حل هيكل المجال مستقبلات ريان اليود يمكن أن تساعد في فهمنا للآلية الجزيئية للبروتين وظيفة، والعمل المبيدات الحشرية، وتطوير مقاومة المبيدات الحشرية. هذا التدبير يعني استخدام التصوير البلوري بالأشعة السينية للتوضيح الهيكل، الذي يعتبر معيار الذهب لتحديد بنية البروتين في القرار الذري القريب. يكشف هذا الهيكل عالي الدقة لمجال مستقبلات الحشرات ryanodine عن آلية تخواضع القنوات ويوفر نموذجًا مهمًا لتطوير مبيدات حشرية خاصة بالأنواع باستخدام نهج تصميم الأدوية المستندة إلى الهيكل.
عموما، سوف الأفراد الجدد لهذه الطريقة النضال، وذلك لأن بلورات البروتين المحتملين يجب أن يكون بارعا في الكيمياء الحيوية، والفيزياء الحيوية، وعلوم الكمبيوتر، والرياضيات. تبدأ بتضخيم الحمض النووي المقابل للبروتين من الفائدة من تفاعل البوليميراز سلسلة. في نهاية التفاعل، تشغيل كامل 50 ميكرولترات من مزيج رد فعل على هلام agarose 2٪، واستخراج الحمض النووي مع مجموعة استخراج هلام وفقا للبروتوكولات القياسية.
المقبل، linearize الحمض النووي ناقل LIC عن طريق خلط 20 ميكرولترات من الحمض النووي ناقلات مع 6 ميكرولترات من 10X العازلة التفاعل و 4 ميكرولترات من إنزيم تقييد SspI في 30 ميكرولترات من المياه المقطرة مزدوجة. احتضان هذا التفاعل خليط لمدة ثلاث ساعات في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، تشغيل مزيج التفاعل بأكمله على هلام agarose 1٪، تليها استخراج الحمض النووي ناقل خطي مع مجموعة استخراج هلام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
بعد ذلك ، قم بإجراء علاجات بوليمرات الحمض النووي T4 منفصلة على 5 ميكرولترات من الحمض النووي الناقل الخطي وتضخم PCR إدراج الحمض النووي ، وفقا للبروتوكولات القياسية. احتضان لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، تليها 20 دقيقة من الانزيم تنشيط الحرارة في 75 درجة مئوية. تنفيذ التفاعل التلوي الاستنساخ المستقلة الربط من خلال الجمع بين 2 microliters من T4 المعالجة إدراج الحمض النووي مع 2 ميكرولترات من T4 معالجة LIC ناقلات الحمض النووي لاحتضان 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
لتحويل BL21 (DE3)E. الخلايا القولونية مع plasmid المؤتلف، ذوبان 50 ميكرولتر من الخلايا المختصة على الجليد، وإضافة ما يقرب من 1 ميكرولتر من بلاسميد مضمّن إلى الأنبوب. نفض الغبار بلطف الأنبوب مرتين إلى ثلاث مرات لخلط الخلايا والحمض النووي، ووضع أنبوب مرة أخرى على الجليد لمدة 20 دقيقة.
في نهاية الحضانة، صدمة الحرارة الخلايا في 42 درجة مئوية لمدة 40 ثانية، تليها دقيقتين مرة أخرى على الجليد. بعد ذلك، أضف ملليلترًا واحدًا من درجة حرارة الغرفة LB المتوسطة إلى الأنبوب، ووضع الخلايا على شاكر 250 دورة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة تهز، لوحة 150 إلى 200 ميكرولترات من هذا الخليط على لوحات الاختيار، وعكس لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي، ثقافة مستعمرة واحدة في 100 ملليلتر من 2-YT المتوسطة، وتستكمل مع الكناميسين، في حاضنة شاكر في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، تلقيح لتر واحد من 2-YT المتوسطة، تستكمل مع كاناميسين، مع 10 ملليلتر من الثقافة بين عشية وضحاها، واحتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز حتى تصل القراءة OD600 ما يقرب من 0.6. ثم، والحث على الثقافة مع IPTG إلى تركيز النهائي من 0.4 ميليمولار، وتنمو الخلايا لمدة خمس ساعات في 30 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة ، حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، وإعادة تعليق بيليه إلى 10 غرام من البكتيريا لكل 40 ملليلتر من تركيز العازلة تحلل. تعطيل جدران الخلية عن طريق sonication في 65٪ السعة، وثانية واحدة على ثانية واحدة قبالة، لمدة ثماني دقائق. إزالة حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي.
ثم، تصفية عظمى على الرغم من مرشح 22 ميكرومتر، وتحميل الحل في حلقة عينة. لتنقية البروتين الانصهار، حقن السوبر المصفاة من حلقة العينة في عمود النيكل-nitrolotriacetic خمسة ملليلتر على نظام تنقية مع تدرج خطي من 20 إلى 250 إيميدازول ملليلتر. Cleave البروتين الهدف مائل مع بروتياز فيروس حفر التبغ، بنسبة 1 إلى 50، بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، وتنقية خليط تفاعل الانقسام على عمود راتنج amylose، وعمود النيكل nitrolotriacetic، لإزالة العلامة وبروتيز فيروس حفر التبغ.
Dialyze تدفق من خلال العمود من النيكل ونيترولوتارياستيك ضد غسيل الكلى العازلة للحد من تركيز الملح، وتنقية العينة على عمود تبادل الأنيون من قبل تدرج خطي من 20 إلى 500 كلوريد البوتاسيوم ملليمولار في العازلة elution. ثم، تركيز البروتين في مكثف الطرد المركزي. حقن البروتين المركز في سوبرديكس 200 26/600 هلام الترشيح العمود للتحقق من التجانس، وتقييم نقاء البروتين بنسبة 15٪ SDS-PAGE.
لإعداد البروتين للتبلور، ركز عينة البروتين المنقى إلى 10 ملليغرام لكل ملليلتر في مركز الطرد المركزي، وتبادل العازلة لبلورة العازلة قبل تخزين 80 درجة مئوية. لإجراء فحص التبلور، استخدم طريقة نشر بخار الإسقاط الجالس في 295 كلفن، مع عدة مجموعات تبلور، ونظام معالجة سائل آلي في شكل 96 بئرًا. في نهاية الإعداد قطرة، وختم لوحة تبلور 96-جيدا لمنع التبخر، وتمكين من ضبط التوازن من انخفاض البروتين داخل المخزن العازلة.
ضع اللوحات في حاضنة الكريستال عند درجة حرارة 18 درجة مئوية. تحقق من اللوحات بشكل دوري تحت مجهر خفيف لمراقبة تكوين البلورات والنمو. لتمييز بلورات البروتين عن بلورات الملح، أضف ميكرولتر واحد من صبغة بلورات البروتين إلى القطرة المستهدفة، ولاحظ البلورات تحت المجهر بعد ساعة واحدة.
بلورات البروتين سوف تظهر زرقاء. لمزيد من تحسين البلورات، واستخدام ظروف التبلور الإيجابية وطريقة نشر بخار قطرة معلقة في 24-صحن البئر، تليها الحضانة في حاضنة الكريستال في 18 درجة مئوية. لتحديد بنية البروتين، قم بتركيب البلورات على مجهر التبريد تحت مجهر خفيف لتبريد الفلاش في النيتروجين السائل، ووضع البلورات في unibuck للتخزين والنقل.
قبل فحص البلورات في المنزل في التصوير بالأشعة السينية diffractor، وذلك باستخدام وظيفة مركز دليل لتركيب ومركز بلورات. ثم استخدم برنامج الحيود بالأشعة السينية لجمع البيانات. الفهرسة، ودمج وحجم مجموعة البيانات، وذلك باستخدام HKL-2000 جناح، أولا، حدد كاشف، وتحميل مجموعة البيانات.
ثم قم بتنفيذ وظيفة البحث الذروة للعثور على بقع الحيود. قم بفهرسة البقع، وحدد مجموعة المساحة المناسبة، وقم بتنفيذ ذروة التكامل. بعد ذلك، قم بتحجيم مجموعة البيانات.
اضبط نموذج الخطأ و قم بالتحجيم مرة أخرى. حفظ ملف الإخراج سكا. لتحديد البنية باستخدام مجموعة برامج Phenix، قم بإنشاء مشروع جديد.
أولاً، قم بتشغيل Extriage مع ملف sca لحساب عدد النسخ المحتمل لجزيئات البروتين في الوحدة غير المتماثلة. بعد ذلك ، لحل مشكلة المرحلة عن طريق الاستبدال الجزيئي ، قم بتشغيل Phaser ، باستخدام ملف بيانات الحيود ، ملف هيكل القالب مع هوية عالية التسلسل والتشابه الهيكلي كالبروتين المستهدف ، وملف تسلسل البروتين ، للعثور على الحل. تنفيذ السيارات بناء في فينيكس لتوليد النموذج الأولي، وذلك باستخدام ملف الإخراج من Phaser وملف التسلسل من البروتين الهدف.
بناء الهيكل يدويا في كثافة الإلكترون التجريبية المعدلة باستخدام COOT، وصقل باستخدام فينيكس صقل في دورات متكررة. التحقق من صحة النموذج النهائي باستخدام أدوات التحقق من الصحة في فينيكس. في هذه التجربة التمثيلية ، والتطهير من المجال النهائي من الماس العث عث ريان اليود البروتين المستقبل ، كما ثبت ، أسفرت عن شريط واحد في حوالي 21 كيلودالتون من قبل تحليل STS - صفحة.
وأكد حجم elution من عمود الترشيح هلام تنقية مستقبلات ريان يود نهاية الطرفية المجال ليكون مونومر. للتبلور ، كانت الظروف المثلى التي تم في ظلها تشكيل بلورات عالية الجودة على شكل لوحة في وجود 1 هبس الزرس من درجة PH من 7 ، و 1.6 كبريتات الأمونيوم الولير. وكشف تحديد بنية البروتين من مجموعة بيانات الحيود باستخدام البرمجيات كما ثبت عن العثة diamondback ريان اليود مستقبلات نهاية الطرفية المجال الذي يغطي المخلفات 1 إلى 205.
البروتينات مع اضطراب كبير، والمناطق مرنة، أو مع تقارب ضعيفة هي صعبة لبلورة. في هذه السيناريوهات، قد تزيد استراتيجيات هندسة البروتين مثل تقليل الكون السطحي، وتقضم الحلقات، وربط عبر، من احتمال الحصول على بلورات بروتين أفضل. وبالإضافة إلى الكشف عن هياكل بروتينية عالية الدقة، يمكن أيضاً استخدام التصوير البلوري بالأشعة السينية لدراسة تفاعلات البروتين ومبيدات الآفات، التي يمكن أن تساعد في تصميم مبيدات الآفات القائمة على الهيكل.
