 P32 ATP를 사용하여 다른 날에 수집된 데이터 세트가 일관되고 통계적 엄격함을 위해 풀링될 수 있도록 하기 때문에 매우 중요합니다. 이 만화는 관심 있는 지역이 샘플및 방사성 ATP 및 구아노신 테트라포산염 지역에서 총 방사성 신호를 포함하는 차선을 정의하는 데 어떻게 사용되는지 보여줍니다. ATP 및 구아노신 테트라포산염 신호는 방사성 기판의 피펫팅 오차 또는 붕괴가 샘플내의 총 신호에 영향을 줄 수 있으나 효소 활성에 영향을 미치지 않기 때문에 절대 값을 보고하기보다는 총 신호로 정규화된다.
여기에 는 정제된 C.difficile RSH를 사용하여 수행된 반응의 실제 TLC 플레이트가 도시된다. 단백질을 함유하지 않는 대조작용은 비촉매 ATP 가수분해의 정량화를 허용하며, 빈 차선은 정확한 신호 정량화를 가능하게 합니다. ATP와 구아노신 테트라포산염 반점에 있는 효소는 ATP 기판에서 GDP 전구체로 방사성 인산염을 전달하여 방사성 구아노신 테트라포산염을 생성합니다.
이것은 C.difficile에서 putative guanosine tetraphosphate synthetase가 활성 효소이다는 것을 확인합니다. 간격으로 반응을 샘플링함으로써 진행상황을 관찰할 수 있다. 여기서 원시 신호는 매 시점에서 관찰된다.
ATP는 감소하고 구아노신 테트라포산염이 증가하고 있다. 여기에 정규화된 데이터가 표시됩니다. 정규화는 모든 파이펫 팅 오류를 기록하기 때문에 오류 막대가 훨씬 작습니다.
이 절차를 시도하는 동안 용매 마이그레이션을 방해할 수 있으므로 TLC 플레이트의 수지에 긁히지 않도록 주의해야 합니다. 이것은 효소 활성의 강력한 정량화를 신속하게 제공할 수 있는 간단한 데이터 분석을 가진 매우 접근가능한 기술입니다. 우리는 클로스트리듐 difficile 구아노신 테트라포산염을 합성하는 것을 확인하기 위해 그것을 사용했습니다, 이는 이전에 보고된 적이 없다.
방사능으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 방사성 물질의 저장 및 사용에 대한 기관의 규칙을 따라야 합니다. 이 방법은 구아노신 테트라포산염 합성에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 단백질 키나아제 활성 및 순환 diguanylate 합성을 포함한 다른 인트랜스전 반응에도 적용될 수 있다.
