리모딘 수용체 도메인의 구조를 해결하면 단백질 기능, 살충제 작용 및 살충제 저항 발달의 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해에 도움이 될 수 있습니다. 이 측정은 거의 원자 분해능에서 단백질 구조 측정을 위한 금본위제로 간주되는 구조 일러스트레이션을 위한 X선 결정학의 사용을 의미합니다. 곤충 리모딘 수용체 도메인의 이러한 고해상도 구조는 채널 게이팅의 메커니즘을 드러내며 구조 기반 약물 설계 접근법을 사용하여 종별 살충제의 개발을 위한 중요한 템플릿을 제공한다.
일반적으로, 이 방법에 새로운 개별은 투쟁할 것입니다, 예비 단백질 결정학자는 생화학, 생물 물리학, 컴퓨터 과학 및 수학에 능숙해야 하기 때문에. 먼저 중합효소 연쇄 반응에 의한 관심 단백질에 대응하는 DNA를 증폭시킴으로써 시작한다. 반응의 끝에서, 2%아가로즈 젤에 반응 믹스의 전체 50 마이크로리터를 실행하고, 표준 프로토콜에 따라 젤 추출 키트로 DNA를 추출한다.
다음으로, 벡터 DNA의 20마이크로리터와 10X 반응 완충제 6마이크로리터, SspI 제한 효소 4개소와 이중 증류수 30마이크로리터를 혼합하여 LIC 벡터 DNA를 선형화한다. 이 반응 혼합물을 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 제조 업체의 지시에 따라 젤 추출 키트와 선형 벡터 DNA의 추출 다음, 1 % 아가로즈 젤에 전체 반응 믹스를 실행합니다.
다음으로, 표준 프로토콜에 따라 선형화된 벡터 DNA및 PCR 증폭 삽입 DNA의 5마이크로리터에 별도의 T4 DNA 폴리머라제 치료를 수행한다. 실온에서 40분 동안 배양하고, 75도에서 효소 열이 20분간 비활성화됩니다. T4 처리된 삽입 DNA의 마이크로리터 2개와 실온에서 10분 동안 배양을 위해 T4 처리된 LIC 벡터 DNA의 마이크로리터 2를 결합하여 결찰 독립적 복제 어닐링 반응을 수행한다.
BL21(DE3)E. Coli 세포를 재조합 플라스미드로 변환하려면 얼음 위에 유능한 세포의 50마이크로리터를 해동하고, 관에 아너드 플라스미드의 약 1 마이크로리터를 첨가한다. 튜브를 2~3회 가볍게 쓸어 세포와 DNA를 섞고 튜브를 얼음에 다시 20분 간 놓습니다.
인큐베이션이 끝나면 세포를 섭씨 42도에서 40초 동안 열 충격을 받은 다음 얼음 위에서 2분 뒤로 다시 가열합니다. 다음으로, 실내 온도 LB 배지 1 밀리리터를 튜브에 넣고, 세포는 섭씨 37도에서 45분 동안 250 RPM 셰이커에 놓습니다. 흔들리는 인큐베이션의 끝에서, 플레이트 150 받는 번째 200 마이크로 리터 선택 플레이트에, 그리고 37 섭씨에서 하룻밤 플레이트를 반전.
다음 날, 하룻밤 37도의 셰이커 인큐베이터에서 카나마이신으로 보충된 2-YT 배지 100밀리리터의 단일 식민지를 문화합니다. 다음 날 아침, 카나마이신으로 보충된 2-YT 배지 1리터를 접종하고, 10밀리리터의 하룻밤 문화를 보충하고, OD600 독서가 약 0.6에 도달할 때까지 37도에서 배양합니다. 이어서, IPTG를 통해 배양을 0.4 밀리머의 최종 농도로 유도하고, 섭씨 30도에서 5시간 동안 세포를 성장시한다.
인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 세포를 수확하고, 리시스 완충제 농도의 40 밀리리터 당 박테리아의 10 그램에 펠릿을 다시 중단. 65%의 진폭으로 세포벽을 방해하고, 1초는 8분 동안 중단됩니다. 원심분리로 세포 이물질을 제거합니다.
그런 다음 22 마이크로미터 필터를 사용하여 상체를 필터링하고 솔루션을 샘플 루프에 로드합니다. 융합 단백질을 정화하기 위해 샘플 루프에서 여과된 상체를 20 내지 250 밀리머 이미다졸의 선형 그라데이션을 가진 정화 시스템에 5밀리리터 니켈-니트로트리아세틱 컬럼에 주입한다. 담배 에칭 바이러스 프로테아제와 함께 eluted 대상 단백질을 cleave, 1-50 비율로, 하룻밤 4섭씨에서, 아밀로스 수지 컬럼에 분열 반응 혼합물을 정화하고, 니켈-니트로트리아제컬 컬럼, 태그 및 담배 에칭 바이러스 프로테아제를 제거한다.
투석 버퍼에 대한 니켈-니트로트리아세아틱 컬럼으로부터의 흐름을 투석하여 염분 농축액을 감소시키고, 용출 완충제에서 20 내지 500밀리알륨의 선형 그라데이션에 의해 음이온 교환 컬럼의 샘플을 정화한다. 그런 다음 단백질을 원심 농축기에 농축합니다. 농축 단백질을 Superdex 200 26/600 젤 여과 컬럼에 주입하여 균질성을 확인하고 단백질의 순도를 15% SDS-PAGE로 평가합니다.
결정화를 위한 단백질을 준비하기 위하여는, 원심 농축기에 밀리리터 당 10 밀리그램에 정제된 단백질 샘플을 농축하고, 80°C의 저장 전에 결정화 완충에 완충 교환을 농축한다. 결정화 스크리닝을 수행하려면 295 켈빈의 착착 낙하 증기 확산 방법을 여러 결정화 키트와 96웰 형식으로 자동 액체 처리 시스템을 사용하십시오. 낙하 설정의 끝에서, 증발을 방지하기 위해 96-잘 결정화 플레이트를 밀봉하고, 저수지 버퍼 내에서 단백질 강하의 평형을 가능하게한다.
플레이트를 크리스탈 인큐베이터에 섭씨 18도에 놓습니다. 경현미경하에서 주기적으로 플레이트를 확인하여 결정 형성과 성장을 모니터링합니다. 단백질 결정을 소금 결정과 구별하려면 단백질 결정 염료 1마이크로리터를 목표 낙하에 넣고 1시간 후에 현미경으로 결정을 관찰합니다.
단백질 결정은 파란색으로 나타납니다. 결정을 더욱 최적화하려면 24웰 플레이트에 양성 결정화 조건과 매달려 있는 낙하 증기 확산 방법을 사용하고, 그 다음에 는 18°C의 크리스탈 인큐베이터에서 배양합니다. 단백질 구조를 결정하기 위해 액체 질소의 플래시 냉각을 위한 가벼운 현미경 아래에 저온루프에 결정을 장착하고, 저장 및 운송을 위해 결정을 유니벅에 놓습니다.
수동 센터링 기능을 사용하여 크리스탈을 장착하고 중앙에 설치하여 내부 X선 디머액터로 크리스탈을 사전 검사합니다. 그런 다음 X 선 회절 소프트웨어를 사용하여 데이터를 수집합니다. HKL-2000 제품군을 사용하여 데이터 집합을 인덱싱, 통합 및 확장하려면 먼저 검출기를 선택하고 데이터 집합을 로드합니다.
그런 다음 피크 검색 기능을 수행하여 회절 지점을 찾습니다. 스팟을 인덱스하고, 올바른 공간 그룹을 선택하고, 최대 통합을 수행합니다. 다음으로 데이터 집합을 확장합니다.
오류 모델을 조정하고 다시 배율을 조정합니다. 출력 sca 파일을 저장합니다. Phenix 소프트웨어 제품군을 사용하여 구조를 확인하려면 새 프로젝트를 만듭니다.
먼저, 비대칭 단위에서 가능한 복사 수의 단백질 분자를 계산하기 위해 sca 파일로 대칭을 실행한다. 다음으로, 분자 대체에 의한 위상 문제를 해결하기 위하여, 페이서를 실행하여, 회절 데이터 파일을 이용하여, 표적 단백질과 같은 고서열 정체성 및 구조적 유사성을 가진 템플릿 구조 파일, 및 단백질 서열 파일, 해결책을 찾아내다. 페이서의 출력 파일과 대상 단백질의 서열 파일을 사용하여 Phenix에서 자동 빌드를 수행하여 초기 모델을 생성합니다.
COOT를 사용하여 수정된 실험 전자 밀도로 구조를 수동으로 구축하고 반복 사이클에서 페닉스 정제를 사용하여 정제합니다. Phenix의 유효성 검사 도구를 사용하여 최종 모델의 유효성을 검사합니다. 본 대표적인 실험에서, 다이아몬드백 나방 라리오딘 수용체 단백질의 최종 단말 도메인의 정제는, 입증된 바와 같이, STS-PAGE 분석에 의해 약 21킬로톤에서 단일 대역을 산출하였다.
겔 여과 컬럼으로부터의 용출 부피는 정제된 리야노딘 수용체 말단 도메인을 단량체로 확인하였다. 결정화를 위해 고품질 판모양 결정이 형성된 가장 최적의 조건은 pH 7의 1개의 어금니 헤페와 1.6개의 어금니암암모늄황산염이 존재했다. 입증된 바와 같이 소프트웨어를 활용한 회절 데이터 세트에서 단백질 구조의 결정은 잔류물 1에서 205까지 를 커버하는 다이아몬드백 나방 라야노딘 수용체 말단 도메인을 드러냈다.
큰 무질서, 유연한 지역, 또는 약한 친화력을 가진 단백질은 결정화하기 어렵습니다. 이러한 시나리오에서 표면 엔트로피 감소, 루프 트런션 및 교차 연결과 같은 단백질 엔지니어링 전략은 더 나은 단백질 결정을 얻을 가능성을 증가시킬 수 있습니다. 고해상도 단백질 구조를 밝히는 것 외에도 X선 결정학은 구조 기반 살충제 설계에 도움이 될 수 있는 단백질-살충제 상호 작용을 연구하는 데 사용될 수 있습니다.
