この方法は、酵素基質特異性および反応動態を含むリン酸化酵素に関する重要な質問に答える助けとなる。この手法の主な利点は、非常に一貫性のある複数のデータセットを迅速に収集できるため、酵素活性の統計的に堅牢な定量が可能です。この方法の視覚的なデモンストレーションは、TLCプレートに反応を発見し、反応中の放射性種を定量化することは、説明するよりもはるかに簡単に実証できるため、非常に重要です。
アスタに加えて、この手順を実証するのは、私の研究室のもう一人の大学院生であるアジア・プーデルです。テキストプロトコルに記載されているように、ヒスチジンタグ付きタンパク質の誘導可能な過剰発現でこのプロトコルを開始します。重力カラムにニッケルニトリロ酢酸樹脂を1ミリリットル用意して、タンパク質を精製します。
使用前日、2ミリリットルの平衡バッファーで一晩4度でカラムを平衡化する。翌日、明確化されたライセートをロードする前に、カラムを摂氏4度から室温に戻し、約2〜3時間放置します。次に、リシスバッファー内のペレットを再懸濁します。
氷上の細胞を10秒間隔で10回超音波処理し、パルス間で30秒間一時停止します。マイクロ遠心分離機を用いて摂氏4度で30分間3,080回gの遠心分離により、ライセートを明らかにする。同じ量のリシスバッファーで明確化したライセートを準備し、その後、準備された、明確化されたライセートをカラムに適用し、フロースルーを収集します。
明確化されたライセートフロースルーをカラムに再適用し、二次フロースルーを収集します。その後、5ミリリットルの洗浄バッファー1でカラムを洗浄し、フロースルーを収集します。5ミリリットルの洗浄バッファー2でカラムをもう一度洗い、フロースルーを収集します。
今、溶出バッファーの2ミリリットルを適用します。フロースルーをそれぞれ1ミリリットルの2つの部分で収集します。タンパク質精製の際、精製バッファーに塩化マグネシウムを含めることが、製造業者のプロトコルに対する変更であり、酵素活性に不可欠です。
SDS-PAGEによるタンパク質精製を定性的に評価するには、4%スタッキングで全てのカラム分画の20マイクロリットルのアリコートを実行し、10%は170ボルトで60分間ポリアクリルアミドゲルを実行します。室温で0.1%クマシーブルーでゲルを5時間染色し、ベンチトップロッカーで穏やかに揺れます。その後、ゲルを室温で一晩40%メタノール-10%氷酢酸でデステインし、ベンチトップロッカーで揺れる。
200:1比で透析バッファーに対して溶出した分画2を、摂氏4度で一晩で20キロダルトンの分子量カットオフを有する1ミリリットル透析装置を使用して透析バッファーに対して透析する。280ナノメートルで吸光度を測定し、計算されたモル絶滅係数を使用して、透析タンパク質サンプルの濃度を決定します。透析タンパク質サンプルの100マイクロリットルのアリコートを使用するまでマイナス80°Cで保存します。
反応を行う前に、脱イオン水で洗浄して、薄層クロマトグラフィープレートのPEIセルロースを調製します。プレートをガラスチャンバーに入れ、二重蒸留水を約0.5センチメートルの深さまで入れます。水がプレートの上部に移動することを許可した後、ガラスチャンバーからプレートを持ち出し、ベンチトップラックに残して一晩乾燥させます。
乾燥したプレートを1つの端から2センチメートル離れた場所に柔らかい鉛筆でマークし、サンプルがTLCに適用される場所を示します。2マイクロリットルのサンプルの場合、1センチメートル以上離れたサンプルを適用します。実験を計画する場合は、各プレートに常に1つのスポットを未使用のままにして、サンプル定量用の空白のレーンとして機能させます。
酵素活性アッセイを行うために、テキストプロトコルに記載されているようにγP32 ATPを用いて個々の反応を調製する。ヌクレオチド含有混合物にRSHを添加すると酵素活性アッセイが開始されるように、他の成分が混合された後にRSHを添加する。ヌクレアーゼ活性を汚染することからATP加水分解を制御するには、タンパク質を含みずに10マイクロリットル反応を組み立て、それを並行してインキュベートする。
T等しいゼロで2マイクロリットルのサンプルを見つけ、実験の最後にATPがタンパク質の不在時に加水分解されていないことを確認します。RSHを添加した直後に、2マイクロリットルを取り除き、Tがゼロ分サンプルに等しいようにラベル付きPEIセルロースプレートにスポットを当てる。摂氏37度で反応をインキュベートし、所望の時点で2マイクロリットルのアリコートを取り除く。
すべてのアリコートが収集された後、0.5センチメートルの深さまで1.5モル単塩基性リン酸カリウムでクロマトグラフィーチャンバーを充填することにより、薄層クロマトグラフィーを行います。プレートの底辺を溶媒に浸し、約90分間にわたってプレートの上部に移動させます。クロマトグラフィータンクからプレートを取り出し、ベンチトップの乾燥ラックに置き、一晩空気乾燥します。
プレートが乾燥したら、プラスティックフィルムでプレートを包み込んで、放射性物質を撮像カセットに送り込むのを避け、自動ラジオグラフィーで分析します。分離反応を含むPEIセルロースプレートをリンイメージカセットに室温で4時間露出させます。露光後、リンイメージャー上にカセットを画像化します。
グラフィカルユーザーインターフェースを備えたイメージングソフトウェアを使用して、最初に矩形を描画を選択して目的の領域またはROIを描画し、マウスを使用して1車線全体の周りに長方形のROIを描き、そのレーン内に含まれるATPおよびグアノシン-テトラリン酸スポットを描きます。[選択]、[コピー]、[貼り付け]コマンドを使用して、他のレーン内に同一のROIを描画し、ROI が各レーン内の同一領域内で信号を測定していることを確認します。未使用のレーンの ROI を含めます。
解析、ツール、ROI マネージャ、イメージング ソフトウェアの追加コマンドを使用して、PEI セルロース プレートに描画されたすべての ROI を選択します。解析、測定の設定、測定コマンドを使用して、各ROI内の信号強度を定量化し、測定値を拡散シートとしてエクスポートします。スプレッドシートで、実験信号から空白のROI値を減算します。
異なるタンパク質のバッチまたは異なるガンマP32 ATPで異なる日に収集されたデータセットが一貫しており、統計的な厳格さのためにプールすることができるので、データをグアノシン-テトラリン酸合成率に変換することが重要です。この漫画は、サンプル中の総放射性信号と関心のある成分のATPおよびグアノシンテトラリン酸塩領域を含む車線を定義するために関心のある領域がどのように使用されているかを示しています。ATPおよびグアノシン四リン酸シグナルは、放射性基質のピペット化誤差または崩壊がサンプル中の全シグナルに影響を与える可能性があるが、酵素活性に影響を与えないため、絶対値を報告するのではなく、全信号に正規化される。
ここに示されているのは、精製されたC.difficile RSHを用いて行われる反応の実際のTLCプレートである。タンパク質を含み込んだ制御反応は、非触媒ATP加水分解の定量を可能にし、一方、ブランクレーンは正確な信号定量を可能にする。ATPおよびグアノシン-テトラリン酸塩スポットでは、酵素はATP基質からGDP前駆体に放射性リン酸を移し、放射性グアノシン四リン酸を作り出す。
これは、C.difficile由来のテトラリン酸テトラリン酸酵素が活性酵素であることを確認する。反応を一間隔でサンプリングすることで、進行を観察することができる。ここで生信号は各時点で観察される。
ATPが減少し、グアノシン四リン酸が増加しています。ここに示されているのは、正規化されたデータです。正規化はピペット処理エラーを占めるため、誤差範囲ははるかに小さくなります。
この手順を試みる間、これは溶媒の移動を妨げる可能性がありますので、TLCプレート上の樹脂を傷つけないように注意することが重要です。これは、酵素活性の堅牢な定量を迅速に提供できる、簡単なデータ分析を備えた非常にアクセス可能な手法です。我々は、クロストリジウム・ディフィシルがグアノシン四リン酸を合成することを確認するためにそれを使用しました, これは以前に報告されたことがない.
放射能を扱うことは非常に危険であり、この手順を実行しながら放射性物質の貯蔵と使用に関する機関の規則に従わなければならないことを忘れないでください。この方法は、グアノシンテトラリン酸合成に関する洞察を提供することができますが、タンパク質キナーゼ活性および環状デグアニル酸合成を含む他のホスホトランスファー反応にも適用できます。
