Resolver la estructura del dominio del receptor de ryanodina puede ayudar a nuestra comprensión del mecanismo molecular de la función proteica, la acción de insecticidas y el desarrollo de la resistencia a los insecticidas. Esta medida implica el uso de cristalografía de rayos X para la ilustración de la estructura, que se considera un estándar de oro para la determinación de la estructura proteica a una resolución casi atómica. Esta estructura de alta resolución del dominio del receptor de ryanodina de insectos revela el mecanismo de medición de canales y proporciona una plantilla importante para el desarrollo de insecticidas específicos de especies utilizando enfoques de diseño de fármacos basados en estructuras.
Generalmente, los individuos nuevos en este método lucharán, porque los futuros cristalógrafos de proteínas deben ser competentes en bioquímica, biofísica, ciencias de la computación y matemáticas. Comience por amplificar el ADN correspondiente a la proteína de interés por reacción en cadena de la polimerasa. Al final de la reacción, ejecutar los 50 microlitros enteros de mezcla de reacción en un gel de 2% agarosa, y extraer el ADN con un kit de extracción de gel de acuerdo con los protocolos estándar.
A continuación, linealice el ADN vectorial LIC mezclando 20 microlitros del ADN vectorial con 6 microlitros de tampón de reacción 10X y 4 microlitros de enzima de restricción SspI en 30 microlitros de agua doble destilada. Incubar esta mezcla de reacción durante tres horas a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, ejecute toda la mezcla de reacción en un gel de 1% de agarosa, seguido de la extracción del ADN vectorial linealizado con un kit de extracción de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
A continuación, realice tratamientos separados de la polimerasa del ADN T4 en 5 microlitros del ADN vectorial linealizado y el ADN de inserción amplificado PCR, de acuerdo con los protocolos estándar. Incubar durante 40 minutos a temperatura ambiente, seguido de 20 minutos de inactivación del calor enzimático a 75 grados centígrados. Realice la reacción de recocido de clonación independiente de la ligadura combinando 2 microlitros del ADN de inserción tratado T4 con 2 microlitros del ADN vectorial LIC tratado T4 para una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente.
Para transformar las células BL21(DE3)E. Coli con el plásmido recombinante, descongelar 50 microlitros de células competentes en hielo, y añadir aproximadamente 1 microlitro del plásmido recocido al tubo. Mueva suavemente el tubo dos o tres veces para mezclar las células y el ADN, y coloque el tubo de nuevo sobre hielo durante 20 minutos.
Al final de la incubación, impacta el calor de las células a 42 grados Celsius durante 40 segundos, seguido de dos minutos de nuevo sobre hielo. A continuación, agregue un mililitro de medio LB a temperatura ambiente al tubo, y coloque las células en un agitador de 250 RPM durante 45 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación del temblor, placa 150 a 200 microlitros de esta mezcla en placas de selección, e invertir las placas durante la noche a 37 grados centígrados.
Al día siguiente, cultivar una sola colonia en 100 mililitros de medio 2-YT, complementado con kanamicina, en una incubadora de coctelera a 37 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, inocular un litro de medio 2-YT, complementado con kanamicina, con 10 mililitros de cultivo nocturno, e incubar a 37 grados celsius con temblor hasta que la lectura OD600 alcanza aproximadamente 0.6. Luego, inducir el cultivo con IPTG a una concentración final de 0,4 milimolar, y crecer las células durante cinco horas a 30 grados centígrados.
Al final de la incubación, cosechar las células por centrifugación, y volver a suspender el pellet a 10 gramos de bacterias por cada 40 mililitros de concentración de tampón de la lysis. Interrumpe las paredes celulares por sonicación a una amplitud del 65%, y un segundo en un segundo de descuento, durante ocho minutos. Retire los restos celulares por centrifugación.
A continuación, filtre el sobrenadante a través de un filtro de 22 micrómetros y cargue la solución en un bucle de muestra. Para purificar la proteína de fusión, inyecte el sobrenadante filtrado del lazo de la muestra en una columna de níquel-nitrolotriacético de cinco mililitros en un sistema de purificación con un gradiente lineal de 20 a 250 imidazol mililolar. Cortar la proteína diana elutada con la proteasa del virus de la proteína de color de tabaco, en una proporción de 1 a 50, durante la noche a 4 grados Celsius, y purificar la mezcla de reacción de escisión en una columna de resina de amilosa, y una columna de níquel-nitrolotriacético, para eliminar la etiqueta y la proteasa del virus de tabaco etch.
Dialifear el flujo a través de la columna níquel-nitrolotriática contra el tampón de diálisis para reducir la concentración de sal, y purificar la muestra en una columna de intercambio de aniones por un gradiente lineal de cloruro de potasio de 20 a 500 mililitrolares en el tampón de elución. Luego, concentra la proteína en un concentrador centrífugo. Inyecte la proteína concentrada en una columna de filtración de gel Superdex 200 26/600 para comprobar la homogeneidad y evalúe la pureza de la proteína en un 15%SDS-PAGE.
Para preparar la proteína para la cristalización, concentre la muestra de proteína purificada en 10 miligramos por mililitro en el concentrador centrífugo, y el intercambio de tampón a tampón de cristalización antes de un almacenamiento de 80 grados Centígrados. Para realizar el cribado de cristalización, utilice el método de difusión de vapor de gota sentada a 295 Kelvin, con varios kits de cristalización, y un sistema automatizado de manipulación de líquidos en un formato de 96 pozos. Al final del ajuste de caída, selle la placa de cristalización de 96 pocillos para evitar la evaporación y para permitir el equilibrio de la gota de proteína dentro del tampón del depósito.
Coloque las placas en una incubadora de cristal a 18 grados centígrados. Revise las placas periódicamente bajo un microscopio de luz para monitorear la formación y el crecimiento del cristal. Para diferenciar los cristales de proteína de los cristales de sal, agregue un microlitro de colorante de proteína cristalina a la gota objetivo, y observe los cristales bajo el microscopio después de una hora.
Los cristales proteicos aparecerán azules. Para optimizar aún más los cristales, utilice las condiciones positivas de cristalización y el método de difusión de vapor colgante en placas de 24 pocillos, seguido de incubación en la incubadora de cristales a 18 grados centígrados. Para determinar la estructura proteica, monte los cristales en una crioolopo bajo un microscopio de luz para la refrigeración del flash en nitrógeno líquido, y coloque los cristales en un unibuck para su almacenamiento y transporte.
Preseleccione los cristales en un difusor de rayos X interno, utilizando la función de centrado manual para montar y centrar los cristales. A continuación, utilice el software de difracción de rayos X para recopilar los datos. Para indexar, integrar y escalar el conjunto de datos, utilizando el conjunto HKL-2000, seleccione primero el detector y cargue el conjunto de datos.
A continuación, lleve a cabo la función de búsqueda de picos para encontrar los puntos de difracción. Indexe los puntos, seleccione el grupo de espacio correcto y realice la integración de picos. A continuación, escale el conjunto de datos.
Ajuste el modelo de error y escale de nuevo. Guarde el archivo sca de salida. Para determinar la estructura mediante el paquete de software Phenix, cree un nuevo proyecto.
En primer lugar, ejecute Extriage con el archivo sca para calcular el posible número de copias de moléculas de proteína en la unidad asimétrica. A continuación, para resolver el problema de fase mediante reemplazo molecular, ejecute Phaser, utilizando el archivo de datos de difracción, el archivo de estructura de plantilla con identidad de alta secuencia y similitud estructural como la proteína de destino, y el archivo de secuencia de proteínas, para encontrar la solución. Realice la compilación automática en Phoenix para generar el modelo inicial, utilizando el archivo de salida de Phaser y el archivo de secuencia de la proteína de destino.
Construir manualmente la estructura en la densidad de electrones experimentales modificados utilizando COOT, y refinar usando Phenix refinar en ciclos iterativos. Valide el modelo final utilizando las herramientas de validación de Phoenix. En este experimento representativo, la purificación del dominio terminal final de la proteína receptora de ryanodina de polilla de diamante, como se demostró, produjo una sola banda de aproximadamente 21 kilodaltons por análisis STS-PAGE.
El volumen de elución de la columna de filtración de gel confirmó que el dominio terminal final del receptor de ryanodina purificado era un monómero. Para la cristalización, las condiciones más óptimas bajo las cuales se formaron cristales en forma de placa de alta calidad fueron en presencia de 1 HEPES molar de un pH de 7, y 1,6 sulfato de amonio molar. La determinación de la estructura proteica a partir del conjunto de datos de difracción utilizando softwares como se ha demostrado reveló el dominio terminal final del receptor de ryanodina de polilla diamondback que abarca residuos 1 a 205.
Las proteínas con gran desorden, regiones flexibles o con afnos débiles son difíciles de cristalizar. En estos escenarios, las estrategias de ingeniería de proteínas como la reducción de la entropía superficial, el truncamiento del bucle y la reticulación pueden aumentar la probabilidad de obtener mejores cristales proteicos. Además de revelar estructuras proteicas de alta resolución, la cristalografía de rayos X también se puede utilizar para estudiar las interacciones proteína-pesticida, lo que podría ayudar con el diseño de pesticidas basados en la estructura.
