Resolver a estrutura do domínio do receptor de ryanodo pode ajudar com a compreensão do mecanismo molecular da função proteica, ação de inseticidas e desenvolvimento de resistência a inseticidas. Esta medida implica o uso de cristalografia de raios-X para ilustração da estrutura, que é considerada um padrão-ouro para determinação da estrutura proteica em resolução quase atômica. Esta estrutura de alta resolução do domínio do receptor de ryanodo de insetos revela o mecanismo de gating de canal e fornece um modelo importante para o desenvolvimento de inseticidas específicos de espécies usando abordagens de design de drogas baseadas em estrutura.
Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão, porque os cristalógrafos de proteínas em potencial devem ser proficientes em bioquímica, biofísica, ciência da computação e matemática. Comece amplificando o DNA correspondente à proteína de interesse pela reação em cadeia de polimerase. No final da reação, execute todos os 50 microliters de mistura de reação em um gel de 2% de agarose, e extraia o DNA com um kit de extração de gel de acordo com os protocolos padrão.
Em seguida, linearize o DNA vetorial LIC misturando 20 microliters do DNA vetorial com 6 microliters de tampão de reação 10X e 4 microliters de enzima de restrição de SiI em 30 microliters de água dupla destilada. Incubar esta mistura de reação por três horas a 37 graus Celsius. No final da incubação, execute toda a mistura de reação em um gel de 1% de agarose, seguido pela extração do DNA vetorial linearizado com um kit de extração de gel de acordo com as instruções do fabricante.
Em seguida, realize tratamentos separados de polimerase de DNA T4 em 5 microliters do DNA vetorial linearizado e o DNA de inserção amplificada do PCR, de acordo com os protocolos padrão. Incubar por 40 minutos em temperatura ambiente, seguido de 20 minutos de inativação de calor enzimante a 75 graus Celsius. Realize a reação de ressarcação de clonagem independente da ligadura combinando 2 microlitadores do DNA de inserção t4 tratado com 2 microliters do DNA vetorial LIC tratado T4 para uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente.
Para transformar as células BL21(DE3)E. Coli com o plasmídeo recombinante, descongelar 50 microliters de células competentes no gelo, e adicionar aproximadamente 1 microliter do plasmídeo realado ao tubo. Gire suavemente o tubo duas a três vezes para misturar as células e o DNA, e coloque o tubo de volta no gelo por 20 minutos.
No final da incubação, o calor choca as células a 42 graus Celsius por 40 segundos, seguido de dois minutos de volta ao gelo. Em seguida, adicione um mililitro de temperatura ambiente lb médio ao tubo, e coloque as células em um agitador de 250 RPM por 45 minutos a 37 graus Celsius. No final da incubação de agitação, placa de 150 a 200 microliters desta mistura em placas de seleção, e inverta as placas durante a noite a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, a cultura uma única colônia em 100 mililitros de meio 2-YT, suplementada com kanamicina, em uma incubadora shaker a 37 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, inocular um litro de meio 2-YT, suplementado com kanamicina, com 10 mililitros de cultura durante a noite, e incubar a 37 graus Celsius com agitação até que a leitura de OD600 atinja aproximadamente 0,6. Em seguida, induzir a cultura com IPTG a uma concentração final de 0,4 milimililar, e cultivar as células por cinco horas a 30 graus Celsius.
Ao final da incubação, colde as células por centrifugação e suspenda a pelota para 10 gramas de bactérias por 40 mililitros de concentração tampão de lise. Interrompa as paredes celulares por sônica em uma amplitude de 65%, e um segundo em um segundo de folga, por oito minutos. Remova os detritos celulares por centrifugação.
Em seguida, filtre o supernatante através de um filtro de 22 micrômetros e carregue a solução em um loop de amostra. Para purificar a proteína de fusão, injete o supernanato filtrado do laço amostral em uma coluna de níquel-nitrolotriactic de cinco mililitros em um sistema de purificação com um gradiente linear de 20 a 250 milimidazol. Corte a proteína alvo elucida com protease do vírus da etch do tabaco, em uma proporção de 1 a 50, durante a noite a 4 graus Celsius, e purifique a mistura de reação de decote em uma coluna de resina amilose, e uma coluna de níquel-nitrolotriacético, para remover a etiqueta e o vírus da etch do tabaco protease.
Diálise do fluxo da coluna níquel-nitrolotriactica contra o tampão de diálise para reduzir a concentração de sal e purifique a amostra em uma coluna de troca de ânion por um gradiente linear de 20 a 500 mililitros de potássio no tampão de eluição. Então, concentre a proteína em um concentrador centrífuga. Injete a proteína concentrada em uma coluna de filtragem de gel Superdex 200 26/600 para verificar a homogeneidade e avaliar a pureza da proteína em 15% de SDS-PAGE.
Para preparar a proteína para cristalização, concentre a amostra de proteína purificada em 10 miligramas por mililitro no concentrador centrífugo e troque o tampão para o tampão de cristalização antes do armazenamento de 80 graus Celsius. Para realizar a triagem de cristalização, use o método de difusão de vapor de gota sentado em 295 Kelvin, com vários kits de cristalização, e um sistema automatizado de manuseio líquido em um formato de 96 poços. No final do ajuste de queda, sele a placa de cristalização de 96 poços para evitar a evaporação, e para permitir o equilíbrio da gota de proteína dentro do tampão do reservatório.
Coloque as placas em uma incubadora de cristal a 18 graus Celsius. Verifique periodicamente as placas sob um microscópio leve para monitorar a formação e o crescimento do cristal. Para diferenciar os cristais proteicos dos cristais de sal, adicione um microliter de corante de cristal proteico à gota alvo, e observe os cristais sob o microscópio após uma hora.
Os cristais de proteína parecerão azuis. Para otimizar ainda mais os cristais, use as condições positivas de cristalização e o método de difusão de vapor de gota suspensa em placas de 24 poços, seguido de incubação na incubadora de cristais a 18 graus Celsius. Para determinar a estrutura proteica, monte os cristais em um crioloop sob um microscópio leve para resfriamento de flash em nitrogênio líquido, e coloque os cristais em um unbuck para armazenamento e transporte.
Pré-tela os cristais em um difrator de raios-X interno, usando a função de centralização manual para montar e centralizar os cristais. Em seguida, use o software de difração de raios-X para coletar os dados. Para indexar, integrar e dimensionar o conjunto de dados, usando o conjunto de dados HKL-2000, primeiro, selecione o detector e carregue o conjunto de dados.
Em seguida, realize a função de busca de pico para encontrar os pontos de difração. Indexe as manchas, selecione o grupo espacial certo e realize a integração máxima. Em seguida, dimensione o conjunto de dados.
Ajuste o modelo de erro e dimensione novamente. Salve o arquivo de sca de saída. Para determinar a estrutura usando o pacote de software Phenix, crie um novo projeto.
Primeiro, execute Extriage com o arquivo de sca para calcular o possível número de cópia de moléculas de proteína na unidade assimétrica. Em seguida, para resolver o problema de fase por substituição molecular, execute Phaser, usando o arquivo de dados de difração, o arquivo de estrutura de modelo com identidade de alta sequência e similaridade estrutural como a proteína alvo, e o arquivo de sequência de proteínas, para encontrar a solução. Execute a construção automática em Phenix para gerar o modelo inicial, usando o arquivo de saída do Phaser e o arquivo de sequência da proteína alvo.
Construa manualmente a estrutura na densidade experimental modificada de elétrons usando COOT, e refine usando refinar Phenix em ciclos iterativos. Validar o modelo final utilizando as ferramentas de validação em Phenix. Neste experimento representativo, a purificação do domínio terminal final da proteína receptor de mariposa diamondback, como demonstrado, rendeu uma única banda a cerca de 21 kilodaltons pela análise STS-PAGE.
O volume de elução da coluna de filtragem de gel confirmou que o domínio do receptor de ryanodo purificado para ser um monômero. Para a cristalização, as condições mais ideais sob as quais cristais em forma de placa de alta qualidade foram formados foi na presença de 1 HEPES molar de um pH de 7, e 1,6 sulfato de amônio molar. Determinação da estrutura proteica a partir do conjunto de dados de difração utilizando softwares como demonstrado revelou o domínio final do receptor de mariposa diamondback ryanodine cobrindo resíduos de 1 a 205.
Proteínas com grande desordem, regiões flexíveis ou com afinidades fracas são desafiadoras para cristalizar. Nesses cenários, estratégias de engenharia de proteínas, como redução da entropia superficial, truncação de loop e ligação cruzada, podem aumentar a probabilidade de obter melhores cristais proteicos. Além de revelar estruturas proteicas de alta resolução, a cristalografia de raios-X também pode ser usada para estudar interações proteína-pesticidas, o que poderia ajudar no projeto de pesticidas baseados em estrutura.
